L'examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

L’objectif global de l’expérience suivante est d’examiner ton développement chez la souris par cytométrie en flux. Ceci est réalisé en préparant des suspensions unicellulaires à partir de la souris, du thymus et de la rate. Dans un deuxième temps, les thymocytes et les cytes sont colorés avec un cocktail d’anticorps pour l’identification de populations spécifiques de ces derniers.

En fin de compte, la fréquence et le nombre de différentes populations de lymphocytes peuvent être évalués par analyse cytométrique en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement des lymphocytes T, telles que les gènes et les voies importants pour générer un répertoire de lymphocytes T fonctionnels mais tolérants aux cellules. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement des lymphocytes T dans le thymus, elle peut également être appliquée à l’examen du développement d’autres cellules immunitaires.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à concevoir leurs cocktails d’anticorps pour la cytométrie en flux. Avant de commencer la dissection, placez un tamis stérile en acier dans une boîte de Pétri de 60 x 15 millimètres. Ajoutez ensuite cinq millilitres de HBSS dans le plat et conservez le plat sur de la glace pour récolter le thymus.

Tout d’abord, utilisez une paire de pinces pour soulever l’extrémité inférieure du sternum et révéler le diaphragme. Ensuite, en évitant le foie, coupez le diaphragme pour détacher la cage thoracique, puis coupez la cage thoracique vers le haut de chaque côté. Prendre soin d’éviter les poumons et le cœur.

Utilisez maintenant la pince pour tirer doucement la cage thoracique vers l’arrière. Le thymus est un organe blanc bilobé situé au-dessus du cœur. Utilisez le bord plat de la pince pour saisir le bas des lobes.

Ensuite, retirez doucement le thymus et placez-le sur l’un des tamis à mailles préalablement préparés. Pour prélever la rate, faites une incision à travers le péritoine pour exposer la cavité abdominale. La rate est un organe rouge en forme de planche de surf situé sur le côté gauche de la cavité abdominale de la souris sous le foie.

Ensuite, utilisez une paire de pinces pour retirer la rate et une autre pour retirer le tissu conjonctif. Placez ensuite la rate disséquée sur un tamis à mailles séparé. Utilisez maintenant le piston d’une seringue de trois millilitres pour broyer chaque organe dans son tamis jusqu’à ce qu’il ne reste plus que du tissu conjonctif et de la graisse, pipetez les cellules et HBSS dans un tube conique de 15 millilitres.

Rincez ensuite chaque maille avec du HBS S3 frais plusieurs fois. Ensuite, granulez les cellules pendant cinq minutes à 335 fois G et quatre degrés Celsius. Après avoir aspiré le résus surnageant, suspendez les cytes dans 500 microlitres d’un tampon de lyse CK pendant 10 minutes à température ambiante pendant que les globules rouges spléniques sont couchés Resus.

Suspendez les thymocytes à 20 fois 10 à six cellules par millilitre dans le tampon de télécopie et mettez-les de côté sur de la glace. Ajoutez maintenant cinq millilitres de HBSS pour ramener les cytes à l’isotonicité après avoir à nouveau fait tourner les cellules, suspendez la pastille sans globule rouge à 20 fois 10 à la sixième cellule par millilitre dans le tampon de télécopie. Commencez cette étape par Ali Watting.

Quatre fois 10 à la sixième des THYMOCYTES réservés par échantillon de cytométrie en flux dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez des cytes dans les puits d’une plaque à 96 puits pour les contrôles de compensation. Bloquez ensuite les récepteurs FC dans chacun des échantillons cellulaires par incubation avec de l’anti CD 1632 pendant 10 minutes sur de la glace.

Maintenant, faites tourner la plaque, puis dissipez le liquide des puits en jetant la plaque une fois face vers le bas dans un évier, puis suspendez chaque puits dans 200 microlitres de tampon de fax et répétez le lavage. Ensuite, incubez les échantillons expérimentaux avec 200 microlitres d’anticorps cocktail ou d’anticorps conjugués uniques au fluorochrome pour les contrôles de compensation. Tout en tampon de fax sur la glace dans l’obscurité.

Après 30 minutes, lavez les cellules deux fois avec un tampon de télécopie, puis après avoir suspendu les cellules dans le tampon de télécopie, transférez les échantillons dans des tubes de télécopie dans des modèles transgéniques TCR physiologiques et des souris de type sauvage. La sélection positive commence à l’étape lumineuse double positive avant de passer à l’étape terne double positive. Après que l’antigène rencontre les thymocytes ternes double positif, puis entre dans un CD de transition de quatre CD positifs huit de stade bas avant de devenir CD quatre.

Huit thymocytes simples positifs matures Les thymocytes simples positifs sont caractérisés par une expression TCR élevée et une perte de CD 24. Alors que le profil du CD huit par le CD quatre peut révéler des défauts de sélection positive, l’examen du TCR bêta par le CD 69 ou le CD cinq peut fournir un aperçu supplémentaire de l’emplacement du défaut. Le CD 69 et le CD 5 sont tous deux régulés à la hausse après la stimulation TCR, avec des interactions plus fortes entraînant une expression plus élevée de ces marqueurs.

