Name: Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Découvrez une méthode de traçage viral trans-synaptique utilisant le récepteur TVA pour analyser la microcircuitrie neuronale dans le système nerveux central. Cette technique offre une analyse à haut débit des connexions synaptiques.

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Nous tenons à remercier Sean Whelan de l&#39;aide pour sauver variantes VSV recombinants, et Didem Goz et Ryan Chrenek pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par HHMI (CTC), et n ° NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Utilisation de virus pour étudier les circuits neuronaux est une méthode débit relativement élevé d&#39;analyser les neurones connectés. Cependant, générer à la fois des virions VSV et RABV n&#39;est pas trivial. Bien que le protocole ci-dessus pour le sauvetage du virus à partir d&#39;ADNc est fourni, il est toujours un événement à faible probabilité. Les niveaux de chacune des N, P et L plasmides doivent être finement ajusté, et de nombreux essais et répétitions doivent être effectuées pour assurer le sauvetage virale...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Culture de tissus&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cellules de rein de hamster de laboratoire (BSRT7)</td><td>disponibles sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>disponible sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmides pN, pP, pl</td><td>disponibles sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture de 60 mm traitée pour culture cellulaire (TC)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire rectangulaire incliné de 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; avec bouchon ventilé</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Milieu : DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M, pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>SFB : sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Seringue : seringue Luer-Lock de 5 ml</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour seringue</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI : PEI linéaire haute puissance</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Centrifugation virale&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Système de filtration sous vide avec tube de 150 ml Corning, pore de 0,45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d'ultracentrifugation fins, ultra-transparents, 38,5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur SW28 pour ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Injection chez la souris&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Micro-pipettes capillaires</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrôleur à quatre canaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Moteur de banc M.TXB avec commande au cadran C.EMX-1, 115 volts</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>Manche H.10, changement rapide</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Foret progressif, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Support de micro&amp;#8211;électrode</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d'injection de calibre 30</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique protectrice</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Iode</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Outils de chirurgie et de dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinces standard</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort de Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Manche de bistouri</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de bistouri</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Fils de suture</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection et coloration par anticorps&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de âne</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Anticorps&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anticorps</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-poulet Dylight 488 de âne</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-poulet Alexa Fluor 647 de âne</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montage des tissus&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Couverglasses 22 x 22, épaisseur 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Réactif antifade Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Les méthodes classiques d&#39;étude des circuits neuronaux débit assez faible. Transsynaptique virus, en particulier la pseudo-rage (PRV) et le virus de la rage (RABV), et plus récemment virus de la stomatite vésiculaire (VSV), pour l&#39;étude des circuits, est de plus en plus populaire. Ces méthodes à utiliser plus les virus qui transmettent entre les neurones, soit la direction antérograde ou rétrograde. Récemment, un RABV modifié pour monosynaptique rétrograde traçage a été développé. (Figure 1A). Dans cette méthode, la glycoprotéine (G), le gène est supprimé à partir du génome viral, et réapprovisionné seulement dans les neurones cibles. Spécificité infection est obtenue en substituant une chimère G, composé du domaine extracellulaire de la glycoprotéine ASLV-A et le domaine cytoplasmique de la RABV-G (A RG /), pour la normale RABV-G 1. Cette chimère G infecte spécifiquement les cellules exprimant le récepteur TVA 1. Le gène codant pour la TVA peut d étéelivered par diverses méthodes 2-8. Après RABV-G infection d&#39;un neurone TVA exprimant, le RABV peut transmettre à d&#39;autres neurones, synapses connectées dans un sens rétrograde par la nature de son propre G qui était co-délivré avec le récepteur TVA. Cette technique qualifie un nombre relativement important d&#39;entrées (10.05%) 2 sur un type cellulaire défini, la fourniture d&#39;un échantillon de toutes les entrées sur un type cellulaire défini démarreur. Nous avons récemment modifié cette technique à utiliser VSV comme un traceur transsynaptique 9. VSV a plusieurs avantages, notamment la rapidité de l&#39;expression des gènes. Ici, nous détaillons un nouveau système de suivi à l&#39;aide virale utiles pour sonder les microcircuits avec une résolution accrue VSV. Alors que les stratégies originales publiées par Wickersham et al. 4 et Beier et al. 9 étiquetage de tous les permis de neurones qui projettent sur ​​un premier-infectés TVA exprimant des cellules, ici VSV a été conçu pour transmettre uniquement à la télévisionCellules exprimant A-(figure 1B). Le virus est d&#39;abord pseudotypés avec RABV-G pour permettre l&#39;infection des neurones en aval de TVA exprimant neurones. Après avoir infecté de cette première population de cellules, le virus ne peut infecter publié TVA cellules exprimant. Parce que la propagation virale transsynaptique est limitée à TVA cellules exprimant, la présence de l&#39;absence de connectivité de types de cellules définies peuvent être explorées avec une grande résolution. Un diagramme expérimental de ces expériences est montré dans la figure 2. Ici, nous montrons un circuit modèle, celui de la direction de la sélectivité dans la rétine de la souris. Nous examinons la connectivité des cellules amacrines starburst (ZSC) pour les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR).

