Name: Lexamen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Découvrez l'analyse du développement thymique par cytométrie en flux chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer les populations lymphocytaires et d'étudier les gènes impliqués dans la génération du répertoire T.

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Les auteurs tiennent à remercier Bing Zhang pour son aide technique. Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé (MOP-86595). TAB est un nouveau chercheur des IRSC et chercheur AHFMR. QH est soutenu par une bourse d&#39;études supérieures du Canada des IRSC - Doctorat et une AIHS à temps plein bourse. SAN est soutenu par une bourse de la Reine Elizabeth II d&#39;études supérieures. AYWS est soutenu par une bourse d&#39;études supérieures du CRSNG - Doctorat.

Reportez-vous à la figure 1 pour un schéma d&#39;ensemble du protocole expérimental. 1. Dissection <ol><li> Lieu écran stérile en maille d&#39;acier plat 60 x 15 mm Petri. Une unité est nécessaire pour chaque échantillon de tissu. </li><li> Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à chaque plat. Garder les plats sur la glace. </li><li> Euthanasier les souris avec du CO 2. </li><li> Souris fixe sur une surface de dissection, face ventrale vers le haut. Souris de pulvérisation avec de l&#39;éthanol 70% pour la stérilisation et à faire en sorte que la fourrure est emmêlée vers le bas. </li><li> Avec des ciseaux chirurgicaux, commencer la dissection en faisant une incision ventrale dans la peau de l&#39;abdomen juste au-dessus des organes génitaux. Étendre vers le haut incision sous le menton. </li><li> De la ligne médiane, de prolonger l&#39;incision le long de tous les membres. Tirez la peau lâche et épingler à la surface de dissection. </li><li> Récolter le thymus: <ol><li> Relever l&#39;extrémité inférieure du sternum pour faire une incision.</li><li> Éviter le foie, couper la membrane de détacher la cage thoracique, puis couper la cage thoracique de chaque côté. Couper vers le haut la cage thoracique de chaque côté, en prenant soin d&#39;éviter les poumons et le cœur. </li><li> Tirez doucement sur le dos cage thoracique avec une pince. Le thymus est un blanc, un organe bilobé situé au-dessus du cœur. En utilisant le côté plat de la pince pour saisir le fond des lobes, tirez doucement sur le thymus et le poser sur le tamis. </li></ol></li><li> Récolter la rate: <ol><li> La rate est un rouge, en forme de planche de surf organe situé sur le côté gauche de la cavité abdominale de la souris, en dessous du foie. </li><li> Faire une incision dans la cavité abdominale. Tirez doucement sur la rate avec une paire de pinces, en utilisant la deuxième paire de taquiner l&#39;écart du tissu conjonctif. Placer la rate sur un tamis à mailles séparé. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un piston d&#39;une seringue de 3 ml, meulerorganes dans le tamis jusqu&#39;à ce que le tissu conjonctif et les restes de graisse. Rincer avec du HBSS maille de la capsule trois fois. Utilisez un piston neuf pour chaque échantillon de tissu. <ol><li> D&#39;autres options pour l&#39;homogénéisation du tissu peut être utilisé à la place de cette méthode. </li></ol></li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Cellules par centrifugation à 335 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Splénocytes remettre en suspension dans 500 ul de tampon de lyse ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) pendant 10 min à température ambiante. Remettre les thymocytes à 20 x 10 6 cellules / ml dans du tampon FACS (PBS, 1% de FCS, de l&#39;azoture de sodium à 0,02%) et mis de côté sur la glace. </li><li> Retour splénocytes à l&#39;isotonie par addition de 5 ml de HBSS. Splénocytes par centrifugation et remettre en suspension à 20 x 10 6 cellules / ml dans du tampon FACS. Si les cellules ont besoin pour demeurer stérile, vous pouvez utiliser stérile du RPMI + 10% FCS. </li></ol> 3.Les cellules de coloration pour cytométrie en flux Le but de ce protocole est de définir des stratégies pour l&#39;analyse de la sélection positive et négative à l&#39;aide de type sauvage (WT) et cd4 HY souris. Pour des considérations générales sur la cytométrie en flux expérimental, l&#39;acquisition et l&#39;analyse, nous renvoyons le lecteur à une excellente revue par Tung et al 11. <ol><li> Aliquoter 4 x 10 6 thymocytes par échantillon cytométrie en flux à chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits, ainsi que 1 x 10 