Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l'étude de l'homme HSK

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'infection récurrente par le virus de l'herpès simplex ou HSV. Cela est réalisé en infectant d'abord des souris de manière à ce qu'elles deviennent latemment infectées sans lésion cornéenne. Une fois la latence complètement établie, l'étape suivante consiste à réactiver le virus par exposition à la lumière UVB. Dans la dernière étape, le film lacrymal est recueilli afin de détecter l'excrétion virale, puis les souris sont observées pendant au moins cinq semaines pour surveiller l'évolution de la maladie.

En fin de compte, l'ampleur de la maladie qui se développe chez les souris peut être évaluée par un score de maladie de la kératite stromale herpétique. Il s'agit d'une maladie qui affecte de nombreuses personnes à travers le monde. Cette maladie particulière est l'une des principales causes de cécité infectieuse.

Nous disposons d'un modèle que nous utilisons chez la souris pour imiter cette maladie particulière. Il existe d'autres modèles capables d'imiter effectivement cette maladie, mais nous considérons que celui-ci constitue la meilleure représentation de cette maladie spécifique. J'aimerais prendre quelques minutes aujourd'hui pour vous présenter les personnes que vous verrez dans cette vidéo.

Voici Chloe, qui travaille avec moi depuis plusieurs mois. Voici Nippo, un étudiant d'été qui travaille au laboratoire. Commencez l'expérience en cultivant l'HSV de type 1 sur des cellules Vero pendant trois à quatre jours jusqu'à une confluence de 80 % dans un flacon T150.

Les cellules seront arrondies à ce stade et se détacheront facilement en tapotant le flacon. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres, puis centrifugez les cellules pendant 15 minutes. Ajoutez 1 510 ×g à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table.

Ensuite, transférez le surnageant dans des tubes stériles de type Oak Ridge de 50 millilitres, puis répartissez cinq millilitres de milieu au total entre chacun des tubes coniques pour la resuspension. Suspendez les gros culots, puis soniquez les culots resuspendus pendant une minute en deux impulsions de 32e. Après centrifugation du surnageant dans une centrifugeuse au sol à grande vitesse, un petit culot viral est obtenu.

Après avoir éliminé le surnageant, combinez les sots avec de petits culots viraux et soniquez à nouveau pendant 45 secondes. Centrifugez maintenant la solution soniquée contenant les cellules et le virus dans une centrifugeuse de table pendant cinq minutes à 280 × g et à 4 °C, puis aliquotez le surnageant pour le stocker comme stock viral à −70 °C en vue d'une titration sur plaque.

Des dilutions dix fois plus faibles du virus, à partir du surnageant de la souche virale, allant de 10 à la puissance zéro à 10 à la puissance moins huit, sont préparées deux fois à partir de deux jeux de dilutions distincts sur des cellules Vero cultivées dans des plaques stériles de 12 puits. Commencer la procédure d'infection en anesthésiant la souris. La souris doit rester complètement anesthésiée pendant 20 à 30 minutes afin de permettre l'absorption du virus avant qu'elle ne se réveille.

Ensuite, sous un microscope stéréoscopique, utilisez une aiguille de calibre 30 pour rayer la cornée de l’œil droit. Numérotez maintenant l’animal par perforation de l’oreille. Ensuite, injectez à la souris un millilitre de sérum humain poolé afin de protéger les cornées des lésions pendant l’infection primaire.

Ensuite, utilisez une pipette de 20 microlitres pour infecter l’œil rayé avec 10 à la puissance six unités formant des plaques, et ajoutez cinq microlitres de HBSS dans l’autre œil afin de le maintenir humide pendant que l’animal est anesthésié pour confirmer l’infection. Hydratez un applicateur stérile en coton avec un millilitre de milieu Vero. Trois jours après l’infection, prélève l’œil infecté avec l’applicateur, puis transférez 100 microlitres du milieu prélevé sur des cellules Vero cultivées dans des plaques de 48 puits, au moins cinq semaines après l’infection primaire.

Prélève par écouvillonnage l’œil infecté d’une souris anesthésiée comme vient d’être montré. Indique sur le couvercle de la plaque de 48 puits que cet écouvillonnage correspond au jour zéro afin de contrôler les clignotements spontanés. Puis place la souris dans un transilluminateur capable d’émettre des UVB à une longueur d’onde maximale de 302 nanomètres, de sorte qu’un seul œil soit exposé à la lumière UVB, et expose la souris à 250 millijoules de lumière UVB par centimètre carré.

Ensuite, prélève l'œil quotidiennement du premier au septième jour. Après l'irradiation UVB, pour les prélèvements contenant un virus infectieux, quantifie la quantité de virus à l'aide d'un dosage par plaque standard utilisant des plaques de 12 puits afin d'évaluer la maladie oculaire clinique chez les souris. Place la souris sous un microscope stéréo binoculaire.

L'opacité cornéenne est évaluée sur une échelle de zéro à quatre, où zéro indique un stroma clair, un indique une opacification stromale légère, deux indique une opacité modérée avec des détails de l'iris discernables, trois indique une opacité dense avec perte des détails définis de l'iris sauf au niveau des marges pupillaires, et quatre indique une opacité totale sans vision des structures postérieures.

La néovascularisation est évaluée sur une échelle de un à huit en divisant la cornée en quatre quadrants égaux et en déterminant l'importance de la vascularisation dans chacun de ces quadrants. Sur cette première figure, des souris infectées de manière latente ont été induites à réactiver l'infection par irradiation UVB, puis ont été surveillées pendant 35 jours pour l'opacité cornéenne. Ces données montrent que les souris mâles C57BL/6 présentent une opacité cornéenne significativement moindre que les souris femelles C57BL/6, car une maladie induite par le virus nettement plus importante a été observée chez les souris femelles C57BL/6 entre les jours 14 et 35.

De même, lorsque la néovascularisation cornéenne a été évaluée dans les mêmes conditions expérimentales, les souris mâles ont présenté une croissance significativement moindre de nouveaux vaisseaux dans la cornée par rapport aux souris femelles, et, là encore, on observe une maladie induite par le virus nettement plus importante chez les souris C57BL/6 femelles entre les jours 14 et 28. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à anesthésier complètement les souris afin qu'elles restent endormies pendant une durée comprise entre 20 et 30 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous comprenez désormais comment utiliser le modèle murin de kératite stromale récidivante pour étudier cette maladie humaine.