Name: Combler linterface bio-électronique avec Biofabrication (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: Découvrez une technique de biofabrication pour créer des films biocompatibles par électrodéposition de polysaccharides réactifs. Cette méthode permet de fonctionnaliser les films avec des protéines et des cellules pour des applications en laboratoire sur puce.

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Nous reconnaissons le financement de DTRA pour le soutien de ce manuscrit et de l&#39;ONR, DTRA, et la NSF pour le soutien partielle de la recherche sous-jacente.

<ol><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding%2C+semi-permeable+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li>
<li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li>
<li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li>
<li>Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li>
<li>Wu, L. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li>
<li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol%5BTitle%5D)+AND+%22bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li>
<li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li>
<li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-coated+wires%3A+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li>
<li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+with+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li>
<li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiba+Benjamin%2C+D+%22Renewable+and+Sustainable+Polymers%22">Renewable and Sustainable Polymers</a>. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).</li>
<li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li>
<li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%22dual+mode%22+actuation+in+chitosan%2Fpolyaniline%2Fcarbon+nanotube+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li>
<li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li>
<li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li>
<li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li>
<li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li>
<li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li>
<li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li>
<li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+A%22%5BJournal%5D)">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li>
<li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li>
</ol>

La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par l&#39;Agence américaine de défense des États réduction de la menace.

Nos procédures de démontrer l&#39;électrodéposition et la fonctionnalisation des films en biopolymère, un processus que nous appelons biofabrication. Grâce à fonctionnalisation avec des cellules et des biomolécules on crée des surfaces biologiques capables d&#39;interagir les uns avec les autres et l&#39;électrode d&#39;adressage sont assemblés sur. La première étape, l&#39;électrodéposition, a lieu à travers l&#39;auto-assemblage a déclenché des biopolymères, de l&#39;alginate et de chitosane dans nos études, en réponse à un signal électrique. Comme indiqué précédemment un gradient de pH est généré qui peut être commandé par la densité de courant et le temps de dépôt, fournir un contrôle supplémentaire sur les dimensions des films et des propriétés 6,17. Nous avons trouvé qu&#39;une variété de densité de courant et les combinaisons de temps de dépôt peut être utilisé pour les électrodes indiquées dans le tableau 1. Bien que l&#39;utilisation d&#39;autres électrodes est possible, des ajustements à la procédure serait nécessaire. En comparaison avec d&#39;autres techniques de formation d&#39;un film sur le processus de electrodeposition est simple, rapide et réactif,. Il n&#39;y a pas besoin d&#39;un vaste répertoire de matériel coûteux et des préparations laborieuses. Surtout, le processus peut résister à des écarts mineurs expérimentales et peut être facilement commencé plus si un problème survient. Le chitosane est capable de répondre à un gradient de pH cathodique élevé en raison de propriétés fonctionnelles importantes qui lui sont conférées par une teneur élevée des amines primaires. À un pH élevé (supérieur à son pKa de 6,3 ~) les amines sont déprotoné et le chitosane devient insoluble, ce qui permet la formation du film. Après dépôt, les films resteront attachés à l&#39;électrode. Toutefois, la capacité existe pour les décoller si vous le souhaitez. Les films reste stable aussi longtemps que le pH de la solution ne chute pas en dessous du pKa. Solutions acides protoner les amines et les répulsions électrostatiques ultérieures gonfler le gel jusqu&#39;à ce qu&#39;il se dissout 18. Autrement dit, le processus de montage / démontage est réversible à la demande et allows pour l&#39;enlèvement des films déposés et la réutilisation des électrodes. Idéalement, la gamme de pH à laquelle la transition sol-gel a lieu est proche de celui dans lequel les composants les plus biologiques fonctionner de manière