Name: Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Découvrez une méthode flexible pour modifier chimiosélectivement les surfaces virales d'adénovirus via la chimie click bioorthogonale. Cette approche permet d'attacher des sondes fluorescentes et améliore le ciblage thérapeutique.

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Nous tenons à remercier la NSF pour le financement (CBET-0846259).

<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le développement de la réactions cliquez sur chimiosélectives et de bioorthogonal, y compris ceux de la des azides, des est un zone de rapidement-en évolution de la recherche, et par la suite il n&#39;y a un certain nombre croissante de ces réactions de choisir à partir pour les applications bioconjugaison. Nous avons limité la portée de ce protocole d&#39;inclure seulement deux méthodes qui ont été choisis en raison de leur utilité dans notre propre laboratoire et de la disponibilité commerciale de tous les réactifs. <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Adénovirus de type 5 (Ad5) contenant un transgène GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> De rein embryonnaire humain (HEK 293) des cellules </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), glycémie élevée </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Médium, pas de méthionine, la cystéine ne (DMEM-Met / Cys-), glycémie élevée </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Bovine sérum de veau </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> La pénicilline - streptomycine 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% de trypsine-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm boîte de culture cellulaire, culture de tissus de polystyrène traité </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Culture cellulaire incubateur à CO 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Enceinte de sécurité biologique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seringue stérile de filtre (0,2 um, l&#39;acétate de cellulose) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Tubes coniques (50 ml, stérile) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, à paroi mince, ultra-Clair, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrifugeuse équipé d&#39;un 41 SW et SW 60 rOtor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifuger 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep colonnes de gel de spin de filtration </td><td> Séparations Princeton </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Aiguille stérile, de calibre 18 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azote gant de sac (si CuAAC désoxygénée doit être exécuté) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vase de Dewar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azote liquide </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellule d&#39;électrophorèse </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scanner gel fluorescent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prêt gel de Tris-HCl gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracétylé N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophénanthroline disulfonique (BDA) de disodium </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris base (tris (hydroxyméthyl) aminométhane) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphate disodique (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> HCl 1M </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-méthionine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodécyl sulfate de sodium) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le 2-mercaptoéthanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de césium (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> De cuivre (I) du bromure de (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de calcium (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de potassium (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alcyne sonde pour CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA acétyléniques </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Purée de sonde pour alcyne * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO acétyléniques </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Les vendeurs notables de réactifs de chimie clic et kits comprennent Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Cliquez sur Outils Chimie, et Baseclick. Une variété de colorants alcynes et des ligands de ciblage peut être trouvé dans les catalogues de ces vendeurs.

modification des surfaces chimiosélective virales via click chemistry bioorthogonal

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

La modification de particules virales a reçu une quantité importante de l&#39;attention pour son énorme potentiel pour influer sur la thérapie génique, applications oncolytiques et le développement de vaccins. 1,2,3 Les approches actuelles de la modification de surfaces virales, qui sont la plupart du temps basée sur la génétique, souffrent souvent de l&#39;atténuation transduction de la production de virus, d&#39;infectiosité et cellulaire. 4,5 En utilisant la chimie clic chimiosélective, nous avons développé une approche alternative simple qui permet d&#39;éviter ces problèmes tout en restant à la fois très souple et accessible. 1,2 L&#39;objectif de ce protocole est de démontrer l&#39;efficacité de l&#39;aide click chemistry bioorthogonal de modifier la surface de l&#39;adénovirus de type 5 particules. Ce processus en deux étapes peut être utilisé à la fois thérapeutique 1 ou analytiquement, 2,6, car il permet pour la ligature chimiosélective de molécules de ciblage, de colorants ou d&#39;autres molécules d&#39;intérêt sur ​​des protéinespré-marquée avec balises azide. Les trois principaux avantages de cette méthode sont que (1) marquage métabolique démontre peu ou pas d&#39;impact sur ​​l&#39;aptitude virale, 1,7 (2) un large éventail de ligands effecteurs peuvent être utilisés, et (3), il est remarquablement rapide, fiable et facile d&#39;accès. 1,2,7 Dans la première étape de cette procédure, les particules d&#39;adénovirus sont soit produite portant azidohomoalanine (Aha, un substitut méthionine) ou le sucre non naturelle O-liée N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), qui contiennent tous deux l&#39;azoture (-N 3) fonctionnelle groupe. Après purification des particules virales azoture modifiés, une sonde alcyne contenant le fragment fluorescent TAMRA est ligaturé de manière chimiosélective aux protéines pré-étiquette ou glycoprotéines. Enfin, une analyse SDS-PAGE est effectuée pour démontrer la ligature réussi de la sonde sur les protéines de la capside virale. L&#39;incorporation Aha est montré à étiqueter tous les capside viraleprotéines (Hexon, Penton et fibre optique), tandis que les résultats d&#39;incorporation O-GlcNAz dans l&#39;étiquetage des fibres seulement. Dans ce domaine en pleine évolution, de multiples méthodes pour l&#39;azoture de-alcyne ligature ont été développés avec succès, mais seuls les deux nous avons trouvé pour être plus pratique sont mises en évidence ci - souche promu azide-alcyne cycloaddition (SPAAC) et de cuivre-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC) sous atmosphère désoxygénée.