6 splénocytes par WT commande de compensation. Si vous utilisez des souris transgéniques, vous devez inclure une souris WT comme témoin dans votre expérience. </li><li> Bloquer les récepteurs Fc par incubation des cellules avec anti-CD16/32 (clone 2.4G2) pendant 10 min sur la glace. </li><li> Faites tourner la plaque à 335 xg à 4 ° C pendant 5 min. Retirer le couvercle et dissiper liquide des puits en tapotant la plaque une fois, face vers le bas dans un évier. Resuspendre chaque puits dans 200 ul de tampon FACS. Répéter le lavage. </li><li> Préparer des cocktails d&#39;anticorps indiquées ci-dessous, en utilisant la concentration optimale de chaque anticorps en fonction de la dilution dans 200 pi de tampon FACS par puits. La concentration optimale de chaque anticorps est définie comme la concentration minimale nécessaire pour obtenir la plus grande séparation des populations positives et négatives. S&#39;il n&#39;y a pas de population négative pour un anticorps donné, un anticorps isotype doit être inclus. Le volume total par puits peut être réduite (par exemple à 100 l par puits), si désiré. <ol><li> WT thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24 </li><li> Cd4 HY thymus: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24 Pour obtenir une meilleure séparation des lo CD69 et CD69 hi populations de thymocytes, il est recommandé un anticorps biotinylé anti-CD69 primaire servir, suivie d&#39;une tache secondaire contenant conjugué à un fluorochrome streptavidine. Nous usoi la même stratégie pour CD5 coloration. </li></ol></li><li> Incuber les cellules avec 200 pi de cocktail d&#39;anticorps dans un tampon de FACS pendant 30 min sur la glace dans l&#39;obscurité. </li><li> Parallèlement à coloration cocktail d&#39;anticorps, de la teinture chaque commande de compensation avec un seul anticorps conjugué à un fluorochrome. Idéalement, la coloration compensation implique que les mêmes anticorps utilisés dans le cocktail d&#39;anticorps. Cependant, la coloration pour chaque antigène individuel peut ne pas être possible pour les grandes expériences lors de nombreux antigènes sont en cours d&#39;analyse. Par conséquent, la coloration soit pour les anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 est recommandé en raison de la forte expression de ces antigènes, ou l&#39;utilisation de billes de rémunération. Colorer dans une mémoire tampon FACS pendant 30 min sur la glace dans l&#39;obscurité. Laissez une commande de compensation non colorées. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS. </li><li> Resuspendre les cellules dans du tampon FACS et transfert à tubes FACS. </li><li> Prélever des échantillons sur cytomètre de flux. Comprennent l&#39;acquisition de FSC-A et FSC-W à unllow de discrimination doublet. </li></ol> 4. Analyse des données de cytométrie en flux - Non-souris transgéniques TCR Nous utilisons FlowJo pour la cytométrie en flux analyse des données. Reportez-vous à la figure 2A de la stratégie de déclenchement pour les souris transgéniques non-TCR. <ol><li> Utilisation FSC-A par le SSC, portail électronique sur le &quot;lymphocytes&quot; de la population. </li><li> Dans le cadre du «lymphocytes» de la population, utiliser FSC-A par le FSC-W électroniquement la porte du FSC-W lo population d&#39;exclure doublets cellulaires et aggregrates. Il s&#39;agit de la «singulet» du portail. </li><li> Utilisation des événements dans le &quot;singlet&quot; porte, l&#39;intrigue CD8 par le CD4. Dessinez portes pour DN, DP terne, DP lumineux, CD4 + CD8 populations lo, CD4SP et CD8SP comme le montre la figure 2B. </li><li> Sous les portes CD4SP et CD8SP, créer TCRβ par CD24 parcelles. Utilisez l&#39;outil de déclenchement quadrant de tirer portes tel que représenté sur la figure 2C. </li><li> Créer un new complot de la &quot;singlet&quot; portail: TCRβ par CD69. Tirer portes A, B, C, D comme représenté sur la figure 2D. </li><li> Créer un nouveau complot de la &quot;singlet&quot; portail: TCRβ par CD5. Dessinez portes i, ii, iii, iv comme le montre la figure 2E. C&#39;est une autre stratégie pour l&#39;examen de sélection positive. </li><li> Appliquer DN, DP terne, DP lumineux, int CD4, CD4SP et CD8SP portes à partir de la rubrique «singulet» aux portes i, ii, iii, iv, A, B, C, D (figure 2D, E). </li><li> Calculer le nombre de cellules dans un sous-ensemble particulier en multipliant cellularité orgue de la fréquence de chaque porte subséquente jusqu&#39;à ce que vous atteignez votre population