Name: Résine de coulée 3-Dimensional Imaging et de la veine porte ou de la souris Système biliaires intrahépatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Apprenez la technique de moulage en résine pour visualiser en 3D la veine porte hépatique ou les voies biliaires intrahépatiques chez la souris. Cette méthode révèle l'architecture vasculaire intacte in situ pour la biologie vasculaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (NIH) à SSH (R01-DK078640), du Howard Hughes Medical Institute (HHMI) à travers le Programme HHMI / Vanderbilt Certificat universitaire en médecine moléculaire à TJW (GRDOT56006779), le Vanderbilt recherche sur le diabète et Training Center (P30-DK020593) et la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) la fourniture des services de base.

1. Préparer canule <ol><li> Chauffer une section de 1 pouce de long tube de PE10 avec vos doigts et étirez sorte que le tube devient mince. Remarque: la taille de la cuve ou conduit à une canule permettra de déterminer le degré d&#39;étirement nécessaire. La canule doit être bien tendue pour les voies biliaires jette mais ne peut être exigé d&#39;être modérément étirée pour s&#39;adapter à l&#39;intérieur de la veine grande porte. </li><li> Couper le tube étiré en diagonale pour générer un embout biseauté. </li><li> Couper l&#39;autre bord de la tubulure pour créer un segment de 5-6 cm. </li><li> Insérer une jauge de 32, l&#39;aiguille hypodermique ½ pouce dans le bord non biseautée du tube. </li></ol> 2. Préparer la seringue avec du PBS <ol><li> Remplissez une seringue de 3 ml avec du PBS. </li><li> Vissez la seringue sur l&#39;aiguille hypodermique avec joint tiré PE10 tube préalablement préparé. </li><li> Seringue Flick et piston de la seringue poussée pour s&#39;assurer que PBS a rempli l&#39;aiguille et tubulure etil n&#39;ya pas de bulles d&#39;air dans la seringue. </li><li> Placez la seringue préparée avec du PBS dans une seringue porte-forme de pâte à modeler. Ce support maintenir constante la seringue pendant que le tube est inséré dans le conduit. </li></ol> 3. Autre Set-up <ol><li> Peser 0,1 g de catalyseur dans un petit récipient, par exemple, un puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Pull 1 ml de résine dans une seringue de 3 ml. Note: les quantités relatives de catalyseur et de la résine peut être ajustée pour modifier le temps de durcissement. Diminuer la quantité de catalyseur peut, toutefois, augmenter les jeter retrait et conduire à une distribution moins souhaitable. Remarque: lors de la manipulation de résine, prendre des précautions pour éviter tout contact avec de la résine ou l&#39;inhalation des vapeurs de résine. Toujours porter des gants et suivez les étapes impliquant la résine dans un endroit bien aéré, comme une hotte </li><li> Coupez un morceau sur 5.0 suture de soie d&#39;environ 5 pouces pour être utilisé comme une ligature. </li></ol> 4. Préparer souris <ol&gt; <li> Sacrifiez la souris adulte. Posez la souris sur son dos et ouvrir la cavité abdominale. </li><li> Posez la souris sur la plate-forme de dissection étendue. Placez un tube conique de 15 ml perpendiculairement dessous de la souris pour augmenter la visibilité et l&#39;accessibilité au foie. </li><li> Mouillez un coton-tige avec du PBS et l&#39;utiliser pour faire basculer le foie vers le haut et loin de vous exposer le point de vue dorsale du foie avec la veine porte extrahépatique ou canal cholédoque. </li><li> Pour moulages veine porte, vous pouvez empêcher la coagulation du sang par la veine de rinçage à température ambiante PBS. Fixer une aiguille pour une seringue de 3 ml remplie avec du PBS et insérer l&#39;aiguille dans la veine porte extrahépatique dans la mesure du foie que vous le pouvez. Poussez doucement PBS à travers la veine porte. Faire une entaille dans la veine cardinale commune à drainer le sang. Utilisez un coton-tige humide pour le foie massage, améliorer le drainage du sang. Cette étape n&#39;est pas recommandé pour les voies biliaires et peut-être pas nécessaire pour tous les systèmes vasculaires. Remarque: cette étape peut également être performé avec du paraformaldéhyde 4% au lieu de PBS. L&#39;utilisation de paraformaldéhyde à 4% peut augmenter l&#39;intégrité vasculaire