Name: Des cultures dexplants neuraux de Xenopus laevis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Apprenez à cultiver des explants neuronaux de Xenopus laevis pour l'analyse d'imagerie à haute résolution. Cette méthode permet d'étudier la dynamique cytosquelettique des cônes de croissance par microscopie à fluorescence.

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Les auteurs tiennent à remercier Bob Freeman pour la formation et le laboratoire de Kirschner pour l&#39;utilisation de la facilité de grenouille, et des membres du laboratoire Vactor Van de soutien. Nous remercions le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School de l&#39;aide pour la microscopie optique pour les images de la figure 1. Ce travail a été financé par le texte suivant: NRSA NIH bourse et les NIH K99 bourse à LAL, Basic Science Partnership financement ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) à l&#39;AEF, et les NIH RO1 NS035909 de DVV

Remarque: Nous décrivons les étapes décrites dans les deux premières sections seulement en bref, que des protocoles d&#39;excellentes avec des informations détaillées ont été publiées ailleurs qui se concentrent plus spécifiquement sur ​​ces mesures (par exemple 8-12). En outre, le protocole général de travailler avec les neurones spinaux Xenopus dans la culture de cellules vivantes a déjà été publié dans un article détaillé méthodes 8. Nous recommandons vivement revoir cet article comme un complément à cette vidéo, même si ici on ne fournir suffisamment d&#39;informations pour effectuer avec succès et dépanner la dissection du tube neural et le protocole de placage à l&#39;étape 3. 1. Fécondation In Vitro œufs de Xenopus <ol><li> Obtenir des œufs de grenouilles femelles qui ont été injectés avec la gonadotrophine chorionique (400 unités / grenouille) 12-18 heures avant la collecte des œufs. Ramassez les œufs dans une solution 1X Marc Ringer modifiée (MMR) (0,1 M de NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM de CaCl 2, 5,0 mM d&#39;HEPES, pH 7,4) 9. </li><li> Féconder les oeufs in vitro avec des testicules hachés, comme décrit précédemment 9. </li><li> Après au moins 20 minutes, retirez embryon gelée manteau en incubant embryons en cystéine 2% ROR 1X (ajustée à pH 7,8 avec NaOH) pendant 3-5 min. Laver avec 0,1 X MMR (ou 0,1 x MBS (modification Saline Barth, recette 1X: 88 mM NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 mM de CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,8)) 3 embryons à 5 fois, et garder à température ambiante jusqu&#39;à ce que les injections, ou le cas échéant, les embryons lieu à 14-18 ° C pour ralentir le développement. </li></ol> 2. La micro-injection de l&#39;ARN Remarque: si nous utilisons l&#39;injection d&#39;ARN ici, ces techniques ne sont pas limités à l&#39;ARN et de l&#39;ADN, des protéines ou des acides nucléiques modifiés pour la manipulation génétique peuvent également être utilisés et ont été décrits précédemment 12. <ol><li> Avant d&#39;expérimentation, ARN pour l&#39;étiquetage des structures du cytosquelette ou d&#39;autres are transcrit à partir de matrices d&#39;ADN linéarisées en utilisant le kit mMessage mMachine (Ambion). ARNm nécessitent une coiffe en 5 &#39;et en 3&#39; de queue de polyadénylation, de promouvoir la traduction et prévenir la dégradation de l&#39;embryon. pCS2 + est un vecteur couramment utilisé à cette fin, et le kit de transcription comprend un analogue de cap au cours de la réaction de synthèse. Nous remettre en suspension dans l&#39;ARNm transcrit sans nucléase ddH 2 0, à une concentration stock entre 500 et 2.000 ng / ul, suivie d&#39;un stockage rapide à -80 ° C. Avant l&#39;injection, diluer l&#39;ARN dans ddH 2 0 à la concentration appropriée pour l&#39;injection. Étant donné que seul un petit volume seront injectées dans des embryons, la remise en suspension dans du tampon n&#39;est pas nécessaire. Notre concentration d&#39;injection final est généralement de 50 à 200 pg / nl, en fonction de la construction, et nous avons l&#39;habitude va injecter jusqu&#39;à 4 nl par embryon, bien que de nombreux laboratoires traditionnellement injecter jusqu&#39;à 10 nl, ce qui représente environ 1% du volume total des un embryon. ARN peut être toxique à fortes doses, et la dose par genres embryonlly varie de 10 pg à 1 ng, bien que jusqu&#39;à 5 ng peut être toléré en fonction de la gène particulier et de la pureté. Cependant, pour la localisation des protéines d&#39;imagerie, le niveau le plus bas possible devrait être injecté pour éviter la sur-expression des artefacts. ARN pour EB1-GFP dans ce protocole est utilisé au montant final de 250 pg par embryon. </li><li> Préparer