optimale. Cela rend le processus idéal pour la conservation de la fonctionnalité lors de l&#39;assemblage 6. Formation d&#39;un film d&#39;alginate est facilitée par l&#39;électrolyse anodique de l&#39;eau ainsi que la présence de carbonate de calcium 7. Le pH faible localisée à l&#39;anode solubilise le carbonate de calcium conduisant à des cations calcium libération. Ces ions sont chélaté par l&#39;alginate, formant un réseau réticulé sur la surface d&#39;électrode. Des films d&#39;alginate sont notamment réversible par compétition pour des ions calcium à partir de composés chélatants tels que l&#39;EDTA ou du citrate, qui peuvent être utilisés pour dissoudre les films, permettant la réutilisation des électrodes sous-jacentes. Ainsi, les films d&#39;alginate sont relativement fragiles lorsqu&#39;ils sont soumis à des conditions physiologiques, car les ions calcium sont facilement scavenged de la matrice de gel, ce qui affaiblit sa structure et la promotion du film délamination ou redissolution. Pour surmonter cette limitation, nous avons inclus une étape d&#39;incubation pour le film en 1 M CaCl 2 à renforcer le gel. En outre, nous recommandons que la solution d&#39;incubation du film (milieux cellulaires, etc) être complétée par CaCl 2 à une concentration de 500 uM-3 mM. La procédure deuxième grande est la fonctionnalisation du film déposé avec les composants biologiques. Ceci peut être réalisé de deux façons, la première étant de conjugaison électrochimique, une stratégie qui permet de montage rapide et réactif, avec des protéines de contrôle du territoire exceptionnelle de 10. Cependant, fonctionnalisation de cette manière est limitée par la diffusion de Cl - ions à travers le film à l&#39;électrode ainsi que la diffusion de HOCl, l&#39;réactive générée intermédiaire, retourner dans la solution. La capacité des molécules électrochimiquement actifs afin de transmettreà travers le film permet pour la transduction de signaux chimiques et biologiques dans le facile à lire des signaux électriques 15. Nous avons montré la tyrosinase médiée couplage comme une deuxième stratégie pour la fonctionnalisation enzyme au chitosane, démontré par liaison covalente AI-2 synthase. Cette stratégie permet au processus de fonctionnalisation d&#39;être contrôlée et sélective - dépend d&#39;un réactif spécifique, la tyrosinase, qui agit de façon discriminatoire sur les protéines contenant un tag tyrosine 9. Nous montrons l&#39;utilité et la biocompatibilité des systèmes multi-adresses en reproduisant les voies naturelles sur une puce. D&#39;abord, nous avons organisé deux populations cellulaires (ie &quot;expéditeurs&quot; et &quot;récepteurs&quot;) à des adresses distinctes, et a montré que leur interaction entre les électrodes adjacentes pour fournir AI-2 et de générer une réponse de fluorescence. Ce concept a également été démontrée par Cheng et al. dans une puce 14 microfluidique. Nous avons également imité l&#39;interaction, mais plutôt utiliséune enzyme pour synthétiser IA-2 pour la livraison. De cette manière, une voie de synthèse intracellulaire, AI-2 de synthèse, a été reproduit par le biais biofabrication et fonctionnait beaucoup comme il le ferait dans une solution. Dans les deux cas, l&#39;assemblage de plusieurs adresses présente le défi d&#39;éviter la non-spécifiques de liaison entre les adresses parce que chaque solution de dépôt doit être présenté à la matrice d&#39;électrodes ensemble, même si électrodéposition est uniquement destiné à une seule adresse. Le lavage doux et en profondeur peut révoquer la majorité de la solution résiduelle de non-biaisées électrodes; l&#39;utilisation de l&#39;écoulement dans les canaux microfluidiques peut réduire encore davantage la non-spécificité. En particulier pour l&#39;biofabrication adjacente de chitosane et des adresses d&#39;alginate, il est recommandé le dépôt du film de chitosan première suite de cela avec les étapes biofonctionnalisation, et après cela, l&#39;alginate de dépôt électrolytique. Bien que nous n&#39;avons pas fait ici, nous avons découvert que le blocage du film chitosane avec des protéines inertes (comme milk, BSA, etc) diminue fortement non-spécifiques de liaison de molécules indésirables à la surface aminée de chitosane. Nous avons trouvé une utilité dans l&#39;établissement électrodes à motifs, on retrouve souvent dans les dispositifs BioMEMS, comme les «Blueprints» pour un arrangement complexe de cellules et des biomolécules. Les utilisations de chitosane électrodéposé dans les dispositifs bioMEMS peut aller bien au-delà des exemples cités ici 19. Chitosan peut être déposée sur différentes géométries microscopique, tels que dans des microcanaux et sur ​​des surfaces non planes 20,15. Les films peuvent également être modifiées avec d&#39;autres polymères et une variété de protéines, l&#39;ADN, les nanoparticules, et d&#39;oxydo-réduction des molécules actives pour 21,22,23 de nouvelles propriétés. Dans les dispositifs BioMEMS, films de chitosane ont été utilisés pour la