et entraîner une fonte plus précis, en particulier des plus petites structures vasculaires. </li></ol> 5. Cathétériser la veine porte extrahépatique ou voie biliaire principale <ol><li> Utiliser une pince courbe pour passer le fil de suture chirurgical sous ligature de la veine porte ou du canal biliaire, d&#39;environ un quart de pouce à partir du foie. </li><li> Attacher le fil de suture dans un noeud lâche commun. NE PAS serrer le nœud. </li><li> Si vous travaillez avec un système ouvert, il peut être utile de lier et serrer une ligature à l&#39;autre bout du système. Si vous avez ouvert la veine cardinale commune pour drainer le sang de la veine porte, attachez une ligature autour d&#39;elle pour augmenter la pression dans la veine porte et empêcher la fuite de résine dans la veine hépatique central. </li><li> Utilisez des ciseaux à ressort pour faire une petite incision dans la veine porte ou du canal biliaire, environ ¼ de pouce au-dessous du nœud de suture. Ce cut doit pénétrer pas plus de la moitié du diamètre de la veine porte ou biliaire. </li><li> En utilisant une pince n ° 5, maintenez la veine porte ou canal cholédoque sur le site de la coupe et insérer l&#39;extrémité biseautée du tube dans le canal cholédoque. </li><li> Poussez la pointe du tube après la ligature pré-noué et vers le foie. </li><li> Test de précision par injection de PBS canulation travers la canule et regarder pour voir si elle pénètre dans la veine porte ou des voies biliaires. </li><li> Serrer la ligature pour maintenir la canule en place. </li></ol> 6. Résine de coulée de la veine porte ou voie biliaire intrahépatique <ol><li> Ajouter pré-mesurée de résine 1 ml de pré-mesurée 0,1 g de catalyseur et mélanger soigneusement. Éviter de générer des bulles d&#39;air. </li><li> Dessinez résine-catalyseur mélange dans la seringue de 3 ml. Retirer les bulles d&#39;air par un léger effleurant la seringue et l&#39;expulsion de bulles. Remarque: pour la coulée de petites structures, il peut être utile d&#39;utiliser une chambre à vide pour éliminer les bulles d&#39;air de très petits èmee de résine et d&#39;améliorer la qualité coulé. Pour permettre le temps d&#39;effectuer cette étape, il sera nécessaire de diminuer le ratio catalyseur / résine de celle suggérée ci-dessus afin de ralentir durcissement de la résine. </li><li> Soigneusement remplacer PBS contenant seringue avec une seringue contenant une résine, en laissant l&#39;aiguille de calibre 32 fixée à la canule. </li><li> Poussez lentement et doucement la résine dans la veine porte ou de la voie biliaire jusqu&#39;à ce que la résistance augmente et le foie est rempli. </li><li> Utilisez un coton-tige humide pour masser doucement le foie et favoriser un même remplissage. </li><li> Retirer la canule de la structure et rapidement re-serrer la ligature pour éviter les fuites de résine. </li><li> Laissez la souris à plat à température ambiante pendant 20 minutes tout en la résine durcit, puis retirez le foie. </li><li> Soit procéder à la compensation ou de la macération du foie. </li></ol> 7. Foie clair pour la visualisation in situ <ol><li> Fixer le foie dans du paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C, à bascule. </li><li> Laver le foiedans du PBS pendant au moins quatre heures, à bascule. À ce stade, vous pouvez séparer les lobes du foie si vous le souhaitez. </li><li> Déshydrater dans du methanol à 50%, puis dans le méthanol à 100% pendant au moins quatre heures chacune, se balançant à la température ambiante. </li><li> Effacer le foie dans une solution 1:2 de l&#39;alcool benzylique et le benzoate de benzyle (BABB) pendant au moins 24 h, à bascule. Fois plus de temps de lavage peut être nécessaire. Si le foie ne disparaît pas complètement au bout de 2-3 jours, revenir à 100% de méthanol pendant 24 heures et répétez BABB compensation. </li><li> Foie plonger dans BABB dans un plat en verre de Pétri pour l&#39;imagerie in situ. </li></ol> 8. Faire macérer les tissus du foie <ol><li> Retirer le foie de la souris et placé dans un tube conique de 50 ml avec de l&#39;eau. Attendre 1 heure pour le durcissement de résine complet. Lobes du foie séparés si désiré. </li><li> Verser l&#39;eau et se déplacer foie pour une bouteille en verre. Plonger dans 15% de KOH. Laissez sécher une nuit à température ambiante. Ne pas basculer. </li><li> Versez délicatement hors de KOH et laver coulé dans de l&#39;eau distillée. Remarque: le casting est very fragiles et doivent être manipulés avec précaution. Ne pas perturber la coulée lors de l&#39;ajout ou le retrait de fluide à partir du tube. </li><li> Lorsque moulé en résine est propre, poser délicatement sur une Kimwipe à sécher, puis transférer dans un conteneur pour être stocké. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Une distribution réussie de la veine porte ou voie biliaire affiche un réseau continu de plus en plus petites branches s&#39;étendant à partir de l&#39;hile à la périphérie du foie. La figure 1 montre une veine porte moulé comme visualisées in situ après BABB compensation. La figure 1A montre la distribution de la totalité lobe gauche du foie et de la forme et de la taille de la fonte. Figure 1B montre une vue rapprochée de la même coulée, ce qui démontre la pénétration de la résine dans les plus petites branches de la veine porte du foie périphérie. La figure 2 montre une distribution veine porte qui a subi KOH mamilieu carcéral. Figure 2A montre le lobe hépatique gauche entier et la figure 2B est un gros plan sur les petites branches périphériques. Cette technique a également été appliquée avec succès à la voie biliaire intrahépatique et publiés en utilisant à la fois la compensation BABB et les techniques de macération KOH 1,2,7. Les problèmes courants incluent incomplète remplit, des bulles dans la résine, et déborder dans les systèmes environnants ou des tissus. Figure 3 montre comment reconnaître un remplissage incomplet (figure 3A), des bulles (figure 3A), et un trop-plein de résine de la veine porte à l&#39; veine centrale (figure 3B). Toutes les images sont prises en utilisant un Leica MZ 16 stéréoscope FA et QImaging Retiga 4000R caméra. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig1.jpg" /> Figure 1. Coulée de résine BABB-débarrassée de gauche veine porte hépatique du lobe. Moulé en résine A. montre une structure hiérarchique de branchement s&#39;étendant du hile à la périphérie du foie. Coulée de résine apparaît en jaune dans les lobes du foie bleutée. B. Une illustration montre que la résine de remplissage s&#39;étend à de petites branches dans la périphérie du foie. La résine est blanchâtre à travers le foie effacé. Barre d&#39;échelle = 1 mm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig2.jpg" /> Figure 2. Tissue-macérés résine coulée d&#39;insuffisance hépatique veine porte gauche lobe. Résine A. jeté du lobe du foie entier montre de nombreuses branches de différentes tailles. B. Gros plan montre les petites branches en périphérie du foie. Adoucir l&#39;aspect de petites branches représente résine de remplissage des espaces sinusoïdaux et peut ou peut ne pas être visible sur résine jette et augmenter la densité apparente branche si elle est présente. Résine est de couleur blanche. Barre d&#39;échelle = 1 mm. Figure 3. Problèmes courants avec des moulages en résine. A. Un remplissage incomplet de la veine porte lobe gauche est évident par tout ou partie des branches moulées à défaut d&#39;étendre à la périphérie du foie. Cette fonte affiche également bulles, visible comme des ruptures dans la coulée continue (flèche). En raison de la proximité de la veine porte et la veine centrale de branches dans certains endroits B., la résine veine porte souvent entrer et remplir la veine centrale. Cela peut être reconnu quand il ya deux hilaires branches distinctes (flèches) et deux structures ramifiées qui ont des motifs différents et se chevauchent. Discrimination entre les erreurs techniques et les véritables altérations morphologiques qui peut être fait de deux manières. Tout d&#39;abord, la structure de coulée doit être comparé à la structure attendue sur la base de 2-dimensionnelle d&#39;analyse ou d&#39;autres méthodes. Deuxièmement, il est important d&#39;effectuer plusieurs répétitions, et, si possible, de quantifier la structureure et effectuer une analyse statistique pour déterminer la reproductibilité et s&#39;il ya une altération significative morphologique entre et au sein des différents expérimentale et des bras de commande.