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d&#39;intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Les méthodes classiques d'étude des circuits neuronaux présentent un débit assez faible. Les virus transsynaptiques, en particulier le virus de la pseudorage (PRV) et le virus de la rage...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mettre au point une nouvelle technique d'analyse des microcircuits dans le système nerveux central. Cette approche consiste tout d'abord à définir une population de neurones destinés à être infectés, en exprimant le récepteur TVA. Dans un deuxième temps, on injecte un virus transsynaptique dans le système nerveux central, qui infecte alors les neurones primaires choisis.Ensuite, le virus ne se propagera que de façon transsynaptique aux neurones connectés qui expriment le récepteur TVA. Afin de vérifier si ces neurones sont connectés, des résultats sont obtenus afin de démontrer que cette technique peut être utilisée pour analyser la microcircuitrie grâce à la validation de l'étiquetage de microcircuitries connexes connues. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'électrophysiologie et la microscopie réside dans le fait qu'il s'agit d'une méthode à haut débit permettant d'analyser la circuitrie neuronale.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en lisant la première étude sur le traçage viral mono-synaptiquement restreint par Wickersham et ses collègues. Nous avons estimé que les virus pourraient être davantage modifiés par ingénierie afin d'étudier les neurones connectés de manière nouvelle. Veuillez consulter le protocole écrit pour des détails sur la récupération du VSV à partir de l'ADNc en utilisant le système VACCINIA T7 afin de générer des cellules destinées au passage.Aspirer tout d'abord le milieu de quatre plaques de 10 centimètres contenant des cellules TV800 à 80 % de confluence, ensemencées la veille, puis les remplacer par cinq millilitres de DMEM non supplémenté. Transfecter chaque plaque avec cinq microgrammes du plasmide codant pour la glycoprotéine choisie, selon les procédures standard. Environ six heures après la transfection, remplacer le milieu par du DMEM supplémenté avec 10 % de SBF, puis incuber les plaques toute la nuit dans une étuve à culture cellulaire réglée à 34 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, afin de permettre l'expression et l'accumulation à la surface cellulaire de la glycoprotéine.Après l'incubation, aspirez le milieu et remplacez-le par cinq millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS, puis infectez chaque plaque avec un VSV portant la glycoprotéine chimérique MA rabies G à une multiplicité d'infection de 0,01 à 0,1, et incubez à 34 degrés Celsius pendant la nuit. Vingt-quatre heures plus tard, vérifiez les niveaux d'infection de chaque plaque par microscopie à fluorescence. Si plus de 50 % des cellules ont été infectées, récupérez le milieu.Remplacer par cinq millilitres de milieu frais, puis congeler le milieu recueilli à moins 80 degrés Celsius. Répéter la procédure de prélèvement 24 heures plus tard pendant trois jours, pour un total de quatre jours de collecte. Congeler chaque aliquot de milieu recueilli après que le dernier aliquot soit complètement congelé à moins 80 degrés Celsius, bien que tous les aliquots de milieu recueilli soient à 37 degrés Celsius à ce stade, il devrait y avoir 80 millilitres de milieu recueilli, que l'on fait passer à travers des filtres de 0,45 micron sur de la glace.Ensuite, aliquoter 36 millilitres de virus dans un tube de centrifugeuse Beckman et concentrer le surnageant par ultracentrifugation à 80 000 ×g pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius. Veiller à ce que le rotor soit correctement équilibré après la centrifugation, puis compter dans un récipient contenant 10 % d'eau de Javel et utiliser un aspirateur pour éliminer le liquide sur les parois du tube. Ensuite, agiter les tubes contenant le virus à 120 tr/min pendant une heure à quatre degrés Celsius et resuspendre le culot viral dans le volume le plus faible possible, généralement d’environ 30 microlitres.Une fois le virus remis en suspension, resserrer le virus en infectant une plaque de 24 puits de cellules 293T avec une série de dilutions décimales allant de un à un million, puis