aiguilles d&#39;injection capillaire en tirant avec une aiguille de traction 9, à un diamètre de pointe de ~ 0,2 um. Avec une Sutter P-87 extracteur, nous utilisons les paramètres suivants: chaleur 644, traction 125, vitesse 70, temps de 250, mais ces paramètres diffèrent en fonction de la machine et doit être réajusté après avoir changé le filament (nous utilisons actuellement de 2,5 mm filament carré qui est de 2,5 mm de large). Sous un microscope, briser pointe de l&#39;aiguille avec une pince à un angle de générer une forme plume-like. Il existe d&#39;autres méthodes pour briser et le remplissage des aiguilles d&#39;injection (par exemple 11,12), mais nous remplissons l&#39;aiguille avec de l&#39;ARN en plaçant une petite goutte (0,5 - 1 pl) à l&#39;extrémité arrière de laaiguille. Pour micro-injection dans des embryons, il ya un certain nombre de systèmes d&#39;injection disponibles dans le commerce, deux des plus courantes étant le Pico-injecteur (Medical Systems), et le Nanoject (Drummond Scientific) (voir 11 pour plus d&#39;informations). Nous utilisons le Medical Systems PLI-100 Pico-injecteur, qui utilise du gaz comprimé pendant une période de temps définie numériquement afin de livrer des volumes nanolitre cohérentes. Volume d&#39;injection doit être calibré pour chaque micropipette nouveau en utilisant un micromètre, et le temps d&#39;injection doit être ajustée pour obtenir la quantité désirée de l&#39;ARN injecté. </li><li> Lieu fécondé embryons au 1 - à 4-cell étape dans un plat en plastique contenant 5% de Ficoll à 0,1 X MMR. Maintien en place de l&#39;embryon avec des pinces, ou placer dans une plate-forme de support (une maille plastique, avec une grille de ~ 1 mm, collée au fond du récipient avec la pâte à modeler ou de la cire dentaire), injecter dans le volume désiré blastomères animaux (voir l&#39;étape 2,1 Pour plus de détails concernant les volumes d&#39;injection). Distribuer dans plusieurs loctions tout au long de l&#39;embryon, au moins une injection dans chacun des blastomères animaux, pour obtenir une répartition plus uniforme (par exemple, pour un embryon au stade de 4 cellules, nous avons généralement injecter 1-2 fois dans chaque blastomère, alors que dans un stade 2-cellules embryon, on injecte 2-4 fois dans chaque blastomère). Un autre avantage de l&#39;attente jusqu&#39;à ce que le stade 2-4 cellules est de vous assurer que l&#39;embryon a commencé à s&#39;attacher normalement. Toutefois, si le temps est de l&#39;essence, vous pouvez commencer à l&#39;étape 1-cellule, avec peu de différence dans le résultat final autre que plus d&#39;embryons devant être injectée. Embryons à un stade plus âgés peuvent aussi être utilisés, ce qui est particulièrement utile si des types cellulaires spécifiques sont ciblés pour l&#39;injection, mais que nous préférons généralement une expression plus large, nous injectons dans les jeunes embryons de réduire le besoin d&#39;injections plus nombreux. </li><li> Transfert embryons injectés dans un plat en plastique contenant 0,1 X MMR et leur permettre de développer jusqu&#39;au stade 20-23 13. Incuber les embryons de 14 à 22 ° C en fonction spé désiréeed de développement. (Pour disséquer tube neural, le lendemain, utilisez ~ 22 ° C. Pour le lendemain, utilisez ~ 14 ° C) </li></ol> 3. Dissection du tube neural et placage <ol><li> Avant d&#39;effectuer les dissections, préparer les 14 boîtes de culture. Tout d&#39;abord, des lamelles manteau avec assez de solution de 200 pg / ml de poly-lysine dans du PBS à la piscine sur la surface de la lamelle, soit Mattek ou des boîtes de culture Lab-Tek, et incuber pendant une heure (en variante, on peut utiliser des lamelles de verre assis en vrac dans une boîte de Pétri, pour un placement plus tard sur lames de verre pour l&#39;imagerie et l&#39;immunocytochimie). Aspirer et laver avec un excès de PBS 3 fois, et laisser sécher. Puis plats manteau avec 10 ug / ml de laminine dans du PBS (nous utilisons habituellement 500 ul par lamelle, il suffit de piscine sur toute la surface) pendant une heure à 37 degrés. Aspirer la solution de laminine et laver 3 fois avec un excès de PBS, en faisant attention de ne pas laisser les surfaces revêtues de laminine être exposés à l&#39;interface air. Remplae PBS avec des milieux de culture (50% de Ringer, 49% de L-15 médias, 1% de sérum fœtal bovin, plus 50 pg / ml de pénicilline / streptomycine et la gentamicine, à pH 7,4 et stérilisé par filtration). (Media Ringer, 115 mM NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Bien que notre protocole utilise ce média, il convient de noter qu&#39;il s&#39;agit d&#39;un milieu enrichi commun pour les cultures de Xenopus plus