<ol><li>Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+hepatic+Notch+signaling+result+in+disruption+of+the+communicating+intrahepatic+bile+duct+network+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice.</a> Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).</li>
<li>Vanderpool, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+hepatocyte+nuclear+factor-6+and+notch+signaling+regulate+mouse+intrahepatic+bile+duct+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo.</a> Hepatology. 55, 233-243 (2012).</li>
<li>Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+morphology+and+3D+architecture+of+brain+vasculature+in+a+mouse+model+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).</li>
<li>Van Steenkiste, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+corrosion+casting%3A+analyzing+wall+shear+stress+in+the+portal+vein+and+vascular+abnormalities+in+portal+hypertensive+and+cirrhotic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents.</a> Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).</li>
<li>Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+pulmonary+lymphatics+in+immature+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Deep pulmonary lymphatics in immature lungs.</a> Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).</li>
<li>Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+of+the+pancreas%2C+liver%2C+and+kidney+in+cerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis.</a> Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).</li>
<li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li>
<li>Carlson, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+constitutively+active+Notch4+elicits+reversible+arteriovenous+malformations+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).</li>
<li>Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ageing+on+the+murine+venous+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of ageing on the murine venous circulation.</a> Histochem. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Hossler, F. E., Olson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+of+the+nasal+salt+gland+of+the+duckling%2C+Anas+platyrhynchos%3A+quantitative+responses+to+osmotic+adaptation+and+deadaptation+studied+with+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting.</a> J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).</li>
<li>Hossler, F. E., West, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+valve+anatomy+and+morphometry%3A+studies+on+the+duckling+using+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting.</a> Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).</li>
<li>Hossler, F. E., Monson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+blood+supply+of+intrinsic+lymph+nodes+in+the+wall+of+the+rabbit+urinary+bladder--studies+with+light+microscopy%2C+electron+microscopy%2C+and+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting.</a> Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).</li>
<li>Hossler, F. E., Monson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+unique+elastic+sheath+surrounding+the+vesicular+arteries+of+the+rabbit+urinary+bladder--studies+of+the+microvasculature+with+microscopy+and+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting.</a> Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).</li>
<li>Hossler, F. E., Kao, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+of+the+urinary+bladder+of+the+dog%3A+a+study+using+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting.</a> Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).</li>
<li>Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+morphometry+and+branching+angles+of+porcine+coronary+arterial+tree+from+CT+images%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images.</a> Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).</li>
<li>Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+morphometry+of+myocardial+capillaries+studied+with+vascular+corrosion+casting+and+scanning+electron+microscopy%3A+a+method+for+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Scan+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart.</a> Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).</li>
<li>Hossler, F. E., Douglas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Corrosion+Casting%3A+Review+of+Advantages+and+Limitations+in+the+Application+of+Some+Simple+Quantitative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods.</a> Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).</li>
<li>Mondy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+of+corrosion+casts+for+use+in+the+computer-aided+design+of+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+the+Rat+Intrahepatic+Biliary+System+by+Three-Dimensional+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction.</a> The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+Artery+and+Portal+Vein+Remodeling+in+Rat+Liver%3A+Vascular+Response+to+Selective+Cholangiocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation.</a> The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit des exemples précis de la façon dont la veine porte et systèmes des voies biliaires intra-hépatiques du foie peut être lancé, mais cette technique peut être appliquée à n&#39;importe quel autre système canalaire ou vasculaire avec de légères adaptations. Des travaux antérieurs ont démontré la faisabilité de cette technique dans de multiples espèces, y compris la souris 1,2,7-9, caneton, lapin 10,11 12,13, chien 14, 15, et le cochon et dans de nombreux organes, y compris...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> PE10 tuyaux en polyéthylène </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1417012P </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 chirurgicale soie noire tressée </td><td> Roboz chirurgicale </td><td> SUT-15-1 </td><td></td></tr><tr><td> Steriject 32 G x aiguille de 13 mm </td><td> Air-tite </td><td> TSK3213 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux à ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Numéro 5 forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> MercOx II Kit </td><td> Ladd recherche </td><td> 21247 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool benzylique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1816-1804 </td><td> Oeul nécessaire pour BABB-compensation </td></tr><tr><td> Le benzoate de benzyle </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 154839 </td><td> Uniquement nécessaire pour BABB-compensation </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pâte à modeler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Échelle </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux de laboratoire </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 15 ml en polypropylène capitalisation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldahyde 4% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15% d&#39;hydroxyde de potassium (KOH) </td><td></td><td></td><td> Uniquement nécessaire pour la macération </td></tr><tr><td> Lame de rasoir </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Méthanol à 100% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 ml seringue luer lock </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