livraison de drogue, la détection de molécules redox et petite, la biocatalyse, et les études de cellules 20,23,24,25. De même, l&#39;alginate est largement utilisé comme une matrice de cellules-piège et a été explorée pour le confinement fluidique réversible depopulations de cellules et dans le film-immunoanalyse 26,27,28. Des films composites pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire ont été fabriqués en utilisant électrodéposition alginate, avec des composants tels que l&#39;hydroxyapatite pour implants orthopédiques 29. Dans nos manifestations de biofabrication, nous avons montré à la fois les interactions entre les composantes biologiques et à travers l&#39;interface bio-électronique pour être également applicable, ce qui met en arriver à la perspective de l&#39;intégration de toutes les variétés d&#39;interactions pour une performance sophistiquée dans la transmission du signal sur la puce. En conséquence, biofabrication peut faciliter la fabrication de dispositifs à une réduction des &quot;tailles minimales métrages&quot; en tant que suite directe à l&#39;évolution rapide de la microfabrication, comme souvent motivés par l&#39;électronique grand public. C&#39;est, next-génération d&#39;appareils pourrait en fait inclure des composants biologiques labiles qui offrent ensemble exquis de la nature et les capacités de reconnaissance sur une longueur encore plus petit scales plus artificielles systèmes. Nous envisageons à court terme des applications dans l&#39;instrumentation analytique, les capteurs environnementaux, et même biocompatibles implantables.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la composante </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Alimentation </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Trois potentiostat électrode </td><td> CH Instruments </td><td> Potentiostat / galvanostatique 600D </td></tr><tr><td> RE-5B Électrode de référence Ag / AgCl avec connecteur flexible </td><td> BASi </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Plaquette de silicium revêtu d&#39;or, 500um Si, Cr 12nm, 120nm Au, SiO 2 pour l&#39;isolation </td><td> fabriqués sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;oxyde d&#39;indium étain lame de verre enduite, rectangulaire, 8-12 ohms résister à </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Feuille de platine / feuille (0,002 in) </td><td> Chemetals Surepure </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim Line Clips 2 Alligator &quot; </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Banana Patch Cord Plug- </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Kit SYLGARD 184 élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 De Fischer </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope Fluorescecence </td><td> Olympe </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens standard </td><td> Olympe </td><td> version 1.3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Électrodéposition et l&#39;équipement de visualisation de fluorescence. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Chitosan, de poids moléculaire moyen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique, ARISTAR. ACS, NF, FCC année </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium, Solution. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> L&#39;acide alginique, sel de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM précipité Carbonate de calcium, des particules 70nm </td><td> Spécialité Minerals Inc </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Chitosan et réactifs solution d&#39;alginate. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le chlorure de calcium, dihydrate </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium, certifié Cristallin ACS </td><td> Fischer Scientifique </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique, anhydre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique anhydre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Autres composants de la solution et les réactifs tampons. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société / Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La glucose oxydase d&#39;Aspergillus Niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> La tyrosinase de champignon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> Bouillon LB, Miller (granulé) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-synthase» (HGLPT) </td><td> Lab stock 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 cellules de type sauvage </td><td> Lab Disponible 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET- <em&gt; DsRed - kan cellules r </td><td> Lab Disponible 30 </td><td></td></tr><tr><td> FluoroSphères: diamètre 1 micron, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (et-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight anticorps kit de marquage, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Enzymes Tableau 4., De cellules et de réactifs de fonctionnalisation d&#39;autres.