ganglionnaires de la rétine, où les neurones ont réduit l&#39;énergie réservée. Jeunes cultures de la moelle épinière va survivre et croître pendant plus de 24 heures dans les médias Sonneries pures, sans autres facteurs de croissance, et c&#39;est bien là l&#39;un des avantages de l&#39;utilisation de ce système. Facultatif: Ajouter NT3 et le BDNF (pour des concentrations finales de 25 ng / ul chacun) pour les milieux de culture pour augmenter la croissance axonale. </li><li> En raison de la variabilité de l&#39;expression de l&#39;ARNm injecté, les embryons peuvent présenter une mosaïque de fluorescence. Avant d&#39;effectuer les dissections, les embryons d&#39;écran pour la présence de fluorescence, à identifier les embryons qui expRESS la protéine de fusion fluorescente dans le tube neural. Placer les embryons au stade 20-23 fluorescentes dans un plat d&#39;agarose à revêtement en matière plastique rempli de médias Steinberg (58 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2, 1,3 mM de MgSO 4, 4,6 mM de Tris, pH 7,8, puis à autoclave) 5. Pour rendre le plat d&#39;agarose-enduit, fond plat couche de plastique fondu avec 1% d&#39;agarose dans 0,1 X MMR et laisser durcir. Cela donne une surface douce de façon que les dommages ne se produit pas aux pinces fines et les aiguilles de tungstène utilisé lors des étapes ultérieures de dissection. Dissection d&#39;embryons au-delà de l&#39;étape 23 est possible, mais il est plus difficile que les tissus se conformer plus étroitement les uns aux autres et nécessitent donc un traitement plus long avec de la collagénase. </li><li> Sous un microscope à dissection, retirez la membrane vitelline avec une pince fine, puis d&#39;isoler toute la partie dorsale de l&#39;embryon, en faisant une série d&#39;incisions. Alors une pince maintenir l&#39;embryon en place, utilisez le second pour faire une incision sur lecôté de l&#39;embryon pour exposer l&#39;intérieur creux. Ensuite, utiliser une pince pour pincer les deux le long du tissu entre les moitiés dorsale et ventrale de l&#39;embryon, ce qui réduit de moitié l&#39;embryon pour isoler la partie dorsale contenant le tube neural. </li><li> Placez l&#39;explant dorsale dans un tube Eppendorf de 2 mg / ml de collagénase dans les médias Steinberg pendant 15-20 min sur un agitateur, d&#39;assouplir les tissus, puis pipette explant dorsale en plastique agarose à revêtement plat avec une solution fraîche de Steinberg. Alternativement, l&#39;explant peut être placé dans une boîte de Pétri contenant la solution de collagénase pendant 15 min, où la dissection entière pourrait alors être effectuée. </li><li> En utilisant une paire de pinces, doucement disséquer le tube neural de l&#39;épiderme dorsal et ventral de la notocorde. Glisser la pointe de la pince entre l&#39;épiderme et des tissus sous-jacents et tirant lentement l&#39;épiderme, révélant le tube neural dessous. Ensuite, utilisez une pince pour tenir le tissu et un autre pour faire glisser la pointe entre letube neural et notocorde. Enfin, utilisez une pince pour retirer les somites de chaque côté du tube. </li><li> Transfert du tube neural dans un plat recouvert d&#39;agarose-rempli de milieux de culture, tel que décrit à l&#39;étape 3.1. </li><li> Après la collecte de plusieurs tubes neuraux, les couper en morceaux nombreuses (environ 20, si l&#39;ensemble du tube est isolé) en utilisant des aiguilles de tungstène affûtées ou des pinces, puis les morceaux de plaques dans des boîtes de culture remplis de milieu (préparé à l&#39;étape 3.1), l&#39;étalement les explants uniformément en rangées. </li><li> Après étalement, ne déplacez pas les plats parce que cela perturbe les cellules de fixation. Incuber les explants plaqués du tube neural autour de 20-22 ° C. En général, nous laisser le plat de cellules sur le banc à la température ambiante pendant une nuit. L&#39;un des avantages de Xenopus laevis neurones, c&#39;est que un incubateur spécial pour la culture cellulaire qui régule les niveaux de CO2 ou la température n&#39;est pas nécessaire. Neurites et des cônes de croissance peut être observé et imagé à 12 température ambiante-24 H après étalement, bien que l&#39;excroissance peut être accélérée par l&#39;ajout de facteurs de croissance. En général, l&#39;expression d&#39;un ARN ou un produit plasmide se traduira par une expression variable entre les cellules, et donc il peut y avoir une gamme de niveaux d&#39;expression de fluorescence entre les cônes de croissance. Nous avons observé l&#39;expression d&#39;ARN de protéines fluorescentes de persister au-delà de 48 heures après l&#39;étalement, même si cela dépend de la construction particulière. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Après avoir suivi le protocole, qui est résumée dans la figure 1A, en bonne santé, bien-disséqués et mis en culture des explants neuraux enverra axones de nombreux neurites ou dans tous les sens sur la laminine / poly-lysine substrat, illustré à la figure 1B. Les cônes de croissance à l&#39;extrémité des axones peuvent être visualisés soit par l&#39;optique DIC, comme on le voit dans la figure 1C, à la dynamique d&#39;image dans l&#39;ensemble, la motilité ou haute résolution microscopie à fluorescence pour examiner la localization de fluorescence marqués protéines du cytosquelette, par exemple, EB1-GFP est représenté sur la figure 1D. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> Figure 1. Résumé du protocole expérimental et les résultats attendus. A) Protocole organigramme. Voir la vidéo pour plus de détails concernant la dissection au jour 3. Le tube neural ensemble doivent être coupés en morceaux d&#39;environ 20 de taille égale et étaler uniformément en rangées sur la lamelle. Dans ce dessin, ciseaux sont présentés pour représenter couper le tissu avec des pinces fines. CG gonadotrophine chorionique B) image DIC ou des axones en croissance de neurites explant (explant dans le coin en haut à gauche). C) l&#39;image de grossissement supérieur du cône de croissance à l&#39;extrémité d&#39;un axone en croissance. D) Image en microscopie de fluorescence de la GFP dans EB1-cône de croissance. Barre d&#39;échelle 10 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Xenopus laevis explants neuraux envoyer des neurites de façon très robuste de 24 heures après placage sur la laminine / poly-lysine substrat si les conditions s&#39;y prêtent. Avec ce substrat, des cônes de croissance sont très mobiles et peuvent atteindre des longueurs de l&#39;axone jusqu&#39;à 1 mm, s&#39;étendant dans toutes les directions vers l&#39;extérieur à partir de l&#39;explant, bien longueurs typiques sont 100 um ou plus. Si neurites ne se développent pas, il ya un nombre limité de raisons pour que...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La gonadotrophine chorionique </td><td> Argent Laboratoires Chimique </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cystéine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Capillaire Aiguilles Borosil 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Plats Mattek </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> La poly-L-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> TS3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; xenopus laevis</em

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Le processus complexe de guidage axonal est largement déterminée par le cône de croissance, qui est la structure dynamique mobiles à la pointe de l&#39;axone en croissance. Au cours de la croissance axonale, le cône de croissance doit intégrer plusieurs sources d&#39;information signal de guidage de moduler son cytosquelette afin de propulser le cône de croissance avant et naviguer avec précision pour trouver ses objectifs spécifiques 1. Comment cette intégration se fait au niveau du cytosquelette est encore émergent, et l&#39;examen de protéine du cytosquelette et de la dynamique effectrices dans le cône de croissance peut permettre à l&#39;élucidation de ces mécanismes. Cônes de Xenopus laevis de croissance sont assez grande (10-30 microns de diamètre) pour effectuer de résolution imagerie en temps réel de la dynamique du cytosquelette (par exemple 2-4) et sont faciles à isoler et manipuler dans un laboratoire par rapport à d&#39;autres vertébrés. La grenouille est un système modèle classique pour les études de la neurobiologie du développement, et d&#39;importantes réflexions précoces en micro cône de croissancedynamique rotubule ont d&#39;abord été trouvés en utilisant ce système 5-7. Dans cette méthode 8, les œufs sont recueillis et fécondés in vitro, injection de l&#39;ARN codant pour des protéines de fusion marquées par fluorescence du cytosquelette ou d&#39;autres constructions pour manipuler l&#39;expression des gènes, puis on le laisse se développer jusqu&#39;au stade du tube neural. Tube neural sont isolées par la dissection, puis sont cultivées, et les cônes de croissance des neurites sur l&#39;étroit sont imagés. Dans cet article, nous décrivons comment effectuer cette méthode, dont le but est de culture cônes de Xenopus laevis de croissance pour l&#39;analyse d&#39;images à haute résolution ultérieure. Bien que nous apportions l&#39;exemple de la protéine de fusion + TIP EB1-GFP, cette méthode peut être appliquée à n&#39;importe quel nombre de protéines d&#39;élucider leurs comportements dans le cône de croissance.