cible. Par exemple, le nombre de TCRβ hi-CD69 CD8SP thymocytes serait déterminée par le thymus cellularité x% TCR bhi CD69-(fraction D) CD8SP% x. <ol><li> Compter prend déjà en compte les cellules vivantes et mortes afin de ne pas inclure le lymphoc &quot;YTE «porte dans vos calculs. </li></ol></li></ol> 5. Analyse des données de cytométrie en flux - TCR des souris transgéniques Reportez-vous à la figure 3A pour la stratégie de déclenchement pour les souris transgéniques TCR. <ol><li> Suivez les étapes 4.1 et 4.2 comme dans la section précédente. </li><li> Dans le cadre du «singulet» porte, créez un T3.70 par parcelle SSC et porte sur le T3.70 + population de cellules à analyser spécifiques de l&#39;antigène des cellules T (figure 3B). Dans certaines circonstances, il peut être intéressant de comparer cette population à la non-specific antigen (T3.70-) population de cellules T. </li><li> Sein de la population T3.70 +, tirage DN, DP, CD4SP et CD8SP portes (figure 3C). <ol><li> Pour les échantillons de contrôle WT, dessiner ces portes sous la rubrique &quot;singulet&quot; portail ou créer un T3.70 porte car il y aura très peu de cellules T3.70 +. </li></ol></li><li> Sous la porte CD8SP, créer unT3.70 par CD24 parcelle. Utilisez l&#39;outil de déclenchement quadrant de diviser les cellules en quatre populations (figure 3F). </li><li> Créer un histogramme représentant superposée expression de CD69 dans le compartiment DP de souris WT et T3.70 + DP compartiment de souris cd4 HY (figure 4A). Répétez l&#39;opération pour examiner CD5 expression (figure 4B). </li><li> Calculer le nombre absolu de cellules dans chaque sous-ensemble d&#39;intérêt que dans 4,8. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole présenté ici peut être utilisé pour examiner sélection positive et négative dans le non-TCR transgénique et TCR des souris transgéniques. Ce protocole décrit la coloration des antigènes de surface. Pour une analyse plus approfondie des mécanismes moléculaires, il est souvent nécessaire d&#39;effectuer une coloration intracellulaire. Nous utilisons la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit pour la plupart des protéines intracellulaires et le kit de BD Biosciences coloration pour des facteurs de transcription ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> HyClone Hank solution saline équilibrée </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Tamis à mailles métalliques </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri (60 x 15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> Seringues (3 ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes coniques (15 ml) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Zeiss - Primo Star </td><td> 415 500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> HausserScientifique </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette multicanaux </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> AAP </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> IT Baker Chemical Co. </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif bloquant FcR </td><td></td><td></td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-souris HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-AA * </td><td> Clone T3.70 </td></tr><tr><td> Anti-souris CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-AA * </td><td> Clone RM4-5 </td></tr><tr><td> Anti-souris CD8a </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-AA * </td><td> Clone 53-6.7 </td></tr><tr><td> Anti-souris CD24 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-AA * </td><td> Clone M1/69 </td></tr><tr><td> Anti-souris TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-AA * </td><td> Clone H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-souris biotinylé CD69 </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-AA * </td><td> Clone H1.2F3 </td></tr><tr><td> Anti-souris biotinylé CD5 </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-AA * </td><td> Clone 53-7.3 </td></tr><tr><td> Streptavidine </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-AA * </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> BD Biosciences - FACS Canto </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tubes </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;analyse de cytométrie en flux </td><td> Treestar - FlowJo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XX varie selon le fluorochrome et YY varie selon la taille du flacon. </td></tr></tbody></table>