Particules d&#39;adénovirus sont conçus pour contenir soit le naturel azidohomoalanine analogue d&#39;acide aminé ou le sucre azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Le groupe azide de chaque chimiosélective est ligaturé au moyen des réactions «clic» chimie sous forme de moyens de modification de surface virale.

Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal

La modification des particules virales a fait l'objet d'une attention considérable en raison de son immense potentiel pour influencer la thérapie génique, les virus oncolytiques...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode souple de restructuration des surfaces virales par chimie click. Dans la première étape de cette procédure, des cellules rénales embryonnaires humaines sont infectées par un adénovirus de type cinq et incubées en présence soit de l'acide aminé non naturel azidohomoalanine, soit du sucre parasite N-acétoacétylglucosamine. Après deux jours, les particules d'adénovirus marquées par l'azoture sont récoltées et purifiées.Ensuite, la cycloaddition chimiospécifique entre azide et alcynes est utilisée pour ligaturer des sondes fluorescentes à la surface de ces particules. Comme expliqué dans le protocole écrit, cette réaction est réalisée selon l'une des deux méthodes de ligature possibles : la cycloaddition favorisée par contrainte ou la cycloaddition catalysée par le cuivre.Dans les applications thérapeutiques, ces attaches peuvent inclure des polymères de polypeptides ou des petites molécules. Dans cette expérience, une sonde fluorescente est utilisée afin de démontrer la ligation de la sonde sur les protéines de capsides par électrophorèse SDS-PAGE. Il existe un intérêt considérable pour le développement de virus en tan

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Recherche

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Nous présentons une méthode pour rapide, l'immobilisation réversible de petites molécules et des ensembles de nanoparticules fonctionnalisées pour résonance plasmonique de surface (SPR) des études, utilisant séquentielle sur puce chimie de cycloaddition bioorthogonal et anticorps-antigène capture.

Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

Cette méthode décrit l'utilisation de la chimie clic pour mesurer les changements dans la transcription de la cellule hôte après infection par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12. Les résultats peuvent être visualisés qualitativement par microscopie à fluorescence ou obtenus quantitativement par cytométrie de flux. Cette méthode est adaptable pour une utilisation avec d'autres virus.

Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Ici, nous présentons un protocole pour introduire des sondes chimiques spécifiques au site dans un fragment d’anticorps en incorporant génétiquement un acide aminé contenant de l’azoture, puis en couplant l’azoture avec une sonde chimique par cycloaddition azide-alcyne promue par souche (SPAAC).

Efficace et Antibody Étiquetage par Strain promu Azide-alcyne cycloaddition spécifique du site

Nous avons conçu la protéine de capside du virus de l’hépatite E comme une NANOPARTICULE théranostiques (HEVNP). HEVNP auto assemble dans une cage icosaédrique stable en livraison muqueuse. Nous décrivons ici la modification de HEVNPs pour tumeur ciblage par mutation exposés à la surface des résidus cystéines, qui conjugue des ligands synthétiques qui lient spécifiquement les cellules tumorales.

Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

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Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.

Faire induite par la conjugaison Fluorescent pégylé Pseudo-particules virales de chimie Dibromomaleimide-disulfure

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de modifier précisément capsides adénovirus dans certains sites de chimie simple. Particules de vecteurs adénovirus blindé et vecteurs de transfert de gène reciblées peuvent être générés et interactions hôte vecteur peuvent être étudiées.

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L’étude de l’acylation graisseuse a des implications importantes dans les interactions et les maladies des protéines cellulaires. Présenté ici est un protocole modifié pour améliorer la détection chimique du clic des protéines acylées grasses, qui peut être appliqué dans divers types de cellules et combiné avec d’autres tests, y compris la chasse au pouls et la spectrométrie de masse.

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Ici, nous proposons un protocole simple combinant l’ingénierie des oligosaccharides métaboliques, la chimie click et la microscopie à expansion qui permet la bio-imagerie des N-glycoprotéines sialylées intracellulaires avec une résolution améliorée à l’aide d’équipements de microscopie de routine.

Visualisation de la sialylation intracellulaire avec la chimie clic et la microscopie à expansion

Découvrez une méthode flexible pour modifier chimiosélectivement les surfaces virales d'adénovirus via la chimie click bioorthogonale. Cette approche permet d'attacher des sondes fluorescentes et améliore le ciblage thérapeutique.

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