L'utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

L’objectif de la procédure suivante est de démontrer comment maintenir les lysosomes de deux types d’échantillons, des embryons de souris et des cellules souches différenciées avec un colorant lyo tracker pour détecter les modèles de mort cellulaire. Pour préparer des échantillons d’embryons, les embryons sont d’abord isolés chirurgicalement et placés dans une boîte pour préparer des cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires sont utilisées pour créer des corps embryonnaires.

Ces corps embryonnaires sont cultivés en suspension, puis cultivés en monocouche sur une lame de chambre. Les embryons vendus tous monocouches peuvent être incubés dans ot tracker red et sont ensuite rincés et des échantillons fixés peuvent ensuite être photographiés pour examiner et quantifier les résultats de coloration obtenus qui montrent Liso Tracker. La coloration est une procédure simple qui peut être utilisée pour tester la mort cellulaire programmée dans les embryons et les cellules cultivées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’analyse tunnel est que, comme le colorant OT tracker est une petite molécule, les tissus épais peuvent être dosés rapidement et facilement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des modèles de mort cellulaire programmée dans les embryons de souris et les cultures différenciées, elle peut également être appliquée à d’autres types de tissus tels que les embryons de poulet et les cellules souches adultes différenciantes. Associez les jeunes souris femelles à un mâle étalon et, les matins suivants, vérifiez la présence d’un bouchon vaginal, ce qui indique que l’accouplement a eu lieu.

Midi le jour de l’apparition du plug vaginal est effectivement de 0,5 jour. Après le cotus le jour embryonnaire d’intérêt, euthanasiez la femelle selon les protocoles approuvés et retirez l’utérus dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec le BSS de Hank et rincez tout sang. Séparez les embryons et retirez-les de l’utérus.

Retirez les membranes embryonnaires supplémentaires et faites au moins un rinçage avec le BSS de Hank pour éliminer les tissus étrangers et le sang. Gardez les embryons disséqués sur de la glace pendant le nettoyage. Les autres.

Préparez cinq millilitres de solution de coloration d’embryon Liso tracker. Il s’agit d’un volume suffisant pour une ou deux collections d’embryons. Mélangez doucement la solution pour disperser le colorant, puis transférez les embryons dans la solution et incuberez-les à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Après l’incubation, rincez doucement les embryons dans le BSS de Hank quatre fois pendant cinq minutes à chaque lavage. Il est important de faire les rinçages doucement afin de ne pas endommager les tissus. Retirez le liquide en faisant lentement attention à l’endroit où se trouvent les embryons délicats et en laissant toujours une partie du liquide derrière eux pour les couvrir.

Fixez ensuite les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit du lendemain. Rincez les embryons une fois dans le BSS de Hank pendant 10 minutes pour éliminer le fixateur. Maintenant, déshydratez les tissus à travers une série de méthanol pour éliminer les taches de fond.

Cette étape améliore le rapport signal/bruit lors de l’imagerie avant le stockage. Si nécessaire, prélevez un échantillon de tissu de chaque embryon pour une analyse génétique. Plus tard, réhydratez l’échantillon de tissu avant le génotypage.

Séparez les embryons dans des tubes individuels avec des étiquettes qui correspondent à l’échantillon de tissu. Maintenant, il est possible de stocker indéfiniment les embryons isolés dans du méthanol de moins 20 degrés Celsius. Protégé de la lumière.

Commencez par préparer les corps d’embryons par la méthode de la goutte suspendue. Avec une densité de départ de 500 cellules par goutte de 20 microlitres après trois jours, transférez les corps embryonnaires dans des cultures en suspension sur des boîtes de Pétri non adhérentes de 10 centimètres. Cultivez-les pendant cinq jours, en changeant de média tous les deux jours après cinq jours.

Transférez les corps embryonnaires dans des lames gélatinisées à huit chambres, en plaçant un ou deux corps embryonnaires dans chaque chambre. Cultivez les corps embryonnaires pendant encore 10 jours. En changeant le média tous les deux jours après 10 jours, aspirez doucement le média existant et ajoutez 300 microlitres de solution de coloration cellulaire Lyo tracker dans chaque chambre.

Veillez à pipeter manuellement le support en plaçant la pointe de la pipette dans le coin de la chambre. De cette façon, vous ne retirerez pas accidentellement le, en fixant toujours chaque corps de la surface en verre. Lorsque vous rajoutez du support, placez la pointe de la pipette dans le coin de la chambre et remettez le support très lentement.

Incuber les chambres à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, rincez-les deux fois avec du DPBS pendant cinq minutes par rinçage. Fixez maintenant les cellules dans du paraldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante.

Retirez ensuite le fixateur avec DPBS en deux rinçages de cinq minutes. Pour monter les embryons, placez-les dans une lame de verre à dépression profonde ou une petite boîte de Pétri ou un bouclier infectieux. Préparez les échantillons de cellules pour la microscopie en aspirant le DPBS.