l&#39;examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Un système immunitaire sain nécessite que les cellules T répondent aux antigènes étrangers tout en restant tolérant aux antigènes du soi. Réarrangement aléatoire du récepteur des cellules T (TCR) α et β loci génère un répertoire de lymphocytes T avec la grande diversité dans la spécificité d&#39;antigènes, à la fois pour soi et étranger. Sélection du répertoire au cours du développement dans le thymus est essentiel pour générer sûrs et utiles lymphocytes T. Les défauts de la sélection thymique contribuer au développement de maladies auto-immunes et de l&#39;immunodéficience 1-4. Progéniteurs des cellules T entrez le thymus que double négatifs (DN) thymocytes qui n&#39;expriment pas CD4 ou CD8 co-récepteurs. L&#39;expression de la αβTCR et les deux co-récepteurs se produit à la double positif (DP) scène. L&#39;interaction de la αβTCR avec l&#39;auto-peptide-CMH (pMHC) présenté par les cellules thymiques détermine le sort de la thymocytes DP. Interactions de haute affinité conduire à une sélection négative et éliminationtion des matières autoréactives thymocytes. Faible affinité des interactions se traduisent par une sélection positive et le développement de CD4 ou CD8 simples positives (SP) des lymphocytes T capables de reconnaître des antigènes étrangers présentés par CMH du soi 5. La sélection positive peut être étudiée chez la souris avec un anticorps polyclonal (type sauvage) répertoire de TCR en observant la génération de cellules T matures. Cependant, ils ne sont pas idéales pour l&#39;étude de la sélection négative, ce qui implique la suppression de petites populations spécifiques de l&#39;antigène. De nombreux systèmes modèles ont été utilisés pour étudier la sélection négative, mais varient dans leur capacité de récapituler les événements physiologiques 6. Par exemple, la stimulation in vitro des thymocytes manque de l&#39;environnement thymique qui est intimement impliqué dans la sélection, tandis que l&#39;administration de l&#39;antigène exogène peut conduire à la non-spécifique suppression des thymocytes 7-9. À l&#39;heure actuelle, les meilleurs outils pour l&#39;étude de la sélection négative vivo sont des souris qui expriment une transgenic TCR spécifique pour endogène auto-antigène. Toutefois, de nombreux modèles classiques TCR transgéniques sont caractérisées par prématurée expression transgénique de la chaîne TCRα au stade DN, entraînant prématuré de sélection négative. Notre laboratoire a mis au point le modèle HY cd4, dans lequel le transgénique HY TCRα est conditionnellement exprimé au stade DP, permettant la sélection négative se produire lors de la DP à la transition SP comme c&#39;est le cas chez les souris de type sauvage 10. Ici, nous décrivons une cytométrie de flux à base de protocole pour examiner thymique sélection positive et négative dans le modèle HY souris CD4. Bien que la sélection négative chez la souris cd4 HY est très physiologique, ces méthodes peuvent également être appliquées à d&#39;autres modèles transgéniques TCR. Nous présenterons également les stratégies générales pour l&#39;analyse de la sélection positive dans un répertoire polyclonal applicable à toutes les souris manipulées génétiquement.

