Name: Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Découvrez une méthode de traçage viral trans-synaptique utilisant le récepteur TVA pour analyser la microcircuitrie neuronale dans le système nerveux central. Cette technique offre une analyse à haut débit des connexions synaptiques.

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Nous tenons à remercier Sean Whelan de l&#39;aide pour sauver variantes VSV recombinants, et Didem Goz et Ryan Chrenek pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par HHMI (CTC), et n ° NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Utilisation de virus pour étudier les circuits neuronaux est une méthode débit relativement élevé d&#39;analyser les neurones connectés. Cependant, générer à la fois des virions VSV et RABV n&#39;est pas trivial. Bien que le protocole ci-dessus pour le sauvetage du virus à partir d&#39;ADNc est fourni, il est toujours un événement à faible probabilité. Les niveaux de chacune des N, P et L plasmides doivent être finement ajusté, et de nombreux essais et répétitions doivent être effectuées pour assurer le sauvetage virale...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Culture de tissus&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cellules de rein de hamster de laboratoire (BSRT7)</td><td>disponibles sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>disponible sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmides pN, pP, pl</td><td>disponibles sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture de 60 mm traitée pour culture cellulaire (TC)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire rectangulaire incliné de 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; avec bouchon ventilé</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Milieu : DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M, pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>SFB : sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Seringue : seringue Luer-Lock de 5 ml</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour seringue</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI : PEI linéaire haute puissance</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Centrifugation virale&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Système de filtration sous vide avec tube de 150 ml Corning, pore de 0,45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d'ultracentrifugation fins, ultra-transparents, 38,5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur SW28 pour ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Injection chez la souris&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Micro-pipettes capillaires</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrôleur à quatre canaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Moteur de banc M.TXB avec commande au cadran C.EMX-1, 115 volts</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>Manche H.10, changement rapide</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Foret progressif, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Support de micro&amp;#8211;électrode</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d'injection de calibre 30</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique protectrice</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Iode</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Outils de chirurgie et de dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinces standard</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort de Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Manche de bistouri</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de bistouri</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Fils de suture</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection et coloration par anticorps&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de âne</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Anticorps&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anticorps</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-poulet Dylight 488 de âne</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-poulet Alexa Fluor 647 de âne</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montage des tissus&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Couverglasses 22 x 22, épaisseur 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Réactif antifade Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Les méthodes classiques d&#39;étude des circuits neuronaux débit assez faible. Transsynaptique virus, en particulier la pseudo-rage (PRV) et le virus de la rage (RABV), et plus récemment virus de la stomatite vésiculaire (VSV), pour l&#39;étude des circuits, est de plus en plus populaire. Ces méthodes à utiliser plus les virus qui transmettent entre les neurones, soit la direction antérograde ou rétrograde. Récemment, un RABV modifié pour monosynaptique rétrograde traçage a été développé. (Figure 1A). Dans cette méthode, la glycoprotéine (G), le gène est supprimé à partir du génome viral, et réapprovisionné seulement dans les neurones cibles. Spécificité infection est obtenue en substituant une chimère G, composé du domaine extracellulaire de la glycoprotéine ASLV-A et le domaine cytoplasmique de la RABV-G (A RG /), pour la normale RABV-G 1. Cette chimère G infecte spécifiquement les cellules exprimant le récepteur TVA 1. Le gène codant pour la TVA peut d étéelivered par diverses méthodes 2-8. Après RABV-G infection d&#39;un neurone TVA exprimant, le RABV peut transmettre à d&#39;autres neurones, synapses connectées dans un sens rétrograde par la nature de son propre G qui était co-délivré avec le récepteur TVA. Cette technique qualifie un nombre relativement important d&#39;entrées (10.05%) 2 sur un type cellulaire défini, la fourniture d&#39;un échantillon de toutes les entrées sur un type cellulaire défini démarreur. Nous avons récemment modifié cette technique à utiliser VSV comme un traceur transsynaptique 9. VSV a plusieurs avantages, notamment la rapidité de l&#39;expression des gènes. Ici, nous détaillons un nouveau système de suivi à l&#39;aide virale utiles pour sonder les microcircuits avec une résolution accrue VSV. Alors que les stratégies originales publiées par Wickersham et al. 4 et Beier et al. 9 étiquetage de tous les permis de neurones qui projettent sur ​​un premier-infectés TVA exprimant des cellules, ici VSV a été conçu pour transmettre uniquement à la télévisionCellules exprimant A-(figure 1B). Le virus est d&#39;abord pseudotypés avec RABV-G pour permettre l&#39;infection des neurones en aval de TVA exprimant neurones. Après avoir infecté de cette première population de cellules, le virus ne peut infecter publié TVA cellules exprimant. Parce que la propagation virale transsynaptique est limitée à TVA cellules exprimant, la présence de l&#39;absence de connectivité de types de cellules définies peuvent être explorées avec une grande résolution. Un diagramme expérimental de ces expériences est montré dans la figure 2. Ici, nous montrons un circuit modèle, celui de la direction de la sélectivité dans la rétine de la souris. Nous examinons la connectivité des cellules amacrines starburst (ZSC) pour les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR).

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d&#39;intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Les méthodes classiques d'étude des circuits neuronaux présentent un débit assez faible. Les virus transsynaptiques, en particulier le virus de la pseudorage (PRV) et le virus de la rage...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mettre au point une nouvelle technique d'analyse des microcircuits dans le système nerveux central. Cette approche consiste tout d'abord à définir une population de neurones destinés à être infectés, en exprimant le récepteur TVA. Dans un deuxième temps, on injecte un virus transsynaptique dans le système nerveux central, qui infecte alors les neurones primaires choisis.Ensuite, le virus ne se propagera que de façon transsynaptique aux neurones connectés qui expriment le récepteur TVA. Afin de vérifier si ces neurones sont connectés, des résultats sont obtenus afin de démontrer que cette technique peut être utilisée pour analyser la microcircuitrie grâce à la validation de l'étiquetage de microcircuitries connexes connues. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'électrophysiologie et la microscopie réside dans le fait qu'il s'agit d'une méthode à haut débit permettant d'analyser la circuitrie neuronale.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en lisant la première étude sur le traçage viral mono-synaptiquement restreint par Wickersham et ses collègues. Nous avons

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