résine de coulée 3-dimensional imaging et de la veine porte ou de la souris système biliaires intrahépatiques

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

D&#39;organes, l&#39;architecture correcte des structures vasculaires et du carcinome canalaire est indispensable pour la fonction physiologique adéquate, et la formation et le maintien de ces structures est un processus hautement régulé. L&#39;analyse de ces complexes, 3-dimensions des structures a fortement dépendu de chaque examen en 2 dimensions dans la section ou sur des études d&#39;injection de colorant. Ces techniques, cependant, ne sont pas en mesure de fournir une représentation complète et quantifiable des structures canalaires ou vasculaire qu&#39;ils sont destinés à élucider. Alternativement, la nature de la 3-dimensions des moulages en résine plastique génère un instantané permanente du système et est un roman et technique largement utile pour visualiser et quantifier les 3-dimensions des structures et des réseaux. Un des principaux avantages du système de moulage en résine est la capacité de déterminer l&#39;état intact et connecté, ou la communication, la structure d&#39;un vaisseau sanguin ou un conduit. La structure du duc vasculaire ettal réseaux sont essentiels pour la fonction des organes, et cette technique a le potentiel d&#39;aider étude des réseaux vasculaires et canalaires de plusieurs façons. Coulée de résine peut être utilisée pour analyser la morphologie normale et l&#39;architecture fonctionnelle d&#39;une structure luminale, d&#39;identifier les changements morphogénétiques de développement, et de découvrir les différences morphologiques dans l&#39;architecture des tissus entre l&#39;état normal et la maladie. Des travaux antérieurs ont utilisé une résine de coulée pour étudier, par exemple, des défauts architecturaux et fonctionnels au sein du système biliaire souris intrahépatiques qui n&#39;étaient pas reflétés dans les 2-dimensionnelle analyse de la structure de 1,2, les modifications dans le système vasculaire du cerveau d&#39;un modèle de la maladie d&#39;Alzheimer souris 3 , les anomalies de la veine porte en portail souris hypertendues et cirrhotiques 4, les étapes de développement de la maturation lymphatique rat entre les poumons immatures et adultes 5, immédiats des changements microvasculaires dans le foie de rat, du pancréas et du rein en réponse à une blessure chimique6. Nous présentons ici une méthode pour générer une résine coulée 3-dimensionnelle d&#39;un réseau vasculaire de la souris ou canalaire, en se concentrant spécifiquement sur la veine porte et voie biliaire intra-hépatique. Ces plâtres peuvent être visualisées par compensation ou macération du tissu et peuvent ensuite être analysées. Cette technique peut être appliquée à pratiquement n&#39;importe quel système vasculaire ou canalaire et serait directement applicable à toute étude enquête sur le développement, la fonction, l&#39;entretien, ou d&#39;une blessure d&#39;une structure en 3 dimensions canalaire ou vasculaire.

Procédé de visualisation et de quantification de la structure tridimensionnelle de 3-veine porte hépatique de la souris ou du conduit biliaire intrahépatique est décrit. Cette technique coulée de résine peut également être appliquée à d&#39;autres systèmes canalaires ou vasculaire et permet<em&gt; In situ</em&gt; La visualisation ou la quantification d&#39;un système intact de l&#39;architecture de communication.

