Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode souple de restructuration des surfaces virales par chimie click. Dans la première étape de cette procédure, des cellules rénales embryonnaires humaines sont infectées par un adénovirus de type cinq et incubées en présence soit de l'acide aminé non naturel azidohomoalanine, soit du sucre parasite N-acétoacétylglucosamine. Après deux jours, les particules d'adénovirus marquées par l'azoture sont récoltées et purifiées.

Ensuite, la cycloaddition chimiospécifique entre azide et alcynes est utilisée pour ligaturer des sondes fluorescentes à la surface de ces particules. Comme expliqué dans le protocole écrit, cette réaction est réalisée selon l'une des deux méthodes de ligature possibles : la cycloaddition favorisée par contrainte ou la cycloaddition catalysée par le cuivre.

Dans les applications thérapeutiques, ces attaches peuvent inclure des polymères de polypeptides ou des petites molécules. Dans cette expérience, une sonde fluorescente est utilisée afin de démontrer la ligation de la sonde sur les protéines de capsides par électrophorèse SDS-PAGE. Il existe un intérêt considérable pour le développement de virus en tant qu'agents de transfert de gènes, notamment dans le contexte des thérapeutiques, du transfert de gènes, de la thérapie oncotique et des technologies vaccinales.

Dans ce contexte, le réglage de l'interface hôte-virus est particulièrement important pour obtenir les propriétés adéquates en matière de stimulation immunitaire ciblant les tissus thérapeutiques. Un certain nombre d'autres facteurs sont importants en ce qui concerne l'ajustement de l'interface hôte-virus. Dans ce contexte, nous avons mis au point un protocole de marquage en deux étapes.

La première étape consiste en l'introduction métabolique d'un acide aminé non naturel ou d'un sucre non naturel. Cela crée un point d'ancrage que l'on peut ensuite développer à l'aide de chimies extrêmement sélectives, permettant d'associer à ces virus pratiquement toute fonctionnalité souhaitée sans perturber significativement le virus, son infectiosité ou son aptitude globale, ce qui constitue un obstacle majeur à surmonter. Après avoir stérilisé la hotte et le matériel de laboratoire, préparez 11 boîtes de culture de 100 millimètres contenant des cellules HEK 293 maintenues dans un milieu de croissance HEK à 37 degrés Celsius.

Lorsque la culture cellulaire atteint une confluence de 80 à 90 %, retirez le milieu de croissance de l'une des boîtes et rincez une fois avec le tampon TD. Détachez les cellules à l'aide d'un millilitre de trypsine-EDTA et incubez pendant une minute. Ajoutez neuf millilitres de milieu de croissance et déterminez le nombre de cellules récoltées dans cette boîte.

À l'aide d'un cytomètre à hématies, calculez le nombre de particules d'adénovirus nécessaires pour l'infection de chacune des 10 boîtes de culture restantes. Retirez lentement le milieu de croissance, puis rincez avec cinq millilitres de tampon TD. Ajoutez un millilitre de tampon d'infection et incubez pendant une heure durant cette période.

Secouez doucement les boîtes de chaque côté toutes les 15 minutes après l'infection. Ajoutez soigneusement neuf millilitres de milieu de croissance pour HEK dans chaque boîte et incubez pendant encore 18 heures. À partir de solutions mères concentrées d'une HA dans la cystine.

Préparez un milieu de marquage à l'acide hyaluronique selon le protocole écrit. Veillez à filtrer d'abord ces solutions mères à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micromètre. Stérilisez la solution mère de méthionine pour le témoin de la même manière, puis retirez soigneusement le milieu de croissance et lavez chaque boîte de culture avec cinq millilitres de tampon TD.

Remplacez par 10 millilitres d'un milieu de marquage à l'HA et incubez les cellules infectées pendant six heures supplémentaires. Les protéines de l'enveloppe virale seront désormais traduites en présence d'azo homo alanine et en l'absence de méthionine. Remplacez soigneusement le milieu de marquage par 10 millilitres de milieu de croissance frais et incubez pendant 18 heures supplémentaires.

Après avoir terminé cette étape, passez à la procédure de purification à l'étape trois de la vidéo. Alternativement, des marqueurs azi peuvent être introduits à l’aide de sucres contenant de l’azi au lieu de l’acide aminé non naturel a HA. Dans ce protocole, un parasite lié au n acétoacétyl galacto, précurseur métabolique de l’UDPN acétoacétyl, est utilisé. La glucosamine est cultivée en présence de ce sucre acéto.

Le virus de l'adénovirus de type cinq présentera des groupes azi uniquement sur la fibre afin d'effectuer le marquage des sucres. Suivez d'abord l'étape un de la vidéo jusqu'à l'invite à l'écran. Cela correspond à l'étape 1,5 du protocole écrit.