En physiologiques modèles transgéniques TCR et les souris WT, la sélection positive commence à l&#39;étape DP lumineux avant de passer à l&#39;étape DP terne après la rencontre antigène. Thymocytes DP ternes puis entrez un nombre de CD4 + CD8 étape de transition avant de devenir lo CD4SP ou thymocytes CD8SP (figure 2B). Thymocytes matures SP se caractérise par une forte expression du TCR et la perte du CD24 (figure 2C). Alors que le...

Nous présentons une cytométrie de flux basé sur la méthode pour examiner le développement des cellules T<em&gt; In vivo</em&gt; En utilisant des souris génétiquement manipulées sur un fond de type sauvage ou récepteur des cellules T transgéniques.

L&#39;examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

Un système immunitaire sain exige que les lymphocytes T répondent aux antigènes étrangers tout en restant tolérants aux auto-antigènes. Le réarrangement aléatoire des lymphocytes T...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier le développement thymique chez la souris par cytométrie en flux. Cela est réalisé en préparant des suspensions monocellulaires à partir du thymus et de la rate de la souris. Dans un deuxième temps, les thymocytes et les cytes sont marqués avec un cocktail d'anticorps permettant l'identification de populations thymiques spécifiques.En fin de compte, la fréquence et le nombre des différentes populations de lymphocytes peuvent être évalués par analyse en cytométrie en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le développement des lymphocytes T, telles que quels gènes et voies sont importants pour générer un répertoire de cellules T fonctionnel tout en étant tolérant aux cellules. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le développement des cellules T dans le thymus, elle peut également être appliquée à l'examen du développement d'autres cellules immunitaires.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés lors de la conception de leurs mélanges d'anticorps pour la cytométrie en flux. Avant de commencer la dissection, placer un tamis en acier stérile dans une boîte de Pétri de 60 par 15 millimètres. Ajouter ensuite cinq millilitres de HBSS dans la boîte et conserver celle-ci sur de la glace afin de récolter le thymus.Tout d'abord, utilisez une paire de forceps pour soulever l'extrémité inférieure du sternum et découvrir le diaphragme. Ensuite, en évitant le foie, incisez le diaphragme afin de détacher la cage thoracique, puis sectionnez la cage thoracique en direction ascendante de chaque côté. En prenant soin d'éviter les poumons et le cœur.Utilisez maintenant la pince pour écarter doucement la cage thoracique vers l'arrière. Le thymus est un organe blanc bilobé situé au-dessus du cœur. Utilisez le bord plat de la pince pour saisir la partie inférieure des lobes.Ensuite, retirer délicatement le thymus et le placer sur l'un des écrans en treillis préparés au préalable. Pour prélever la rate, pratiquer une incision dans le péritoine afin d'exposer la cavité abdominale. La rate est un organe rouge en forme de planche de surf situé du côté gauche de la cavité abdominale de la souris, sous le foie.Ensuite, utilisez une paire de forceps pour extraire la rate et une autre pour détacher le tissu conjonctif. Placez ensuite la rate disséquée sur un tamis séparé. Utilisez maintenant le piston d'une seringue de trois millilitres pour broyer chaque organe sur son tamis jusqu'à ce qu'il ne reste que le tissu conjonctif et la graisse ; aspirez ensuite les cellules et le HBSS pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, rincez chaque membrane avec du HBS S3 frais trois fois. Puis, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 335 ×g et à 4 °C. Après avoir aspiré le surnageant, resuspendez les cellules dans 500 µL de tampon de lyse CK pendant 10 minutes à température ambiante, tandis que les globules rouges spléniques sont en cours de lyse.Suspendez les thymocytes à 20 × 10⁶ cellules par millilitre dans du tampon fax, puis mettez-les de côté sur de la glace. Ajoutez maintenant cinq millilitres de HBSS pour rétablir l'isotonie après avoir centrifugé à nouveau les cellules ; resuspendez le culot exempt de globules rouges à 20 × 10⁶ cellules par millilitre dans du tampon fax. Commencez cette étape par Ali Watting.Quatre fois 10 puissance 6 des THYMOCYTES réservés par échantillon de cytométrie en flux dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Ensuite, ajouter des cellules dans les puits d'une plaque de 96 puits pour les contrôles de compensation. Puis bloquer les récepteurs FC dans chacun des échantillons cellulaires par incubation avec l'anticorps anti-CD1632 pendant 10 minutes sur glace.Centrifuger maintenant la plaque, puis éliminer le liquide des puits en la retournant d’un coup sec au-dessus d’un évier. Resuspendre ensuite chaque puits dans 200 microlitres de tampon fax et répéter le lavage. Incuber ensuite les échantillons expérimentaux avec 200 microlitres de cocktail d’anticorps ou d’anticorps marqués avec un seul fluorochrome pour les contrôles de compensation. Le tout dans du tampon fax, sur glace et à l’abri de la lumière.Après 30 minutes, lavez les cellules deux fois avec du tampon fax, puis, après avoir resuspendu les cellules dans du tampon fax, transférez les échantillons dans des tubes fax chez des modèles transgéniques TCR physiologiques et des souris de type sauvage. La sélection positive débute au stade double positif brillant avant de passer au stade double positif terne. Après la rencontre avec l'antigène, les thymocytes double positif ternes entrent ensuite dans un stade transitoire CD quatre positif CD huit faible avant de devenir CD quatre.Les thymocytes simples positifs ou les thymocytes simples positifs CD8 mûrs sont caractérisés par leur forte expression du TCR et la perte de CD24. Alors que le profil CD8 par rapport à CD4 peut révéler des défauts dans la sélection positive, l'analyse de TCRβ par rapport à CD69 ou CD5 peut fournir des informations supplémentaires sur la localisation du défaut. CD69 et CD5 sont tous deux surexprimés après la stimulation du TCR, les interactions plus fortes induisant une expression plus élevée de ces marqueurs.Dans ce tracé TCR bêta en fonction de CD69 chez une souris de type sauvage, la population TCR β faible CD69 négative représente une population de thymocytes doublement positifs pré-sélection. En revanche, la population TCR β intermédiaire CD69 positive correspond à une population