combler l&#39;interface bio-électronique avec biofabrication

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Les progrès de la technologie de la promesse de laboratoire-sur-une-puce de révolutionner la recherche et la médecine par une baisse des coûts, une meilleure sensibilité, la portabilité et un débit plus élevé. L&#39;incorporation de composants biologiques biologiques sur les systèmes microélectromécaniques (BioMEMS) a montré un grand potentiel pour atteindre ces objectifs. Microfabriqués puces électroniques permettent échelle micrométrique caractéristiques ainsi que une connexion électrique pour la détection et d&#39;actionnement. Fonctionnelles des composants biologiques donner au système la capacité pour la détection spécifique des analytes, des fonctions enzymatiques, et de cellules entières capacités. Procédés de microfabrication standard et bio-analytiques techniques ont été utilisées avec succès depuis des décennies dans les industries de l&#39;informatique et biologique, respectivement. Leur combinaison et d&#39;interface dans un environnement de laboratoire-sur-une-puce, cependant, fait naître de nouveaux défis. Il est un appel à des techniques qui peuvent construire une interface entre l&#39;électrode et Compon biologiqueent qui est doux et facile à fabriquer et le motif. Biofabrication, décrit ici, est une telle approche qui a montré de grandes promesses pour sa facilité-à-assembler l&#39;incorporation de composants biologiques avec une polyvalence dans les fonctions sur la puce qui sont activées. Biofabrication utilise des matériaux biologiques et les mécanismes biologiques (auto-assemblage, l&#39;assemblage enzymatique) pour bottom-up assemblage hiérarchique. Alors que nos laboratoires ont démontré ces concepts dans de nombreux formats 1,2,3, ici, nous démontrons le processus d&#39;assemblage basée sur électrodéposition suivie par plusieurs applications de signal basés sur des interactions. Le processus d&#39;assemblage se compose de l&#39;électrodéposition de films polymères biocompatibles stimuli-sensibles sur des électrodes et leur fonctionnalisation ultérieure avec des composants biologiques comme l&#39;ADN, les enzymes, ou des cellules vivantes 4,5. Électrodéposition tire parti du gradient de pH créée à la surface d&#39;une électrode polarisée provenant de l&#39;électrolysede l&#39;eau 6,7,. Le chitosane et l&#39;alginate sont stimuli-sensibles polymères biologiques qui peuvent être déclenchés à s&#39;auto-assembler en films d&#39;hydrogel imposées en réponse à des signaux électriques 8. L&#39;épaisseur de ces hydrogels est déterminée par la mesure dans laquelle le gradient de pH s&#39;étend de l&#39;électrode. Ceci peut être modifié en utilisant différentes densités de courant et les temps de dépôt 6,7. Ce protocole décrire comment les films sont déposés chitosane et fonctionnalisé par liaison covalente des composants biologiques à des groupes amine primaires présents abondantes sur le film à travers soit méthodes enzymatiques ou électrochimique 9,10. Films d&#39;alginate et de leur piégeage de cellules vivantes seront également abordés 11. Enfin, l&#39;utilité de biofabrication est démontrée par des exemples de l&#39;interaction fondée sur le signal, y compris les produits chimiques-électrique, la cellule à cellule, et aussi la transmission du signal enzyme-à-cellule. Tant le électrodépositionet la fonctionnalisation peut être réalisée dans des conditions proches des conditions physiologiques, sans la nécessité pour les réactifs et épargner ainsi les composantes biologiques labiles à partir des conditions très dures. En outre, à la fois le chitosane et l&#39;alginate ont été longtemps utilisées à des fins pertinentes biologiquement 12,13. Dans l&#39;ensemble, biofabrication, une technique rapide qui peut être tout simplement exécutée sur un établi, peut être utilisé pour créer des motifs de l&#39;échelle du micron fonctionnelles des composants biologiques sur des électrodes et peut être utilisé pour une variété de lab-on-a-chip applications.