déterminer la titration environ deux jours après l'infection. Selon les procédures standard, les cellules infectées par le virus peuvent être détectées par fluorescence. Il est important d'utiliser la bonne molette pour ces expériences.L'objectif est d'obtenir l'expression du récepteur TVA dans les types cellulaires que l'on souhaite cartographier. Cela peut être réalisé par l'expression du récepteur TVA par des moyens viraux ou par l'intermédiaire d'un allèle transgénique. Cette expérience utilise des souris triple transgéniques âgées de six à dix semaines.Des souris exprimant un allèle conditionnel TVA seront croisées avec des souris exprimant un allèle chat, Cree. Ensuite, ces souris ont été croisées avec une lignée exprimant un allèle fluorescent TD tomato. La souris transgénique finale exprime TVA et un allèle conditionnel TD tomato dans toutes les cellules exprimant Cree, y compris les cellules omicron en étoile d'intérêt.Cette expression peut être visualisée à l'aide de la microscopie à fluorescence. Vérifiez les coordonnées stéréotaxiques de la région d'intérêt dans un atlas du cerveau de souris et préparez l'appareil stéréotaxique en allumant le contrôleur du micro-injecteur et en positionnant le piston et le porte-électrode. Ensuite, remplissez la seringue avec de l'huile minérale afin de créer une interface avec le virus, puis placez la seringue sur le piston en veillant à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans l'aiguille.Prélevez le virus et placez-le sur de la glace. Réglez le micro-injecteur sur la fonction de retrait et déplacez le tube contenant le virus sous la capillarité du micro-injecteur. Abaissez l'extrémité de la capillarité dans le virus et aspirez la quantité nécessaire de virus pour l'expérience.Après l'administration d'une dose préopératoire de buprénorphine, l'animal est correctement anesthésié conformément aux directives institutionnelles. Effectuez une pression sur l'orteil et vérifiez l'absence de réponse réflexe. Avant de commencer la procédure.Placer la souris anesthésiée sur un coussin chauffant fixé sur un support mobile permettant de positionner la souris. Appliquer une pommade ophtalmique afin d'éviter le dessèchement de la cornée pendant que l'animal est anesthésié. Ensuite, placer la souris dans l'appareil stéréotaxique en insérant délicatement les tiges auriculaires dans le conduit auditif.Veillez à ce que la tête soit parallèle à la base du stéréotaxique et ne se déplace pas latéralement. Ensuite, ajustez la barre d'occlusion afin de stabiliser la tête. Retirez le pelage dans la zone de l'incision.Ensuite, lavez cette zone trois fois avec de l'éthanol, puis trois fois avec de l'iode. Après avoir pratiqué une incision sagittale dans la peau à l'aide d'une paire de ciseaux afin de découvrir le crâne, repoussez la peau à l'aide de crochets chirurgicaux maison. Ensuite, aspirez le microcapillaire avec du bgma et utilisez les molettes pour déplacer le microinjecteur jusqu'aux coordonnées du noyau géniculé latéral.Une fois que le GLN a été localisé, percer un petit trou dans le crâne au niveau du site d'injection. Placer la capillarité au-dessus du trou et l'abaisser lentement jusqu'à une position juste dorsale par rapport à la surface du cerveau. Il s'agit de la position zéro de la coordonnée dorso-ventrale.La microcapillaire doit être suffisamment fine pour percer la dure-mère de la souris. Abaissez-la donc lentement jusqu'à une profondeur de 2,75 millimètres et injectez la quantité requise de virus à une vitesse d'environ 100 litres par minute. Laissez l'aiguille en place dans le cerveau pendant environ sept minutes afin de permettre la diffusion du virus à partir du site d'injection et d'empêcher le virus de remonter le long de l'aiguille.Tirer lentement, sur une période de deux minutes, puis retirer l’aiguille du site d’injection et du cerveau. Finalement, suturer le site chirurgical et surveiller les animaux jusqu’à leur réveil complet de l’anesthésie. Administrer de la buprénorphine toutes les 12 heures pendant deux jours.En général, la propagation transsynaptique du VSV peut être observée environ 24 heures après l'injection. Toutefois, des délais d'attente plus longs entraîneront une diffusion plus importante. Après avoir euthanasié la souris par inhalation de dioxyde de carbone, disséquer