Name: Préparation d Drosophila Les neurones centraux pour In situ Patch de serrage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Apprenez à préparer les neurones moteurs de Drosophila pour des enregistrements patch clamp in situ. Cette méthode utilise le marquage GFP et la protéase pour améliorer l'accès électrophysiologique.

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<ol><li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker%2C+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li>
<li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248(2007).</li>
<li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li>
<li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li>
<li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation%2C+inactivation%2C+and+persistent+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li>
<li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-dependent+Ca2%2B+currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li>
<li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li>
<li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li>
<li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na%2B%2FK%2B+pump+current+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li>
<li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63(2006).</li>
<li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li>
<li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li>
<li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080(2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Lors de la visualisation des cellules avec des protéines fluorescentes comme la GFP, il est important de ne pas trop exposer la préparation à trop de lumière. Il peut en résulter des dommages photo. Nous utilisons 100W HBO ampoules au mercure à arc court pour l&#39;éclairage, et nous utilisons aussi de densité neutre (ND) de 0,8 (filtres ND Chroma 0,3 et 0,5). Pour être en mesure de juger de la qualité de la visibilité de nettoyage efficace est primordial. Par conséquent, les filtres ND peut être retiré pour de courtes ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agent / article </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Protéase de type XIV </td><td> Sigma Aldrich USA </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Microfil aiguille d&#39;injection flexible </td><td> Mondiale Precision Instruments USA </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> Borosilicate Glass capillaires, od 1,5 mm, 1,0 mm id, pas de filament </td><td> Mondiale Precision Instruments USA </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Invitrogen USA </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Élastomère Sylgard Kit 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELAST KIT </td></tr><tr><td> Ensemble filtre ND (non montés) </td><td> Chroma </td><td> Série 22000b </td></tr><tr><td> Porte-électrode 1-HL-U </td><td> MoPériphériques intramoléculaires </td><td> HL-1-U </td></tr></tbody></table>

préparation d&#39;<em&gt; drosophila</em&gt; les neurones centraux pour<em&gt; in situ</em&gt; patch de serrage

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Temps de génération courts et faciles techniques génétiques faire la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster un excellent modèle génétique dans la recherche en neurosciences fondamentales. Les canaux ioniques sont la base de tout comportement depuis qu&#39;ils médiation excitabilité neuronale. Le canal d&#39;ions première tension fermée cloné était la tension Drosophila canaux potassiques Shaker 1,2 fermée. La compréhension du rôle des canaux ioniques et excitabilité membranaire pour la fonction du système nerveux, il est utile de combiner puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile in situ avec des enregistrements de patch-clamp. Pendant de nombreuses années ces enregistrements ont été entravés par la petite taille du SNC chez la drosophile. En outre, une gaine robuste en cellules gliales et de collagène constituent des obstacles pour l&#39;accès pipette de patch pour les neurones centraux. La suppression de cette gaine est une condition préalable nécessaire pour les enregistrements de patch-clamp de toute neurone dans le SNC chez la drosophile adulte. Ces dernières années,les scientifiques ont été en mesure d&#39;effectuer in situ des enregistrements de patch-clamp de neurones dans le cerveau adulte et 3,4 cordon nerveux ventral embryonnaire de 5,6, 7,8,9,10 larves et adultes Drosophila 11,12,13,14. Une étable giga-joint est la principale condition préalable à un bon patch et dépend de contact net de la pipette de patch avec la membrane de la cellule pour éviter les courants de fuite. Par conséquent, pour toute cellule in situ des enregistrements de patch-clamp de neurones de drosophile adulte doivent être soigneusement nettoyés. Dans la première étape, la gaine ganglionnaire doit être traitée par voie enzymatique et enlevées mécaniquement de rendre les cellules cibles accessible. Dans la seconde étape, la membrane de la cellule doit être polie de façon qu&#39;aucune couche de matériau glie, le collagène ou d&#39;autres peuvent perturber giga-joint formation. Cet article décrit comment préparer un neurone central identifié dans le cordon nerveux ventral chez la drosophile, le motoneurone vol 5 (MN5 15), pour tout c somatiqueenregistrements ell patch clamp. Identification et visibilité du neurone est obtenue par l&#39;expression ciblée de la GFP dans MN5. Nous n&#39;avons pas pour but d&#39;expliquer la technique de patch-clamp lui-même.