Retirez la chambre de la lame et laissez-la sécher à l’air libre pendant environ cinq minutes. Couvrir d’une feuille d’aluminium pour protéger le fluro. Ajoutez ensuite un support de montage aqueux tel qu’un bouclier vectoriel avec dappy et placez une lamelle de recouvrement sur le dessus.

La diapositive est maintenant montée et prête pour l’imagerie. Visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope à dissection ou d’un microscope composé équipé d’un filtre à tiges, d’un domine ou d’un filtre rouge Texas. La coloration est généralement assez brillante, de sorte que de longues expositions ne sont généralement pas nécessaires en mode manuel.

Prenez des photos numériques de tous les échantillons dans les mêmes conditions d’exposition. Pour quantifier les images, ouvrez-les dans Adobe Photoshop ou un programme d’imagerie similaire. Pour déterminer la quantité de coloration du tracker lyo, sélectionnez le canal rouge.

Notez le nombre de pixels de l’image entière tel qu’il est révélé par la fonction d’histogramme. Seuil suivant, l’image telle que la coloration rouge est maintenant représentée par des pixels blancs. Cela convertit l’image en noir et blanc.

Choisissez un niveau de seuil et utilisez-le pour toutes les images de l’ensemble. Sélectionnez les pixels blancs à l’aide de l’outil Gamme de couleurs et utilisez la fonction histogramme pour obtenir le nombre total de pixels blancs. Utilisez le canal bleu pour compter le nombre de noyaux sur le terrain.

Il peut être utile de garder une trace du décompte en annotant l’image, d’enregistrer les valeurs et de les utiliser pour calculer le niveau de coloration moyen par cellule. Répétez cette analyse avec le même paramètre de seuil pour toutes les images restantes. Pour échantillonner, ly o tracker a été utilisé pour colorer des embryons mutants de hérisson sonique.

Étant donné que ly O tracker est une petite molécule hautement diffusible, les zones profondes d’un embryon entier telles que colorées 10,5 jours après la mort cellulaire programmée ou PCG ont été considérablement augmentées chez les embryons mutants nuls de Sonic Hedgehog, en particulier dans les membres et les régions suivantes. Les bourgeons des membres ont été imagés dans des supports de trous à un grossissement plus élevé pour évaluer le motif global. Les parties disséquées ont également été sectionnées avec un microton vibrant.

La pointe de flèche indique une coloration accrue dans la pointe distale nulle du hérisson sonique dans les sections obtenues avec un cryostat La coloration en tunnel a été utilisée en conjonction avec OT Tracker dans ces tranches, bien qu’il n’y ait pas de corrélation stricte entre le tracker de lyo et la coloration tunnel, les régions générales de PCD se chevauchent considérablement sous un grossissement plus élevé. Il est possible de voir une ponction qui s’est colorée positivement avec le test du tunnel, mais pas la ponction de la matrice otra qui ne colore qu’avec la matrice de lyre et la ponction qui ont des colorations qui se chevauchent. Après 10 jours de culture corporelle embryonnaire, les cellules se sont différenciées en une variété de types de cellules, y compris les neurones, les cellules musculaires et les cardiomyocytes.

Dans la culture normale de cellules ES différenciées, il y a quelques cellules qui ont subi une PCD, comme détecté avec des tests de suivi et de tunnel lyo. Ensuite, les cellules ont été traitées avec du peroxyde d’hydrogène pour induire la mort cellulaire du stress oxydatif. Une faible dose de peroxyde d’hydrogène a augmenté à la fois la coloration lyo tracker et tunnel par rapport à l’absence de traitement.

Semblable aux résultats obtenus dans l’embryon, les deux colorations ont marqué des cellules communes et uniques. Une forte dose de peroxyde d’hydrogène a entraîné un rétrécissement cellulaire et une positivité plus généralisée du tracker et du tunnel OT. À titre de comparaison, la famine sérique a été utilisée pour induire l’autophagie après une heure de privation sérique.

La coloration du tracker OT a augmenté. Cependant, la positivité du tunnel est restée à des niveaux normaux. Ainsi, bien que le reer soit facile et utile, il est important de faire un suivi avec des tests supplémentaires pour déterminer si la coloration représente une apoptose ou une autophagie après que les échantillons ont été quantifiés.

En utilisant la méthode Photoshop simple démontrée précédemment, les résultats ont confirmé que l’augmentation des concentrations de peroxyde d’hydrogène entraînait un niveau plus élevé de coloration du suivi de lys. Une fois maîtrisée, cette procédure de coloration peut être effectuée en moins de deux heures si elle est effectuée correctement Après cette procédure. D’autres méthodes comme l’immunocoloration NX en cinq ou lc trois peuvent être effectuées afin de confirmer le type de mort cellulaire. N’oubliez pas qu’actuellement, le vert Trecker ne fonctionne que sur les cellules vivantes, donc le rouge Reca est votre meilleure option pour les échantillons qui nécessitent une fixation.