Cet article décrit une approche biofabrication: dépôt de stimuli-sensibles polysaccharides en présence d&#39;électrodes biaisées pour créer des films biocompatibles qui peuvent être fonctionnalisés avec des cellules ou des protéines. Nous démontrons une stratégie de paillasse pour la génération des films ainsi que leurs utilisations de base pour créer des surfaces interactives pour biofonctionnalisés lab-on-a-chip applications.

Combler l&#39;interface bio-électronique avec Biofabrication

Les progrès de la technologie des laboratoires sur puce promettent de révolutionner tant la recherche que la médecine grâce à la réduction des coûts, une meilleure sensibilité, la portabilité et...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déposer électriquement des films biopolymériques et de les fonctionnaliser avec des composants biologiques tels que des protéines et des cellules. Le dépôt électrochimique s'obtient en exploitant la variation de pH qui se produit localement au niveau d'une électrode polarisée, en combinaison avec une solution de polysaccharide sensible au pH. Après avoir choisi une stratégie de dépôt cathodique ou anodique, l'électrode est polarisée afin d'induire une transition sol-gel, générant ainsi un film mince dont le motif est défini par la géométrie de l'électrode.En outre, des composants biologiques tels que des protéines et des cellules peuvent être introduits tout au long du processus de dépôt des électrodes. Afin de fonctionnaliser biologiquement le film, des résultats sont obtenus qui montrent que les composants biologiques sont localisés dans les films, comme le révèlent des images de fluorescence. De plus, ces composants sont fonctionnels et capables d'interagir avec leur environnement, comme le démontre la détection électrochimique de l'activité enzymatique et l'utilisation de la réponse de cellules rapporteuses.La biofabrication offre une boîte à outils innovante pour construire l'interface entre la biologie et l'électronique. Nous pensons que ses principaux avantages résident dans sa simplicité et sa capacité à s'assembler dans des conditions proches des conditions physiologiques. La biologie maîtrise la fabrication à l'échelle nanométrique grâce à l'auto-assemblage et à des moyens enzymatiques. En exploitant ces capacités, nous contournons des méthodes de synthèse complexes, dangereuses et longues utilisées par d'autres techniques d'assemblage.Notre équipe collaborative a eu l'idée de concevoir une interface de dispositif BioD en utilisant des matériaux et des mécanismes biologiques lorsque nous avons observé que leurs cerfs-volants pouvaient être déposés par électrode. Le kitan est un polysaccharide formant un film sensible au pH, capable de reconnaître les signaux électriques imposés par un dispositif et de se déposer sous forme de film mince. Dès que nous avons constaté que le kitan pouvait être déposé par électrode, nous avons compris que nous pouvions accéder à un ensemble plus vaste d'outils issus de la biochimie et de la biologie moléculaire pour construire une interface de dispositif BioD.L'application d'une telle technique s'étend aux dispositifs de type laboratoire-sur-puce où des composants biologiques fonctionnels sont nécessaires, car ils offrent un moyen économique et simple de localiser ces composants sur une électrode, où ils peuvent rester viables. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car un film biofabriqué peut être délicat et facilement endommagé. Il convient donc d'être prudent afin de ne pas être trop vigoureux lors du lavage ou de la manipulation du film.