Dans ce graphique TCR bêta par CD 69 chez une souris de type sauvage, la démarche TCR R bêta faible CD 69 négative représente une population de thymocytes double positifs pré-sélectionnés. Alors que ce TCR bêta-intermédiaire, CD 69 positive représente, une population transitionnelle directement après l’engagement du TCR et se compose de deux positifs brillants avec quelques doubles positifs ternes et CD, quatre positifs CD, huit cellules basses. Ici, la démarche positive TCR R bêta élevée CD 69 illustre la population de cellules directement post-sélection positive, qui se compose de cellules CD quatre positives doubles, quatre cellules positives négatives, quatre cellules basses et quatre cellules positives simples.

Enfin, cette démarche TCR bêta élevée CD 69 négative montre une population de cellules plus matures qui se compose principalement de cellules CD quatre et CD huit simples positives. L’absence de CD 69 positif pour l’intermédiaire TCR R bêta et de CD 69 positif pour TCR R bêta élevé peut être révélatrice d’une altération des changements de sélection positifs dans le rapport entre le CD quatre simple positif et le CD huit. Des cellules positives uniques au sein de la population TCR bêta élevée CD 69 négative peuvent suggérer des altérations de l’engagement de la lignée.

La perte des populations TCR bêta élevé CD 69 positif et TCR bêta élevé CD 69 négatif peut refléter des problèmes de survie après une sélection positive. L’examen de la bêta du TCR par le CD cinq est une autre stratégie pour identifier les populations de sélection pré et post positives. Ces deux premières populations sont principalement constituées de thymocytes brillants doublement positifs.

La population TCR bêta faible CD cinq faible représente la présélection des thymocytes double positif, et la population intermédiaire TCR bêta CD cinq intermédiaire est composée des cellules qui initient la sélection positive. Une génération altérée de cette population ou de la population précédente suggère une sélection positive défectueuse. La population TCR R bêta intermédiaire CD cinq élevée, cependant, représente des thymocytes en cours de sélection positive et se compose principalement de double positif terne et de CD quatre positif.

CD huit thymocytes bas. La population TCR bêta high CD five high se compose principalement d’une sélection post-positive. Changements des thymocytes positifs uniques dans le rapport entre le CD quatre, le positif unique et le CD huit.

Des cellules positives uniques au sein de cette population, malgré des populations précédentes normales, peuvent suggérer des altérations de l’engagement de la lignée. De plus, l’absence de cette population peut indiquer une diminution de la survie des thymocytes après une sélection positive, car la sélection négative implique la suppression de petites populations spécifiques de l’antigène. Les défauts de ce processus sont mieux observés en utilisant des souris transgéniques TCR dans HY CD quatre souris thymocytes exprimant le H-Y-T-C-R transgénique peuvent être détectés avec l’anticorps monoclonal T 3.7.

LE H-Y-T-C-R reconnaît l’antigène HY spécifique mâle présenté dans la classe un db du CMH. Ainsi, les souris mâles HY CD quatre subissent une sélection négative de thymocytes H-Y-T-C-R positifs, comme l’indique une réduction du nombre de THYMOCYTES T trois virgule 70 positif, et une diminution plus spectaculaire du nombre de THYMOCYTES T 3,7 positifs. En revanche, les souris femelles HY CD quatre subissent une sélection positive pour générer des lymphocytes T 3,7 positifs pour CD et huit lymphocytes T positifs uniques.

Alors qu’une réduction du nombre de thys double positif est indicative d’une sélection négative, l’absence de thymocytes positifs simples spécifiques à l’antigène est la mesure la plus précise. Un examen plus approfondi des quelques thymocytes T trois virgule 70 positifs chez quatre souris mâles HY CD révèle que la plupart sont des cellules immatures à haute teneur en CD 24. Alors que la plupart des thymocytes T trois virgule 70 positifs chez les femelles HY CD quatre ont atteint la maturité et ont un faible taux de CD 24, ce qui fournit un soutien supplémentaire, cette sélection négative se produit chez les souris mâles HY CD 4.

Une mise en garde des modèles transgéniques TCR est qu’il est difficile de caractériser davantage la sélection positive en identifiant les populations basées sur l’expression du TCR et du CD 69 ou du CD cinq en raison de l’expression élevée du TCR tout au long du développement de votre CYTE, les souris femelles HY CD quatre ont une grande population de thymocytes T trois virgule 70 positifs double positifs qui subissent une sélection positive. Comme l’indique une augmentation de la population de CD 69 positive, par rapport au type sauvage, la sélection négative implique un stimulus TCR d’affinité plus élevé que la sélection positive. Ceci est indiqué par une expression plus élevée de CD 69 sur les thymocytes T trois virgule 70 positifs double positif chez les souris mâles HY CD, entraînant un décalage du pic de l’histogramme vers la droite.

Des tendances similaires sont observées avec l’expression de CD cinq lors de l’analyse de la sélection thymique chez les souris génétiquement manipulées. L’examen de l’expression de CD 69 ou de CD cinq peut déterminer si le défaut provient de la signalisation TCR ou d’un résultat en aval de la stimulation TCR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie pour la préparation et la coloration des cellules, plus une heure supplémentaire pour la collecte de données sur le cytomètre en flux.

Si elle est effectuée correctement, chaque souris supplémentaire ajoutera environ 30 minutes. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler les thymocytes avec douceur et de s’assurer que vous avez planifié la stratégie de coloration à l’avance. En suivant cette procédure.

D’autres tests, tels que des tests de destruction ou des tests de production de cytokines, peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le bon fonctionnement des thymocytes exportés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser le développement du site thymique à l’aide de la cytométrie en flux.