Des cultures d'explants neuraux de Xenopus laevis

L'objectif de cette procédure est de cultiver des cônes de croissance de Xenopus laevis en vue d'une analyse d'image à haute résolution. Cette étape est réalisée en injectant d'abord des hormones chez des femelles afin de stimuler la production d'ovules. La deuxième étape consiste à recueillir et à féconder les œufs, puis à les injecter avec un ARNm ou d'autres constructions d'intérêt.

Le lendemain, les embryons sont disséqués et les tubes neuronaux sont isolés, découpés et placés sur des lamelles. La dernière étape consiste à imager les axones en cours d'élargissement ainsi que les cônes de croissance. En définitive, une microscopie à fluorescence haute résolution peut être utilisée pour observer les changements de localisation des protéines dans les cônes de croissance au fil du temps.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les dissections du tube neural peuvent être difficiles à apprendre uniquement en lisant une section de méthode sans observer directement la technique. Obtenir des œufs à partir de grenouilles femelles préalablement injectées avec 400 unités de gonadotrophine chorionique 12 à 14 heures auparavant. Récolter les œufs dans une solution de Ringer modifiée marquée d'un X.

Ensuite, féconder les X collectés in vitro avec des testicules hachés comme décrit précédemment, puis ajouter 0,1 XMMR après au moins 20 minutes. Éliminer le milieu et incuber les embryons dans 2 % de cystéine dans un XMMR à pH 7,8 pendant trois à cinq minutes afin de retirer la couche gélatineuse des embryons. Verser ensuite les embryons dans un bécher.

Ensuite, lavez les embryons avec du XMMR 0,1 X ou du sel de bain modifié 0,1 x, trois à cinq fois après le dernier lavage. Conservez les embryons dans du XMMR 0,1 X à température ambiante jusqu'à l'injection, ou plus longtemps si désiré. Placez les embryons à une température de 14 à 18 degrés Celsius pour ralentir leur développement avant l'injection.

Diluez l'ARN coiffé préparé précédemment à une concentration finale de 50 à 200 picogrammes par microlitre avec de l'eau doublement distillée, puis conservez-le sur de la glace jusqu'à l'injection microscopique. Ensuite, préparez l'aiguille d'injection en tirant une capillaire en borosilicate à l'aide d'un tireur de capillaires Sutter ou d'un instrument similaire. Puis, au microscope, utilisez une pince pour casser l'extrémité de l'aiguille en biais afin d'obtenir une forme semblable à celle d'une plume, et remplissez l'aiguille en arrière avec 0,5 à 1 microlitre de la solution d'ARN diluée.

Montez l'aiguille sur le micromanipulateur. Un injecteur médical PLI 100 PICO est utilisé ici. Placez maintenant les embryons fécondés au stade une à quatre cellules dans une boîte en plastique contenant 5 %fol dans du MMR 0,1 X. Étalonnez le volume d'injection pour chaque nouvelle micropipette à l'aide d'un micromètre radial ou d'un micromètre de plateau.

Ensuite, régler l'injecteur pico pour délivrer la quantité souhaitée d'ARN pour chaque injection. Ici, un volume d'injection d'un nanolitre est utilisé. Tenir les embryons avec des pinces ou, si souhaité, les placer sur une plateforme de maintien et injecter le volume souhaité dans les blastomères animaux.

Répartir les injections en plusieurs endroits dans l’embryon afin d’obtenir une distribution uniforme de l’ARN. On effectue une à deux injections dans chaque blastomère pour un embryon au stade quatre cellules, tandis que deux à quatre injections sont utilisées pour un embryon au stade deux cellules. Après les injections, transférer les embryons injectés dans une boîte en plastique contenant du MMR à 0,1 X et les laisser se développer jusqu’aux stades 20 à 23.