Étant donné que le film pourrait être facilement perturbé. Toutefois, un avantage est que les électrodes peuvent être réutilisées, car le film est facilement retiré. Pour commencer ce protocole, reliez une alimentation électrique aux électrodes fabriquées sur mesure à l’aide de câbles de raccordement munis de pinces crocodile.Une lame de verre recouverte d'oxyde d'indium-étain, ou ITO, servira d'anode ou d'électrode de travail, tandis qu'une feuille de platine fera office de cathode ou d'électrode auxiliaire. Positionnez les électrodes de sorte que la surface de l'ITO destinée à être fonctionnalisée soit opposée à l'électrode auxiliaire, soit verticalement pour être plongée dans la solution, soit horizontalement, afin que la solution puisse être contenue à la surface. Ensuite, préparez une solution de dépôt d'alginate en mélangeant 1 % d'alginate et 0,5 % de carbonate de calcium dans de l'eau distillée, puis stérilisez le mélange à l'autoclave. Puis, marquez l'alginate de manière fluorescente à l'aide de Fluor Spheres en mélangeant et en vortexant.Ceci permettra l'imagerie par fluorescence du film obtenu. Après stérilisation à l'autoclave, plonger les deux électrodes dans la solution de dépôt préparée et appliquer une densité de courant constante de trois ampères par mètre carré pendant deux minutes. La tension variera entre deux et trois volts. Au bout de deux minutes, déconnecter l'électrode et éliminer la solution contenant les dépôts non adhérents. Rincer délicatement le film avec du chlorure de sodium pour éliminer l'alginate en excès.Incuber brièvement le film dans du chlorure de calcium 0,1 M pour renforcer le gel. Ensuite, incuber le film dans la solution de stockage souhaitée. Procéder à l'imagerie du film par microscopie de fluorescence avant la co-dépôt.Faites croître une culture cellulaire donneuse de signal et une culture cellulaire receveuse de signal conformément au protocole écrit accompagnant cette vidéo. Préparez ensuite une solution de dépôt d'alginate et de carbonate de calcium. Mélangez la solution avec chaque culture cellulaire selon un rapport de un pour un, afin d'obtenir une concentration finale de 1 % d'alginate et de 0,5 % de carbonate de calcium, les cellules étant diluées à environ la moitié de leur densité de culture.Utilisez une lame de verre comportant deux électrodes en oxyde d'indium-étain (ITO) délimitées par un puits en silane de polydiméthyle et une électrode contre en platine. Connectez une électrode ITO et l'électrode en platine à une alimentation électrique. Comme précédemment, immergez les électrodes dans la solution de dépôt contenant les cellules réceptrices.Régler l'alimentation électrique sur un courant constant à une densité de trois ampères par mètre carré, où la dimension de la surface est définie par l'électrode unique sur laquelle se produira le dépôt. Appliquer le courant pendant deux minutes afin de permettre la codéposition des cellules dans la matrice d'alginate. Rincer le film avec du chlorure de sodium comme précédemment, puis inverser la connexion antic sur l'électrode ITO adjacente.Répétez la procédure de dépôt, mais cette fois, introduisez la solution contenant les cellules donneuses. Incubez la puce à deux électrodes contenant les cellules co-déposées et l'arginate de calcium pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius dans du chlorure de sodium tamponné au phosphate.Supplémenté avec un milieu LB à 10 % et un millimolaire de chlorure de calcium. Après incubation, imagez la puce à l’aide d’un microscope à fluorescence pour commencer le dépôt de l’électrode de chitosane. Connectez l’alimentation électrique aux électrodes.Enflammer les pinces crocodile. Une puce de silicium revêtue d'or servira de cathode et une feuille de platine servira d'anode. Positionner la surface de l'électrode d'or de manière à ce qu'elle dépose l'électrode opposée comme précédemment.Préparez une solution de sable Kato en mélangeant des flocons de sable Kato dans de l'eau et en ajoutant lentement de l'acide chlorhydrique deux molaire pour dissoudre les polysaccharides. En suivant la procédure mentionnée dans le texte, la solution de sable Kato peut être marquée de manière fluorescente afin d'observer par microscopie à fluorescence le film déposé sur l'électrode. Ensuite, placez les électrodes dans la solution kaizan en immergeant complètement la zone destinée au dépôt.Pendant deux minutes, appliquez un courant constant calculé à une densité de quatre ampères par mètre carré, en fonction de la surface de l'électrode de travail. Dans ce cas, un courant de 16 microampères est appliqué à une électrode d'or de quatre millimètres carrés ; la tension décalera dans une plage de deux à trois volts après rinçage de l'électrode avec de l'eau déionisée afin d'éliminer l'excès de chitosane. Passez ensuite à l'imagerie