transitoire juste après l'engagement du TCR et est composée de doublement positifs intenses, ainsi que de quelques doublement positifs faibles et de cellules CD4 positif CD8 faible. Ici, la population TCR β élevée CD69 positive illustre la population cellulaire juste après la sélection positive, constituée de doublement positifs faibles CD4 positif, CD8 faible et de cellules CD4 simple positif.Enfin, ce phénotype TCR bêta élevé CD 69 négatif indique une population cellulaire plus mature, composée principalement de cellules simples positifs pour CD quatre et CD huit. L'absence des populations TCR bêta intermédiaire CD 69 positif et TCR bêta élevé CD 69 positif peut indiquer un défaut de sélection positive. Des modifications du ratio entre les cellules simples positifs CD quatre et les cellules simples positifs CD huit au sein de la population TCR bêta élevé CD 69 négatif peuvent suggérer des altérations dans l'engagement lignagé.La perte des populations TCR bêta élevé CD 69 positif et TCR bêta élevé CD 69 négatif pourrait refléter des problèmes de survie après la sélection positive. L'analyse du TCR bêta en fonction du CD cinq constitue une autre stratégie permettant d'identifier les populations avant et après la sélection positive. Ces deux premières populations se composent principalement de thymocytes double positifs intenses.La population TCR bêta faible CD cinq faible représente les thymocytes doubles positifs pré-sélectionnés, et la population TCR bêta intermédiaire CD cinq intermédiaire est composée des cellules qui initient la sélection positive. Une production altérée de cette population ou de la précédente suggère un défaut de sélection positive. La population TCR bêta intermédiaire CD cinq élevée, en revanche, représente les thymocytes en cours de sélection positive et se compose principalement de doubles positifs atténués et de cellules CD quatre positives.CD huit lymphocytes thymiques faibles. La population TCR bêta forte CD cinq forte se compose principalement de thymocytes post-sélection positive. Modifications du ratio de CD quatre, simple positif à CD huit.Des cellules simples positives au sein de cette population, malgré des populations précédentes normales, peuvent suggérer des altérations dans l'engagement lignagé. En outre, l'absence de cette population peut indiquer une survie réduite des thymocytes après la sélection positive, car la sélection négative implique l'élimination de petites populations spécifiques aux antigènes. Les défauts dans ce processus sont mieux observés à l'aide de souris transgéniques pour le TCR : dans les thymocytes de souris HY CD4 exprimant le TCR transgénique H-Y-TCR, ceux-ci peuvent être détectés à l'aide de l'anticorps monoclonal T3.7.Le TCR H-Y reconnaît l'antigène HY spécifique du mâle présenté par la molécule de CMH de classe I H-2Dᵇ. Ainsi, chez les souris mâles HY CD4, les thymocytes exprimant le TCR H-Y subissent une sélection négative, comme en témoigne une réduction du nombre de thymocytes doubles positifs T3.70⁺, ainsi qu'une diminution plus marquée du nombre de thymocytes simples positifs CD8⁺ T3.7⁺. En revanche, chez les souris femelles HY CD4, ces thymocytes subissent une sélection positive conduisant à la génération de lymphocytes T simples positifs CD8⁺ T3.7⁺.Bien qu'une réduction du nombre de thymocytes doubles positifs soit indicative d'une sélection négative, l'absence de thymocytes simples positifs spécifiques de l'antigène constitue la mesure la plus précise. Un examen approfondi des rares thymocytes T3.70 positifs, CD8 simples positifs, chez les souris HY CD4 mâles révèle que la majorité sont des cellules immatures CD24 élevées. Alors que la majorité des thymocytes T3.70 positifs, CD8 simples positifs, chez les souris HY CD4 femelles ont atteint la maturité et sont CD24 faibles, ce qui apporte un soutien supplémentaire à l'existence d'une sélection négative chez les souris HY CD4 mâles.Un inconvénient des modèles transgéniques de TCR est qu'il est difficile de caractériser davantage la sélection positive en identifiant des populations selon l'expression du TCR et de CD 69 ou de CD cinq, en raison de l'expression élevée du TCR tout au long du développement thymocytaire. Chez les souris HY CD quatre femelles, il existe une importante population de thymocytes doubles positifs exprimant T trois point 70 qui subissent une sélection positive, comme en témoigne l'augmentation de la population positive pour CD 69 par rapport au type sauvage. La sélection négative implique un stimulus TCR d'affinité plus élevée que la sélection positive. Cela se manifeste par une expression plus forte de CD 69 sur les thymocytes doubles positifs T trois point 70 positifs chez les souris HY CD quatre mâles, entraînant un décalage du pic de l'histogramme vers la droite.Des tendances similaires sont observées concernant l'expression de CD cinq lors de l'analyse de la sélection thymique chez des souris génétiquement modifiées. L'analyse de l'expression de CD 69 ou de CD cinq permet de déterminer si le défaut réside dans la signalisation du TCR ou dans une conséquence en aval de la stimulation du TCR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie pour la préparation et la coloration des cellules, plus une heure supplémentaire pour l'acquisition des données sur le cytomètre en flux.Si elle est réalisée correctement, chaque souris supplémentaire ajoutera environ 30 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les thymocytes et de s'assurer d'avoir planifié au préalable la stratégie de marquage. Suivre cette procédure.D'autres tests, tels que des tests de destruction cellulaire ou des tests de production de cytokines, peuvent être réalisés afin de répondre à des questions supplémentaires, comme de savoir si les thymocytes exportés fonctionnent correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser le développement des sites thymiques à l'aide de la cytométrie en flux.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique basée sur la cytométrie en flux utilisant deux fluorochromes pour identifier les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes T γδ, les lymphocytes B, les cellules tueuses naturelles (NK) et les monocytes dans les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). Lors de l’incubation des cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre les marqueurs de surface, les sous-ensembles cellulaires sont identifiés à l’aide d’une stratégie optimale...

