Haut débit séquentiel ELISA pour la validation des biomarqueurs de réaction aiguë du greffon contre l'hôte

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser Eliza séquentielle à haut débit afin d’analyser efficacement un grand nombre de nouveaux biomarqueurs découverts par protéomique. Pour ce faire, on ajoute d’abord des échantillons à une plaque source, qui est utilisée pour créer une dilution pour chaque biomarqueur et pour stocker le plasma récupéré entre les tests. Ensuite, les tests d’Eliza sont analysés pour chaque protéine afin de déterminer leurs concentrations dans les échantillons de patients.

En fin de compte, l’élévation des niveaux de protéines de ces biomarqueurs au début des manifestations cliniques de la maladie aiguë du greffon contre l’hôte peut être évaluée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les analyseurs séquentiels peuvent analyser plusieurs nouvelles protéines qui ne sont pas toujours disponibles avec des plates-formes de surmultiplexage. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de la maladie aiguë du greffon contre l’hôte.

Comme les biomarqueurs validés par cette méthode sont actuellement à l’étude pour les soins cliniques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des complications de la greffe de cellules souches poétiques post-traumatiques. Il peut également être appliqué à la découverte et à la validation de biomarqueurs pour d’autres maladies telles que la transplantation pulmonaire, les complications, le cancer du poumon ou potentiellement toute maladie pour laquelle un test sanguin diagnostique sera utile.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est important que les multiples étapes soient effectuées de manière cohérente pour assurer la reproductibilité et la faible variabilité des lots. La veille de l’expérience, faites tourner les échantillons d’aliquote de plasma pendant 10 minutes à 15, 300 RCF et quatre degrés Celsius pour séparer les caillots en bas et les lipides en haut du plasma. Ensuite, plaquez 150 microlitres de plasma non dilué de chaque échantillon sur une plaque inférieure en V de 96 puits par pipetage manuel selon des cartes prédéfinies. Enveloppez l’assiette dans du Paraform et placez-la dans une chambre humaine à quatre degrés Celsius jusqu’à 72 heures.

Ensuite, après avoir reconstitué et dilué l’IL deux récepteurs alpha et le facteur de croissance humain, ou HGF, capturent les anticorps selon les spécifications du fabricant, plaque 50 microlitres aliquotes de chaque anticorps dans chaque puits des plaques respectives de 96 puits à liaison élevée. Scellez ensuite ces plaques avec une scelleuse à plaques et incubez-les pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Maintenant, diluez reg three alpha avec le tampon d’enrobage du fabricant selon le protocole du fabricant et mettez 25 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque de 3 84 puits sans maxor.

Ensuite, stockez cette plaque scellée à quatre degrés Celsius le premier jour de l’expérience. Commencez par laver la plaque de test du récepteur alpha IL deux et bloquez-la avec du blotto dans le TBS. Après avoir reconstitué l’étalon, établissez une courbe d’étalon à huit points selon le protocole du fabricant.

Plaque suivante, 50 microlitres de plasma non dilué et 50 microlitres de chaque étalon en double de la plaque source à la plaque d’essai ELIZA. Ensuite, incubez la plaque scellée à température ambiante sur un rotateur de plaque réglé à 300 tr/min. Après deux heures, récupérez le plasma de la plaque de test ELIZA alpha du récepteur IL deux et replacez-le dans la plaque source de plasma non diluée.

Ensuite, après avoir terminé l’EIA selon le protocole du fabricant, lisez la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres pour les trois riches alpha Eliza transfère d’abord 10 microlitres de plasma non dilué sur une plaque source inférieure séparée, puis ajoutez 90 microlitres de tampon de dilution fourni par le fabricant à chaque puits pour créer une plaque source de dilution de un à 10. Après avoir terminé le Reg three alpha Eliza, conformément au protocole du fabricant, ajoutez la solution d’arrêt à la plaque de 384 puits et lisez la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 620 nanomètres. Après avoir reconstitué et dilué l’éléphant et le tn FFR, un anticorps de capture selon les spécifications du fabricant code chaque puits des plaques de demi-puits respectives à 96 puits à haute liaison avec 50 microlitres d’anticorps de capture.