du film à l'aide d'un microscope à fluorescence, en déposant conjointement chitosane et glucose oxydase à partir d'une solution à une densité de courant de quatre ampères par mètre carré sur une électrode structurée.Suivant la procédure de dépôt d'électrode en chitosane, un film de kaizan piégeant la glucose oxydase sera généré. Fixer l'électrode traitée à un système à trois électrodes en tant qu'électrode de travail, un fil de platine en tant qu'électrode auxiliaire et un argent/argent chlorure en tant qu'électrode de référence, puis plonger les électrodes dans une solution tampon phosphate contenant du chlorure de sodium. Conjuguer électrochimiquement la protéine au film Kazam en appliquant une tension constante pendant 60 secondes à l'aide de la chronoampérométrie après la conjugaison.Placer la puce dans un tampon phosphate et laver pendant 10 minutes sur un agitateur orbital afin d'éliminer tout chlorure de sodium non réactif et toute glucose oxydase non conjuguée. Réinstaller le système à trois électrodes et plonger dans une solution de glucose à cinq millimolaire. Ensuite, régler les paramètres souhaités pour la voltammétrie cyclique afin de balayer le potentiel dans le sens positif jusqu'à 0,7 volt.Retirez les électrodes de la solution de glucose et rincez-les avec du tampon phosphate. Ensuite, placez les électrodes dans un bécher de 10 millilitres contenant huit millilitres de tampon phosphate sur une plaque d'agitation magnétique biaisée. Appliquez une tension de 0,6 volt sur la puce fonctionnalisée GOX pour qu'elle serve d'électrode de travail.Après avoir réglé les paramètres souhaités, enregistrez un signal de référence. Ajoutez des aliquotes de glucose au tampon afin d'augmenter la concentration en glucose de quatre millimolaire par aliquote. Dans cette expérience, des aliquotes de 400 microlitres de glucose à 80 millimolaire sont ajoutées au tampon. Corréléz le signal électrique à chaque concentration de glucose afin d'élaborer une courbe standard. Pour réaliser la fonctionnalisation des protéines, utilisez une lame de verre comportant une électrode en or et une électrode ITO adjacentes, contenues dans A-P-D-M-S.Appliquez une polarisation à l'électrode en or avec un potentiel cathodique afin de déposer électrochimiquement le tizen, comme indiqué précédemment. Après avoir rincé le film, ajoutez une solution de synthase de l'auto-inducteur deux marquée par un fluorophore bleu, complétée par de la tyrosinase. Incubez pendant une heure à température ambiante.Rincez le film avec du PBS comme précédemment, appliquez un potentiel anodique à l'électrode ITO immergée dans une solution de dépôt d'alginate contenant les cellules réceptrices. Poursuivez avec les mêmes étapes décrites dans le codepôt de populations cellulaires dans l'alginate afin de générer le signal transmis de manière enzymatique. Après avoir rincé les films, ajoutez une solution de cinq micromolaire, SAH et PBS supplémentée avec 10 % de milieu LB et un millimolaire.Le chlorure de calcium recouvre les électrodes afin d'éviter l'évaporation de la solution et est incubé toute la nuit à 37 degrés Celsius. Cela permettra une réponse des cellules réceptrices en générant une protéine fluorescente rouge DS red. Des électrodes adjacentes peuvent être observées en microscopie à fluorescence en ajustant les filtres pour capter la fluorescence bleue du synthonase inducteur ainsi que la fluorescence rouge exprimée par les cellules réceptrices réquisitionnées. Des signaux électriques imposés peuvent créer des microenvironnements localisés près de la surface d'une électrode, et ces stimuli peuvent déclencher l'auto-assemblage de polysaccharides tels que l'alginate et le razan, qui se déposent sous forme de film hydrogel sur la surface de l'électrode.