Dans le patch situ enregistrements de serrage sont utilisés pour la caractérisation électrophysiologique des neurones dans les circuits intacts. Dans le modèle de la drosophile génétique patch-clamp est difficile, car le système nerveux central est petite et entourée d&#39;une gaine robuste. Cet article décrit la procédure pour retirer les neurones gaine et propre pour la suite des enregistrements de patch-clamp.

Préparation d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Les neurones centraux pour<em&gt; In situ</em&gt; Patch de serrage

Des temps de génération courts et des techniques génétiques simples font de la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster un excellent modèle génétique en neurosciences fondamentales...

L'objectif général de cette procédure est de préparer le motoneurone moteur de vol cinq de Drosophila pour des enregistrements en configuration « patch clamp » en C deux. Cette opération s'effectue en deux étapes. La première consiste à visualiser le cordon nerveux ventral de Drosophila, avec les motoneurones moteurs de vol marqués par la GFP allant de un à cinq, à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x. La deuxième étape consiste à utiliser une micropipette de « patch » brisée et remplie de protéase afin d'appliquer la protéase sur les motoneurones marqués par la GFP, dans le but de détacher les débris, la glie et la trachée qui entravent l'accès au motoneurone moteur cinq.Ensuite, les débris, la glie et la trachée sont éliminés en aspirant délicatement les débris et la glie détachés dans la pipette, tout en retirant la trachée à l’aide d’une pression positive et négative. Alternativement, à ce stade, une lumière vive est utilisée pour éliminer les débris résiduels invisibles sous lumière fluorescente à travers un filtre GFP. En fin de compte, le cinquième neurone moteur nettoyé peut être vu faiblement en lumière vive, mais est bien visible en utilisant la lumière flu

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Recherche

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Neuroscience

Neurosciences

Cette technique expose les neuromusculaire Drosophila embryonnaire pour l'immunohistochimie ou l'enregistrement électrophysiologiques. Il est utile pour étudier les événements précoces de développement neuromusculaire ou d'effectuer l'électrophysiologie dans des mutants qui ne peuvent pas éclore.

La récolte et la préparation Drosophile Les embryons destinés à l&#39;enregistrement électrophysiologique et autres procédures

Enregistrements électrophysiologiques...

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Nous décrivons la procédure pour préparer...

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

La vidéo démontre l'enregistrement de l'activité électrique dans les neurones photorécepteurs de l'ommatidium de la drosophile en établissant une configuration de cellule entière. Il met en évidence l’activation des canaux potentiels des récepteurs transitoires par des impulsions lumineuses, ce qui entraîne des bosses quantiques mesurables.

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Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique.

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l&#39;état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.

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Les enregistrements de cellules entières des photorécepteurs de Drosophila melanogaster permettent de mesurer des bosses sombres spontanées, des bosses quantiques, des réponses macroscopiques à la lumière et des relations courant-tension dans diverses conditions. En combinaison avec des outils de manipulation génétique de D. melanogaster, cette méthode permet d’étudier la voie de signalisation inositol-lipidique ubiquitaire et sa cible, le canal TRP.

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Courants synaptiques sont enregistrables circonscrits de visualisé boutons synaptiques à la jonction neuromusculaire Drosophila troisième stade larvaire des larves. Cette technique permet la surveillance de l’activité d’un seul bouton synaptique.

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Cet article propose une méthode pour tester les connexions monosynaptiques entre neurones en employant la tétrodotoxine et canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac.

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Apprenez à préparer les neurones moteurs de Drosophila pour des enregistrements patch clamp in situ. Cette méthode utilise le marquage GFP et la protéase pour améliorer l'accès électrophysiologique.

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