La culture des explants neuraux de disséqué<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons qui expriment des protéines de fusion fluorescentes pour l&#39;imagerie permet de dynamique de croissance du cytosquelette cône.

Des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; Xenopus laevis</em

Le processus complexe du guidage axonal est largement piloté par le cône de croissance, qui est la structure motile et dynamique située à l'extrémité de l'axone en croissance. Au cours de...

L'objectif de cette procédure est de cultiver des cônes de croissance de Xenopus laevis en vue d'une analyse d'image à haute résolution. Cette étape est réalisée en injectant d'abord des hormones chez des grenouilles femelles afin de stimuler la production d'ovules. La deuxième étape consiste à recueillir et à féconder les œufs, puis à les injecter avec un ARNm ou d'autres constructions d'intérêt.Le lendemain, les embryons sont disséqués et les tubes neuronaux sont isolés, découpés et placés sur des lamelles. La dernière étape consiste à imager les axones en cours d'élargissement ainsi que les cônes de croissance. En définitive, une microscopie à fluorescence haute résolution peut être utilisée pour observer les changements de localisation des protéines dans les cônes de croissance au fil du temps.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les dissections du tube neural peuvent être difficiles à apprendre uniquement en lisant une section de méthode sans observer directement la technique. Obtenir des œufs à partir de grenouilles femelles ayant reçu auparavant une injection de 400 unités de gonadotrophine chorionique 12 à 14 heures plus tôt. Récolter les œufs dans une solution de Ringer modifiée marquée d'un X.Ensuite, féconder les X collectés in vitro avec des testicules hachés comme décrit précédemment, puis ajouter 0,1 XMMR après au moins 20 minutes. Retirer le milieu et incuber les embryons dans 2 % de cystéine dans un XMMR à pH 7,8 pendant trois à cinq minutes afin d'éliminer la couche gélatineuse des embryons. Puis verser les embryons dans un bécher.Ensuite, laver les embryons avec du XMMR 0,1 X ou du sel de bain modifié 0,1 x trois à cinq fois après le dernier lavage. Conserver les embryons dans du XMMR 0,1 X à température ambiante jusqu'à l'injection, ou si souhaité. Placer les embryons à une température de 14 à 18 degrés Celsius pour ralentir leur développement avant l'injection.Diluez l'ARN coiffé préparé précédemment à une concentration finale de 50 à 200 picogrammes par microlitre avec de l'eau doublement distillée, puis conservez-le sur de la glace jusqu'à l'injection microscopique. Ensuite, préparez l'aiguille d'injection en étirant une capillaire en borosilicate à l'aide d'un étireur Sutter ou d'un instrument similaire. Puis, au microscope, utilisez une pince pour casser l'extrémité de l'aiguille en biais afin d'obtenir une forme semblable à celle d'une plume, et remplissez l'aiguille par l'arrière avec 0,5 à 1 microlitre de la solution d'ARN diluée.Montez l'aiguille sur le micromanipulateur. Un injecteur médical PLI 100 PICO est utilisé ici. Placez maintenant les embryons fécondés au stade d'une à quatre cellules dans une boîte en plastique contenant 5 % fol dans du MMR 0,1 X. Étalonnez le volume d'injection pour chaque nouvelle micropipette à l'aide d'un micromètre radial ou d'un micromètre de plateau.Ensuite, régler l'injecteur pico pour délivrer la quantité souhaitée d'ARN pour chaque injection. Ici, un volume d'injection d'un nanolitre est utilisé. Tenir les embryons avec des pinces ou, si préféré, les placer sur une plateforme de maintien et injecter le volume souhaité dans les blastomères animaux.Répartir les injections en plusieurs endroits dans l’embryon afin d’obtenir une distribution uniforme de l’ARN. On effectue une à deux injections dans chaque blastomère pour un embryon au stade quatre cellules, tandis que deux à quatre injections sont utilisées pour un embryon au stade deux cellules. Après les injections, transférer les embryons injectés dans une boîte en plastique contenant du MMR 0,1 X et les laisser se développer