Étant donné que cette transition sol-gel se produit à la surface de l'électrode, le film résultant est électrolocalisé avec une géométrie correspondant au motif de l'électrode. En utilisant l'alginate, des populations cellulaires distinctes ont été co-déposées à des adresses séparées. La preuve de leur adressage électrode est observée lors de l'interaction entre la population cellulaire émettrice et la population cellulaire réceptrice.La molécule auto-inductrice deux diffuse à partir des cellules émettrices et est captée par les cellules réceptrices, entraînant l'expression de la protéine fluorescente DS rouge. Ici, une fluorescence rouge est observée uniquement à l'électrode où les cellules réceptrices sont localisées. Inversement, l'enzyme biosensible, la glucose oxydase, permet la détection du glucose par une réaction enzymatique produisant du peroxyde d'hydrogène, qui peut ensuite être oxydé électrochimiquement pour générer un courant de sortie.Ainsi, un signal chimique peut être transduit en un signal électrique. Ce graphique montre que les films dans lesquels Geo X a été chimiquement conjugué produisent un signal antic fort en présence de glucose, contrairement aux films ne contenant pas Geo X. Ces résultats indiquent que Geo X peut être assemblé sur un film zam déposé et peut conserver son activité catalytique. En outre, une augmentation par paliers du courant otique est produite en réponse à une concentration croissante de glucose.La courbe standard présentée montre également que les augmentations progressives ont suivi une évolution quasi linéaire en fonction de la quantité de glucose ajoutée. Ces résultats indiquent que l'enzyme conserve également sa sensibilité après conjugaison au film Razza. Comme illustré ici, la I deux synthase comprend une étiquette Penta tyrosine. La tyrosinase agit sur l'étiquette tyrosine en oxydant les groupes phénol des résidus en o-quinones, qui se lient ensuite de manière covalente aux amines de Kazam. Des preuves de la fonctionnalisation du film Kazam par l'assemblage de la I deux synthase via la tyrosinase sont observées sur cette image de fluorescence, montrant un film kaza sur or, où la I deux synthase fonctionnalisée a été marquée en bleu par fluorescence. Étant donné qu'une I deux synthase produit de l'I deux à partir du substrat SAH de la même manière que les cellules émettrices, sa proximité avec les cellules réceptrices recrutées en présence de SAH provoque également une réponse fluorescente de ces dernières, caractérisée par l'expression de ds.La fluorescence rouge des cellules réceptrices démontre à nouveau l'interaction entre les adresses en raison de la diffusion de l'AI-2 de l'une à l'autre, et indique en outre que les 10 enzymes immobilisées sur le tizène conservent leur activité une fois liées de manière covalente. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déposer électriquement des films de polysaccharides et de les fonctionnaliser à l’aide de diverses techniques. Nous avons démontré la polyvalence de ces étapes de fonctionnalisation, ce qui nous permet de travailler avec une multitude de composants biologiques lors de tests ultérieurs.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que quelques minutes afin de produire des motifs de film bien définis sur lesquels des composants biologiques peuvent être greffés avec précision. Ainsi, nous sommes en mesure de générer très facilement des surfaces biologiquement structurées et actives sur des électrodes désignées, le tout réalisé de manière organisée tout en permettant d'obtenir des interactions biologiques complexes. Après cette procédure, la créativité peut être exploitée à la fois dans la conception du réseau électrochimique et dans le choix des composants biologiques afin d'atteindre l'interaction souhaitée.Notre espoir est que les outils de biofabrication permettront de rapprocher deux domaines très différents, la biotechnologie et la microélectronique, chacun ayant révolutionné notre vie de manière individuelle. En associant ces deux domaines, nous pensons pouvoir créer de nouvelles solutions à certains des problèmes les plus urgents de la société. Par exemple, nous imaginons que la biofabrication pourrait offrir des méthodes simples et polyvalentes pour de nouveaux modes de détection, destinés aux soins de proximité, au diagnostic des maladies ainsi qu’à la détection de menaces biologiques et chimiques.Un exemple à portée étendue pourrait être qu'un stent artériel de prochaine génération serait également capable de surveiller votre profil métabolique tout en maintenant votre artère ouverte.

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