Résine de coulée 3-Dimensional Imaging et de la veine porte ou de la souris Système biliaires intrahépatiques

Dans les organes, l'architecture correcte des structures vasculaires et ductales est indispensable au bon fonctionnement physiologique, et la formation et...

L'objectif général de cette procédure est de produire un moulage tridimensionnel d'un tissu vasculaire ou ductal. Cette étape est réalisée en préparant et en canulant d'abord la structure cible, telle que la veine porte, puis en fixant la canule en place à l'aide d'un lien. Ensuite, une résine est préparée, injectée dans la veine porte et laissée à polymériser.Ensuite, le foie est retiré et le tissu est fixé ou macéré. Enfin, le foie est clarifié et la structure du moulage est visualisée. En définitive, des résultats peuvent être obtenus.Ce procédé permet d'observer les modifications de l'architecture des structures vasculaires ou ductales par analyse visuelle ou quantification au moyen de micro-tomodensitométrie. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'architecture hépatique, elle peut également être appliquée aux systèmes vasculaires ou ductaux de tout organe, notamment le cerveau, le poumon, le pancréas et les reins.Pour préparer la canule, réchauffez avec vos doigts une section de tube PE 10 d'environ un pouce de longueur et tirez doucement dessus afin qu'il s'amincisse. Coupez le tube étiré en diagonale. Pour obtenir une extrémité biseautée, coupez l'autre extrémité du tube afin de former un segment de cinq à six pouces de long.Insérez une aiguille hypodermique de demi-pouce de calibre 32 dans le bord non biseauté du tube. Préparez une seringue de trois millilitres en la remplissant d'abord avec du PBS, puis vissez l'aiguille munie du tube. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans la seringue et à ce que l'aiguille soit remplie de PBS en tapotant la seringue et en poussant le piston.Prélevez 0,1 gramme de catalyseur dans un petit récipient. Ensuite, aspirez un millilitre de résine dans une seringue de trois millilitres. Enfin, coupez un morceau de suture en soie de cinq pouces destiné à être utilisé comme ligature.Après avoir sacrifié une souris adulte, placez-la sur le dos et ouvrez la cavité abdominale. Disposez la souris sur la plateforme d'un microscope stéréoscopique et positionnez un tube conique de 15 millilitres perpendiculairement sous la souris afin d'améliorer la visibilité et l'accès au foie. Humidifiez un coton-tige avec du PBS et utilisez-le pour soulever le foie vers le haut et l'écarter afin d'exposer la face dorsale du foie ainsi que le portail hépatique extra-hépatique, la veine ou le canal cholédoque.Pour les moulages de la veine porte, évitez la formation de caillots sanguins en rinçant la veine avec du PBS à température ambiante. Fixez une aiguille à une seringue de trois millilitres remplie de PBS et insérez-la dans la veine porte extra-hépatique aussi loin que possible du foie.Ensuite, poussez doucement le PBS dans la veine porte. Puis faites une petite incision dans la veine cardinale commune pour drainer le sang si nécessaire afin d'améliorer le drainage sanguin ; utilisez un coton-tige humide pour masser le foie. Si vous travaillez avec un système ouvert à une extrémité, il peut être utile de nouer et serrer un ligature à l'autre extrémité du système.Si la veine cardinale commune est ouverte pour drainer le sang de la veine porte afin de placer un ligature autour de celle-ci, augmentant ainsi la pression dans la veine porte et empêchant la fuite de résine vers la veine hépatique centrale. Utiliser des pinces courbes pour passer le fil de suture chirurgical sous l'une ou l'autre structure à environ un quart de pouce du foie. Faire un nœud lâche avec le fil, sans le serrer.Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort pour pratiquer une petite incision dans la veine porte ou le canal biliaire, à environ un quart de pouce sous le nœud de suture. Cette incision ne doit pas pénétrer de plus de la moitié du diamètre de l'une ou l'autre structure. Puis, à l’aide d’une pince n°5, maintenez la veine porte ou le canal biliaire au niveau de l’incision et insérez l’extrémité biseautée du tube.Faire avancer l'extrémité du tube au-delà du ligature préparée en direction du foie. Vérifier la précision de la canulation en injectant du PBS à travers la canule et en observant s'il pénètre dans la veine porte ou le canal biliaire. Serrer le ligature pour maintenir la canule en place.Ajouter le millilitre de résine préalablement mesuré aux 0,1 gramme de catalyseur préalablement mesuré et mélanger soigneusement en évitant les bulles d'air. Réintroduire le mélange de résine et de catalyseur dans la seringue de trois millilitres. Éliminer les bulles d'air en tapotant doucement la seringue et en chassant les bulles.Remplacez soigneusement la seringue contenant du PBS par la seringue contenant la résine, en laissant l'aiguille de calibre 32 attachée à la canule. Poussez lentement et délicatement la résine dans la veine porte ou le canal biliaire jusqu'à ce que la résistance augmente et que le foie soit rempli. Pour favoriser un remplissage uniforme.Utilisez un coton-tige humide pour masser doucement le foie, retirez la canule et resserrez rapidement le ligature afin d'éviter toute fuite de résine. Laissez la souris à plat à température ambiante pendant 20 minutes, le temps que la résine durcisse, avant de retirer le foie pour une visualisation interne. Le lendemain, fixez-le dans du paraformaldéhyde à 4 % toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, versez délicatement la solution et ajoutez du PBS.Lavez le foie dans du PBS pendant au moins quatre heures. Les lobes hépatiques peuvent être séparés à ce stade, si désiré. Déshydratez le tissu dans du méthanol à 50 %, puis dans du méthanol à 100 %, pendant au moins quatre heures chacun.Balancer à température ambiante. Clarifier le foie dans une solution un à deux d'alcool benzoïque et de benzoate de benzoyle pendant au moins 24 heures supplémentaires. Des temps de lavage peuvent être nécessaires pour l'imagerie in situ.Immerger le foie dans du BABB dans une boîte de Pétri en verre comme méthode alternative pour macérer le tissu. Après avoir retiré le foie de l'animal, le placer dans un tube conique de 50 millilitres contenant de l'eau. Attendre une heure pour une polymérisation complète de la résine.Versez l'eau et transférez le foie dans un flacon en verre. Immergez-le dans de l'hydroxyde de potassium à 15 % et laissez agir toute la nuit à température ambiante sans agitation, en prenant soin de ne pas remuer. Versez l'hydroxyde de potassium et rincez le moulage à l'eau distillée.Évitez de perturber la moulure lors de l'ajout ou du retrait de liquide du tube. Lorsque la moulure de résine est propre, déposez-la délicatement sur un essuie-tout kim pour la faire sécher, puis transférez-la dans un récipient pour stockage. Cette figure montre une moulure de veine porte telle qu'elle est visualisée in situ après clarification au BABB.On voit ici l'empreinte de tout le lobe hépatique gauche ainsi que la forme et la taille de cette empreinte. Il s'agit d'une vue rapprochée de la même empreinte, montrant la pénétration de la résine dans les plus petites branches de la veine porte en périphérie du foie. Ici, une empreinte de veine porte a subi une macération à l'hydroxyde de potassium, avec tout le lobe gauche représenté ici, et un agrandissement sur les petites branches périphériques ici.Les problèmes courants incluent des remplissages incomplets, des bulles dans la résine et un débordement dans les systèmes ou tissus environnants. Cette figure montre comment reconnaître un remplissage incomplet, la présence de bulles et un débordement de la résine de la veine porte vers la veine centrale. N'oubliez pas que le travail avec la résine peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port systématique de gants et le travail dans un endroit bien ventilé doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.