jusqu’au stade 20 à 23.En fonction de la vitesse de développement souhaitée, les embryons sont incubés à une température de 14 à 22 degrés Celsius. Recouvrir des boîtes de culture traitées au PLL avec 10 microgrammes par millilitre de laminine dans du PBS et placer les boîtes à 37 degrés Celsius pendant une heure. Une fois le temps d'incubation écoulé, laver les boîtes trois fois avec du PBS en prenant soin de ne pas exposer la surface recouverte de laminine à l'air après le dernier lavage. Remplacer le PBS par du milieu de culture.Enfin, préparez trois boîtes de culture recouvertes d'agros en enduisant le fond d'une boîte de culture avec 1 % d'aros dans du MMR 0,1 X et en laissant durcir. Une fois durci, remplissez une boîte avec le milieu de Steinberg. La variabilité de l'expression de l'ARNm injecté peut entraîner chez les embryons un mosaïcisme de fluorescence avant la réalisation des dissections. Analysez les embryons pour détecter la présence de fluorescence et identifiez ceux exprimant la protéine de fusion fluorescente dans le tube neural.Ensuite, transférez les embryons fluorescents aux stades 20 à 23 dans la boîte en plastique revêtue d'agarose contenant le milieu de Steinberg. Placez la boîte sous un microscope stéréoscopique et utilisez une pince fine pour retirer la membrane vitelline. Puis, tandis qu'une pince maintient l'embryon en place, utilisez la seconde pour pratiquer une incision sur le côté de l'embryon et exposer l'intérieur creux.Ensuite, utilisez les deux paires de forceps pour pincer le tissu situé entre les moitiés dorsale et ventrale de l'embryon afin de couper l'embryon en deux et isoler la partie dorsale contenant le tube neural. Placez l’explant dorsal X dans un tube de microcentrifugeuse contenant deux milligrammes par millilitre de collagénase dans du milieu de Steinberg et placez-le sur un agitateur rotatif pendant 15 à 20 minutes. Transférez ensuite l’explant dorsal dans une boîte traitée avec de l’agarose remplie de milieu de Steinberg frais.En travaillant sous le microscope, disséquez le tube neural à partir de l'épiderme dorsal et du mésoderme ventral en insérant la pointe de la pince entre l'épiderme et les tissus sous-jacents, puis en retirant lentement l'épiderme. Utilisez ensuite une pince pour maintenir le tissu et une autre pour éliminer les tissus environnants le tube neural. Ensuite, transférez le tube neural disséqué dans une boîte revêtue d'agarose contenant un milieu de culture frais.Une fois que plusieurs tubes neuronaux ont été collectés, vous aiguisez des aiguilles ou des pinces en tungstène afin de couper chaque tube en environ 20 morceaux. Ensuite, déposez les morceaux sur des boîtes de culture revêtues de laminine, en répartissant uniformément les explants en rangées. Après le dépôt des tubes neuronaux, les boîtes ne doivent pas être déplacées, car cela perturberait l'attachement des cellules.Incuber l'explant de tube neural en plaques à une température de 20 à 22 degrés Celsius. Un incubateur de culture cellulaire n'est pas nécessaire pour la culture des neurones XUS lavis pendant 12 à 24 heures après la mise en place. Observer les neurones et les cônes de croissance à température ambiante. Garder à l'esprit qu'une expression variable de l'ARN peut entraîner une gamme de niveaux de fluorescence entre les cônes de croissance.Cette image DIC montre des axones et des neurites en cours de croissance à partir de l'explants X, dans le coin supérieur gauche du champ de vision. La barre d'échelle dans cette image et les images suivantes représente 10 micromètres. Ce film à plus fort grossissement montre le cône de croissance à l'extrémité d'un axone en croissance.Enfin, ce film de microscopie à fluorescence montre l'expression de EB one GFP dans un cône de croissance. Bien que nous fournissions ici l'exemple d'imagerie de la protéine de fusion au bout plus, EB one GFP, cette méthode d'explant neural peut être appliquée à un grand nombre de protéines afin d'élucider leurs comportements au sein du cône de croissance pendant l'élaboration du neurite.

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