l'œil et le placer dans du formaldéhyde à 4 %, puis incuber pendant une heure, en veillant à ce que l'œil reste immergé.Transférez ensuite l'œil dans une boîte de Pétri contenant du PBS. Utilisez une paire de pinces n°55 pour retirer rapidement la cornée, puis desserrez et disséquez la rétine des autres tissus. Analyse en préparation tout entier.Couper la rétine sur une lame en verre afin qu'elle s'étale à plat. Placer des entretoises en silicone autour des bords de la lame en verre, fixer avec un milieu de montage doré prolongé, puis couvrir avec une lame à couvre-objet de zéro épaisseur pour l'analyse des sections de rétine. Placer la rétine dans du saccharose à 30 % dans du PBS jusqu'à ce que la rétine s'immerge complètement.Ensuite, placer la rétine dans un mélange constitué d'un rapport un pour un de OCT et de solution de saccharose à 30 % pendant trois heures. Enfin, congeler rapidement la rétine et la conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elle soit prête à être coupée en sections. Cette image montre une expérience cinétique démontrant l'infectiosité des cellules TVA 800 et des cellules 2 9 3 T par le VSV A/rg.Les panneaux supérieurs montrent les cellules TVA 800 à six heures, un jour et deux jours après l'infection. Les panneaux inférieurs montrent les cellules 293T aux mêmes points de temps. Le virus se propage entre les cellules exprimant TVA en quelques heures, tandis que la propagation sur les cellules 293T, qui n'expriment pas le récepteur TVA, bien qu'elle se produise, est beaucoup plus lente.L'échelle représente 100 microns. Cette image montre une infection représentative des cellules ganglionnaires de la rétine chez des souris ne présentant pas d'expression de TVA. Les animaux ont été injectés dans le corps genouillé latéral avec le virus vsv A barre oblique RG.Simulation effectuée avec R-A-B-V-G et le tissu a été prélevé deux jours après l'injection. Une infection clairsemée est observée ici, les cellules ganglionnaires de la rétine étant indiquées par la flèche jaune. Cette image montre une infection plus dense.Cela peut être obtenu avec un indice de transmission (TI) viral plus élevé et une injection de bonne qualité, comme illustré ici. Différents types de cellules ganglionnaires rétiniennes peuvent être identifiés selon leur morphologie, notamment les cellules ganglionnaires à arborisation fine, les cellules ganglionnaires mélanopsines de type un, les cellules ganglionnaires sélectives à la direction ou DS GCs, ainsi que les cellules on off DS GCs. Ici, l'échelle représente 50 microns, comme indiqué dans les images suivantes provenant d'une souris exprimant TVA.La transmission de VSVA vers RG à partir des cellules ganglionnaires DS on-off vers les cellules en amas étoilées suit le schéma attendu. Les cellules ganglionnaires DS on-off indiquées par une flèche blanche, remplies en vert, transmettent le virus à plusieurs cellules en amas étoilées indiquées par une flèche jaune. Comme on le voit ici, toutes les cellules vertes qui ne sont pas des cellules ganglionnaires DS portent une double étiquette avec le marqueur Cree, indiquant qu'il s'agit de cellules en amas étoilées exprimant TVA.Les cellules ganglionnaires de la DS indiquées par des flèches blanches à remplissage vert et les omiques en étoile indiquées par des flèches jaunes stratifient les couches appropriées de la couche plexiforme interne de la rétine, ou IPL ; les cellules auxquelles le virus se transmet comprennent à la fois les cellules on et off. Omique en étoile. Les chiffres de cette figure indiquent les couches de l’IPL. Une fois maîtrisé, l’ensemble de l’expérience peut être réalisé en un ou deux jours si elle est effectuée correctement.La rapidité du VSV constitue l'un de ses principaux avantages après cette procédure. D'autres méthodes, telles que la cartographie de circuits basée sur le canal rouge ou sur l'opsine, peuvent être réalisées afin de valider le traçage viral des circuits et d'analyser les propriétés de ces connexions synaptiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la plupart des étapes différentes impliquées dans le traçage viral des circuits, depuis la culture du virus jusqu'à l'injection in vivo, en passant par l'analyse des neurones marqués par fluorescence.

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