3-dimensional-resin-casting-imaging-mouse-portal-vein-or-intrahepatic

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Dans cet article, nous présentons une technique simple, pratique pour la coulée vasculaire cérébral qui est facile à réaliser et peut être utilisé à l'image de l'arbre vasculaire du cerveau de souris adulte.

Moulage cérébrovasculaire de la souris adulte pour l&#39;imagerie 3D et l&#39;analyse morphologique

Cette vidéo décrit la procédure de moulage de résine du système biliaire, pour comprendre l’architecture biliaire 3D. Cette technique fournit des informations sur le diamètre interne et la connectivité du réseau du système biliaire, qui pourraient être utilisées pour l’analyse de la régénération hépatique.

Moulage de résine du système biliaire : une technique d’analyse de l’architecture 3D du système biliaire dans un modèle murin à l’aide de l’injection de résine radio-opaque

Les outils utilisés pour visualiser la régénération vasculaire nécessitent des méthodes pour contraster les arbres vasculaires. Ce film a démontré une technique d’injection délicate utilisée pour obtenir un contraste optimal des arbres vasculaires et illustre les avantages potentiels résultant d’une analyse détaillée de l’échantillon résultant à l’aide de coupes en série μCT et histologiques.

Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

Une procédure chirurgicale a été mise au point pour délivrer des cellules tumorales mammaires au foie murin par injection dans la veine porte. Ce modèle permet d’étudier les stades tardifs des métastases hépatiques chez un hôte entièrement immunisé, y compris l’extravasation des cellules tumorales, l’ensemencement, la survie et la croissance métastatique dans le foie.

Une injection Modèle Portal Vein pour étudier le foie Métastases du cancer du sein

Le but de cette technique est la visualisation ex vivo des réseaux artériels pulmonaires des souris postnatales et adultes précoces par l’inflation pulmonaire et l’injection d’un composé à base de polymère radio-opaque par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire. Les applications potentielles pour les tissus moulés sont également discutées.

Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal (CCR) génère des métastases hépatiques riches en stroma. Ce modèle murin de métastases hépatiques du CCR représente un outil utile pour étudier les interactions tumeur-stroma et développer de nouvelles thérapies dirigées par le stroma telles que les thérapies géniques médiées par le virus adéno-associé.

Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma

La micro-tomodensitométrie à double coulée de résine, ou DUCT, permet la visualisation, la numérisation et la segmentation de deux systèmes tubulaires simultanément pour faciliter l’analyse 3D de l’architecture des organes. DUCT combine l’injection ex vivo de deux résines radio-opaques suivie d’un balayage par micro-tomodensitométrie et d’une segmentation des données tomographiques.

DUCT: Double coulée de résine suivie d’une micro-tomodensitométrie pour l’analyse 3D du foie

Le protocole actuel optimise les méthodes de perfusion/décellularisation in situ du foie et de microscopie à deux photons afin d’établir une plateforme fiable pour visualiser la dynamique du remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la stéatohépatite non alcoolique (NASH).

Imagerie 3D de la matrice extracellulaire hépatique dans un modèle murin de stéatohépatite non alcoolique

Nous avons établi un modèle murin de fibrose hépatique chronique, qui fournit un modèle animal approprié pour l’étude mécaniste de la fibrose hépatique induite par le virus de l’atrésie biliaire (AB) et une plate-forme pour les futurs traitements de l’AB.

Un modèle murin de fibrose hépatique chronique pour l’étude de l’atrésie biliaire

Dans ce protocole, nous discutons de la mise en œuvre d’un modèle de transplantation hépatique orthotopique réussie (OLT) chez la souris. De plus, les adjuvants permettant d’analyser plus en détail la perméabilité de l’allogreffe après une OLT réussie chez une souris sont également discutés, en particulier à l’aide de la microtomodensitométrie (microCT).

Transplantation hépatique orthotopique réussie chez la souris à l’aide de l’angiographie par microtomodensitométrie

Ce protocole introduit un outil d’imagerie hépatique réutilisable (RHIT) de pointe pour la microscopie intravitale (IVM) de souris vivantes, qui améliore la stabilité tissulaire pour des expériences rapides et aiguës. La conception imprimée en 3D du RHIT offre une production économique, une scalabilité et une polyvalence, permettant une observation prolongée des processus métaboliques chez des souris de différentes tailles.

Outil réutilisable d’imagerie hépatique : un outil réutilisable imprimé en 3D pour la microscopie intravitale hépatique

Apprenez la technique de moulage en résine pour visualiser en 3D la veine porte hépatique ou les voies biliaires intrahépatiques chez la souris. Cette méthode révèle l'architecture vasculaire intacte in situ pour la biologie vasculaire.

Résine de coulée 3-Dimensional Imaging et de la veine porte ou de la souris Système biliaires intrahépatiques

Explorer plus de vidéos