Un test de cytométrie en flux pour identifier des sous-ensembles de cellules immunitaires dans des cellules mononucléées du sang périphérique

Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

La surface oculaire normale exposée est constituée de cornée et de conjonctive. Les cellules épithéliales, les cellules caliciformes et les cellules immunitaires sont présentes dans la conjonctive. Ici, une technique non invasive de cytologie d'impression est décrite en utilisant un dispositif de cytologie d'impression et une cytométrie de flux pour analyser les cellules immunitaires dans la conjonctive.

Une manière non invasive d&#39;isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite

Ici, un protocole pour l’isolement et la caractérisation des CD4+ T-cellule sous-ensembles de sang périphérique humain est décrite. Purifiée CD4+ T-cellules sont analysés par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des sous-ensembles de cellule auxiliaire T-folliculaire.

Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Ici, nous présentons un protocole visant à préparer les cellules individuelles de thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate afin d’étudier ces cellules à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce protocole a été utilisé pour la détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs utilisant l’écoulement cytometry.

Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Nous présentons ici un protocole de cytométrie en flux pour identifier les CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et monocytes dans le sang périphérique humain en utilisant seulement deux fluorochromes au lieu de sept. Avec cette approche, cinq marqueurs additionnels peuvent être enregistrées sur la plupart des cytomètres.

Discrimination des sept sous-ensembles de cellules immunitaires par deux-fluorochrome cytométrie en flux

Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.

Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Ce protocole décrit l’isolement de thymocytes doublement négatifs du thymus de souris, suivi d’une transduction rétrovirale et d’une co-culture sur le système de co-culture de lignée cellulaire stromale de moelle osseuse de type delta 4-exprimant la moelle osseuse (OP9-DL4) pour une analyse fonctionnelle plus approfondie.

Co-culture et transduction de thymocytes murins sur des cellules stromales exprimant 4-Delta-like pour étudier les oncogènes dans la leucémie à cellules T

Nous décrivons des protocoles pour la préparation de la suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et la coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux.

Préparation de suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux

Découvrez l'analyse du développement thymique par cytométrie en flux chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer les populations lymphocytaires et d'étudier les gènes impliqués dans la génération du répertoire T.

L'examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

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