En fonction de la vitesse de développement souhaitée, les embryons sont incubés à une température de 14 à 22 degrés Celsius. Recouvrir des boîtes de culture traitées au PLL avec 10 microgrammes par millilitre de laminine dans du PBS et placer les boîtes à 37 degrés Celsius pendant une heure. Une fois le temps d'incubation écoulé, laver les boîtes trois fois avec du PBS en prenant soin de ne pas exposer la surface recouverte de laminine à l'air après le dernier lavage. Remplacer le PBS par du milieu de culture.

Enfin, préparez trois boîtes de culture recouvertes d'agros en enduisant le fond d'une boîte de culture avec 1 % d'aros dans du MMR 0,1 X et en laissant durcir. Une fois durci, remplissez une boîte avec le milieu de Steinberg. La variabilité de l'expression de l'ARNm injecté peut entraîner chez les embryons l'apparition d'une mosaïque de fluorescence avant la réalisation des dissections. Analysez les embryons pour détecter la présence de fluorescence et identifiez les embryons exprimant la protéine de fusion fluorescente dans le tube neural.

Ensuite, transférez les embryons fluorescents aux stades 20 à 23 dans la boîte en plastique revêtue d'agros contenant le milieu de Steinberg. Placez la boîte sous un microscope stéréoscopique et utilisez une pince fine pour retirer la membrane vitelline. Puis, tandis qu'une pince maintient l'embryon en place, utilisez la seconde pour pratiquer une incision sur le côté de l'embryon et exposer l'intérieur creux.

Ensuite, utilisez les deux paires de forceps pour pincer le tissu situé entre les moitiés dorsale et ventrale de l'embryon afin de couper l'embryon en deux et isoler la partie dorsale contenant le tube neural. Placez l'explant dorsal X dans un tube de microcentrifugeuse contenant deux milligrammes par millilitre de collagénase dans du milieu de Steinberg et placez-le sur un agitateur rotatif pendant 15 à 20 minutes. Transférez ensuite l'explant dorsal dans une boîte traitée à l'agarose remplie de milieu de Steinberg frais.

En travaillant sous le microscope, disséquez le tube neural à partir de l’épiderme dorsal et du mésoderme ventral en insérant la pointe de la pince entre l’épiderme et les tissus sous-jacents, puis en retirant lentement l’épiderme. Utilisez ensuite une pince pour maintenir le tissu et une autre pour éliminer les tissus environnant le tube neural. Ensuite, transférez le tube neural disséqué dans une boîte recouverte d’agarose contenant un milieu de culture frais.

Une fois que plusieurs tubes neuronaux ont été collectés, vous aiguisez des aiguilles ou des pinces en tungstène afin de couper chaque tube en environ 20 morceaux. Ensuite, déposez les morceaux sur les boîtes de culture revêtues de laminine, en répartissant uniformément les explants en rangées. Après avoir déposé les tubes neuronaux, les boîtes ne doivent pas être déplacées, car cela perturberait l'attachement des cellules.

Incuber l'explant de tube neural en plaques à une température de 20 à 22 degrés Celsius. Un incubateur de culture cellulaire n'est pas nécessaire pour la culture des neurones XUS lavis 12 à 24 heures après la mise en place. Observer les neurones et les cônes de croissance à température ambiante. Garder à l'esprit qu'une expression variable de l'ARN peut entraîner une gamme de niveaux de fluorescence entre les cônes de croissance.

Cette image CIN montre des axones et des neurites en cours de croissance à partir de l'explant X, situé dans le coin supérieur gauche du champ de vision. La barre d'échelle présente dans cette image et dans les images suivantes représente 10 micromètres. Cette vidéo, prise avec un grossissement plus élevé, montre le cône de croissance à l'extrémité d'un axone en croissance.

Enfin, ce film de microscopie à fluorescence montre l'expression de EB one GFP dans un cône de croissance. Bien que nous fournissions ici l'exemple d'imagerie de la protéine de fusion au bout plus, EB one GFP, cette méthode d'explant neural peut être appliquée à un grand nombre de protéines afin d'élucider leurs comportements au sein du cône de croissance pendant l'élaboration des neurites.