Préparez la solution de marquage des sucres en pipetant d'abord 100 microlitres de solution mère de sucres ATO dans des tubes Falcon et en laissant s'évaporer le méthanol. Ensuite, ajoutez 100 millilitres de milieu de croissance HEK. Recouvrez les cellules de chaque boîte avec 10 millilitres de ce milieu de marquage des sucres et incubez à 37 degrés Celsius pendant 44 heures.

Passez à l'étape trois pour la purification. Transférez le milieu ainsi que les cellules infectées de la boîte de culture vers deux tubes coniques et centrifugez à 2000 G pendant 10 minutes. À quatre degrés.

Éliminer le surnageant et resuspendre chaque culot dans quatre millilitres de tampon TD en utilisant de l'azote liquide dans un bain à 37 degrés. Effectuer trois cycles de congélation-décongélation pour lyser les cellules infectées. Mélanger la suspension à l’aide d’un vortex entre chaque cycle.

Centrifuger la suspension décongelée à 2000 G pendant 10 minutes pour précipiter les débris cellulaires, car l'adénovirus utilisé pour l'infection à l'étape un contenait un transgène GFP ; l'activité fluorescente observée à cette étape confirme la transduction et l'expression de l'ADN viral. Préparer soigneusement un gradient de densité de chlorure de césium allant de 1,25 gramme par millilitre à 1,4 gramme par millilitre. Déposer délicatement le surnageant des cellules lysées sur le gradient de densité et centrifuger à 126 000 G pendant une heure à 15 degrés Celsius.

Après centrifugation, une bande épaisse et large doit être présente dans le tube de centrifugation. Il s'agit du virus modifié par l'azi. À l'aide d'une aiguille L étoile, percer le fond du tube afin que le contenu s'écoule goutte à goutte, puis recueillir soigneusement ce virus.

La bande des deux méthodes de ligature a démontré la déformation. La voie favorisée implique des conditions de réaction plus simples, mais présente l'inconvénient d'un choix plus limité de sondes disponibles commercialement pour réaliser la ligature favorisée par déformation. Mélangez 50 microlitres de virus modifié par l'azi avec 0,25 microlitre de solution de marquage Tamara BCN en tapotant le fond du couvercle du tube avec du papier d'aluminium et faites tourner toute la nuit à température ambiante.

Purifiez le virus par clic à l'aide d'une filtration sur gel par centrifugation. Équilibrez les colonnes tournantes avec le tampon de stockage du virus. Le cuivre désossigéné, qui catalyse la cycloaddition, offre une plus grande disponibilité des sondes, mais présente l'inconvénient de nécessiter un équipement spécialisé pour maintenir une atmosphère désossigénée.

Pour réaliser une ligature catalysée par le cuivre, commencez par désoxygéner tous les réactifs et solutions dans une enceinte à gants sous azote pendant six heures. À l'issue de cette période, préparez dans l'enceinte à gants la solution mère de catalyseur au cuivre (I) afin d'initier la réaction. Ajoutez un microlitre de cette solution mère de cuivre à une solution de 50 microlitres contenant la sonde virale et l'agent chélatant.

Laisser la réaction de marquage se dérouler toute la nuit dans la boîte à gants. Purifier le produit par filtration comme indiqué à l'étape quatre. Après ébullition, ajouter le tampon d'échantillonnage au virus purifié et cliqué.

Chargez les puits avec le virus cliqué et les témoins, puis effectuez l'électrophorèse. Maintenez le réservoir recouvert de papier d'aluminium pour protéger la sonde fluorescente de la lumière. Après une heure, utilisez un scanner de gel fluorescent pour numériser le gel.

Notez que les virus intacts ou non marqués par l'iode ne doivent pas entraîner un déplacement significatif du marquage fluorescent pour une HA : les virus produits à une concentration plus élevée de HA présentent un marquage fluorescent plus important en raison d'un degré accru d'incorporation de la HA. Notez également que le virus marqué par le sucre exprime des étiquettes azi uniquement dans la protéine capsidique de la fibre. À partir de cellules en confluence à 80 %, comptez deux jours pour l'infection en marquage azi, cinq heures pour la récolte et la purification du virus marqué, une nuit pour la réaction « click », et deux heures pour l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE, soit un total de trois jours et demi. En résumé, deux types de méthodes de marquage azi et deux réactions de chimie click azide-alkyne ont été démontrés.

Votre application et vos ressources doivent déterminer quelle méthode ou quelles méthodes conviennent le mieux à votre objectif. Bien que tous les matériaux décrits dans ce protocole soient disponibles commercialement, nous avons constaté que la synthèse de sucres acétoniques d'acide hyaluronique et de sondes INE est nettement plus rentable et offre une plus grande flexibilité en matière de modifications de la surface virale.