Ensuite, incubez les plaques d’essai scellées pendant la nuit à température ambiante pour la plaque d’éléphant et à quatre degrés Celsius pour la plaque TN FFR. Après avoir terminé l’IL deux récepteurs alpha, Eliza transfère 60 microlitres de plasma non dilué vers une nouvelle plaque source. Puis à 60 microlitres de 1 % BSA dans du PBS à chaque puits pour faire une à deux plaques de source de plasma diluées.

Ensuite, lavez et bloquez la plaque de test HGF avec BLOTTO dans TBS, puis mettez en place la dilution de la courbe standard en huit points. Après le lavage de la plaque, en suivant l’étape de blocage de la plaque de 50 microlitres, dupliquez les aliquotes d’un à deux plasmas dilués et de chaque étalon sur la plaque de test EISA. Ensuite, incubez la plaque scellée pendant la nuit à température ambiante sur un rotateur de plaque réglé à 300 tr/min.

Le lendemain matin, récupérez le plasma dilué d’une à deux fois de la plaque d’essai Eliza de HGF et remettez-le dans la plaque source de plasma dilué d’une à deux fois. Après avoir terminé l’EIA, selon le protocole du fabricant, lisez la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres le deuxième jour de l’expérience. Transférez d’abord 10 microlitres de plasma non dilué sur une nouvelle plaque source, puis 190 microlitres de 1 % BSA dans du PBS pour faire 200 microlitres de un à 20 plasma dilué.

Ensuite, après avoir terminé l’éléphant, Eliza, selon le protocole du fabricant, a lu la densité optique à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres. Pour le TN FFR, Eliza ajoute d’abord 25 microlitres de 1 % BSA et PBS à la plaque source un à 20, ce qui donne 125 microlitres de un à 25 plasma dilué par puits. Ensuite, après avoir terminé le TN FFR un EIA selon le protocole du fabricant, lisez la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres pour le premier transfert I-L-H-E-I-A, 60 microlitres de plasma dilué d’un à deux sur une nouvelle plaque source, puis ajoutez 180 microlitres de diluant IL eight dans chaque puits pour faire une plaque source de plasma diluée de un à six.

Ensuite, après avoir terminé l’ILH Eliza selon le protocole du fabricant, lisez la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres. Enfin, une fois que tous les Eliza ont été terminés, remplacez le plasma de parole inutilisé dans la pensée Eloqua et congelez-le pour une utilisation future. Dans ce graphique, les densités optiques de la courbe standard de sept plaques ELIZA différentes mesurant les concentrations alpha reg trois correspondant aux 1084 patients testés pour le rapport initial reg three alpha gastro-intestinal graft versus host disease biomarker report montrent que les densités optiques cohérentes entre les plaques assurent des mesures cohérentes de concentration en protéines entre les expériences.

Les concentrations de protéines dans les échantillons de plasma ont été calculées en comparant les densités optiques de l’échantillon aux densités optiques de la courbe standard. Une plate-forme de manipulation robotisée peut être utilisée pour augmenter encore la reproductibilité tout en diminuant le volume de plasma utilisé par l’exécution d’Eliza et de plaques de puits de forme créatives. Lors de la planification de cette procédure, il est important d’exécuter d’abord des EIS qui sont du plasma non dilué afin qu’il puisse être récupéré et utilisé dans des expériences ultérieures après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer des biomarqueurs candidats dans n’importe quelle maladie d’intérêt grâce à l’utilisation universelle d’Eliza séquentiels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de valider plusieurs biomarqueurs à l’aide de E séquentiel tout en utilisant de petits volumes de plasma et en minimisant les cycles libres.