Name: Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour létude de lhomme HSK (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Découvrez un modèle de kératite herpétique stromale récurrente chez la souris pour étudier les infections HSV. Cette méthode permet d'évaluer la progression de la maladie et de tester des interventions thérapeutiques potentielles.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jay Pepose pour aider l&#39;enseignement du modèle pour nous. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) et une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness au Département d&#39;ophtalmologie.

Remarque protection des animaux: Les analgésiques sont pas utilisées dans ce modèle car ils sont anti-inflammatoires et donc invalider le modèle. 1. Préparation de virus <ol><li> Cultiver HSV-1 sur des cellules Vero (80% de confluence) en utilisant une dilution à partir de 0,01 multiplicité d&#39;infection (en fiole T-150, d&#39;environ 5 x 10 5 unités formant plaque) pendant 3-4 jours jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont une rafle et sont facilement délogés en frappant le ballon. </li><li> Retirez le support pour tubes à centrifuger et centrifuger stériles dans Sorvall Legend RT à 4 ° C et 3500 rpm pendant 15 min. Après avoir retiré le surnageant (voir point 1.3), remettre en suspension grand culot de chaque tube de 50 ml avec 5 ml du total des médias. Ultrasons pendant 1 min en rafales deux 30 sec. </li><li> Retirer le surnageant et mettre en tubes de 50 ml stériles Oak Ridge et centrifuger à 9000 tours par minute, pendant 1 h à 4 ° C dans un Beckman J2-21 centrifugeuse. Il s&#39;agit de produire une petite pastille virale. Jeter le surnageant. </li><li> Combinez une sonication de 1,2 esprith à granulés de 1,3 et soniquer à nouveau pendant 45 secondes. Centrifugeuse à Sorvall Legend RT à 1500 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Enregistrez le surnageant. Ceci constitue le stock de virus qui est aliquoté et conservé à -70 ° C. </li><li> Titre viral sur cellules Vero. J&#39;ai l&#39;habitude de plaque de 10 0 à 10 -8 à dilution (chacune étant une dilution de 10 fois) 2x à partir de 2 séries de dilution distincts. Titrage du virus est effectuée sur des plaques 12 puits stériles. </li></ol> 2. L&#39;infection de la souris <ol><li> Injecter chaque souris avec 0,1 ml d&#39;anesthésique cocktail/20 g de poids corporel de la souris (kétamine, 60 mg / kg de xylazine + 5 mg / kg, ce qui est dilué dans du HBSS). Ce cocktail est utilisé parce qu&#39;il est l&#39;un des moyens les plus sûrs de l&#39;anesthésie lors de dosages appropriés sont utilisés et les effets de cette drogue sont de très courte durée. </li><li> Lorsque les souris sont anesthésiées rayer la cornée de l&#39;oeil droit avec une aiguille de calibre 30 à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection pour faire en sorte que la cornée n&#39;est pas perforé. </li><li> Chaque rece sourisIVED une injection intrapéritonéale de 1 ml de sérum humain mis en commun (Sigma, Temecula, en Californie, anti-HSV réactivité avec une dose efficace pour la neutralisation virale de 50% de 1:800) afin de protéger la cornée des dommages pendant la primo-infection. </li><li> Nombre des souris avec des clips d&#39;oreille à l&#39;oreille l&#39;un ou coup de poing. </li><li> Après toutes les souris ont été numérotées; aide d&#39;une pipette 20 ul, nous infecter chaque œil avec 10 6 PFU (5 pi). Nous infecter un seul œil et l&#39;œil droit en général. Nous mettons également 5 ul de HBSS à l&#39;autre oeil pour le garder humide pendant qu&#39;ils sont anesthésiés. 5 ul est suffisant pour maintenir l&#39;hydratation des yeux, car les procédures sont exécutées en moins de 10 min, et les animaux sont dosés avec un anesthésique en conséquence. L&#39;infection est confirmée par écouvillonnage souris 3 jours post-infection avec un coton stérile qui a été hydraté dans 1 ml de milieu de Vero. Puis 100 ul est ajouté aux cellules Vero cultivées en plaques 48 puits. Ces plaques sont la surveillance quotidienne des effets cytopathiques<html> (Cpe). </li></ol> 3. La réactivation de la latence de souris <ol><li> Les souris sont anesthésiées au moins 5 semaines après la primo-infection. Il convient de noter que nous avons réactivé la souris jusqu&#39;à un an suivant la primo-infection et n&#39;ont pas observé de différences significatives dans la réponse. </li><li> Une fois anesthésié, ils sont placés TM20 Chromato-Vu transilluminateur, qui émet des UV-B à une longueur d&#39;onde maximale de 302 nm de telle sorte que seulement un seul oeil est exposé à la lumière UV-B. Chaque souris est exposé à la lumière 250 cm mJ d&#39;UV-B 2. </li><li> La réactivation est déterminée par écouvillonnage yeux avec applicateur de coton stérile qui est d&#39;abord placé dans 1 ml de milieu de Vero au jour 0 (avant l&#39;exposition UV-B pour tenir compte des excréteurs spontanées), puis sur les jours 1 à 7 post-irradiation UV-B. Le matériau tampon est évaluée comme décrit dans l&#39;2,5). Pour les prélèvements qui ont le virus infectieux de la quantité de virus est titré par une analyse de la plaque standard à l&#39;aide plaques de 12 puits. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. Évaluation clinique <ol><li> Les souris sont évalués pour maladie de l&#39;œil clinique par un observateur masquée à l&#39;aide d&#39;un microscope binoculaire de dissection. </li><li> Opacité de la cornée est évalué sur une échelle de 0 à 4, où 0 indique clairement stroma, 1 indique une légère opacification stromale, 2 indique une opacité modérée avec des caractéristiques discernables iris, 3 indique une opacité dense, avec une perte de détails iris défini, sauf marges d&#39;élèves, et 4 indique opacité la plus totale, sans vue postérieure. </li><li> La néovascularisation est évalué sur une échelle de 1 à 8 en divisant la cornée en 4 quadrants égaux et déterminer l&#39;étendue de la vascularisation dans chacun de ces quadrants. </li><li> Blépharite est mesurée comme suit: 0, pas de lésions; 1, paupière gonflement minimal; 2, décharge modérée oculaire gonflement et croustillant; 3, un gonflement sévère, modérée perte de cheveux périoculaire, et des lésions cutanées, et 4, un gonflement sévère avec robinet yeux en croûte, sévère perte de cheveux périoculaire, et des lésions cutanées. </li><li> Preuve de l&#39;encéphalite included dos voûté, les cheveux ébouriffés, et des anomalies neurologiques évidentes. Les souris sont euthanasiées quand ils affichent des signes importants de l&#39;encéphalite. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Le modèle récurrent qui a été décrit ci-dessus a été publié par Shimeld, et al. 1-3. Ils ont testé et notre laboratoire a utilisé une version modifiée de ce modèle de publier de nombreux manuscrits sur les 4-15 ans. Le modèle a été utilisé pour définir le rôle que la cytokine interféron γ-jeux dans récurrente HSV-1 maladie 10. Comme le montre la figure 3, les souris dépourvues IFN affiché pire maladie de la cornée que ne souris de type sauvage 14. Il a également été utilisé avec succès pour définir la valeur thérapeutique du vaccin différent construit plusieurs 6,10,11. Notez que dans un cas, le vaccin testé a bien fonctionné prophylactique mais n&#39;a pas prouvé pour être thérapeutiquement efficace 6. Cependant,quand un vaccin incompétent pour la réplication virale a été testé, il était non seulement efficace en prophylaxie, mais il était aussi très efficace thérapeutiquement 10,11, voir figure 5 dans la référence 10. Plus récemment, nous avons utilisé ce modèle pour déterminer si les différences entre les sexes étaient détectables chez des souris subissant HSK récurrente. Comme la figure 1 le montre, des souris mâles C57BL / 6 afficher l&#39;opacité cornéenne beaucoup moins que ne le font C57BL / 6 femelles souris. De même, lorsque la néovascularisation cornéenne a été évaluée, les souris mâles ont démontré la croissance des vaisseaux beaucoup moins nouvelle dans la cornée que ne souris femelles (figure 2). Nous sommes en train de tester si ce phénotype est spécifique de la souche en effectuant une analyse similaire dans d&#39;autres souches de souris. Nous allons également déterminer si la différence est due à l&#39;absence de testostérone ou la présence d&#39;œstrogènes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> Figure 1. Maladie de la cornée des souris C57BL mâle et femelle / 6 souches de souris à la suite d&#39;UV-B réactivation induite. Souris infectées de façon latente ont été amenés à réactiver avec UV-B et les souris ont été suivis pendant une opacité cornéenne pendant 35 jours. Le nombre de souris utilisées pour ces études étaient les suivants: hommes, n = 15; femmes, n = 15. Les résultats indiquent la moyenne ± SEM. * Il était significativement plus élevée induite par le virus maladie chez les souris C57BL / 6 femelles pour les jours de 14 à 35 (P = 0,001 à 0,01). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> Figure 2. Maladie de la cornée des souris C57BL mâle et femelle / 6 souches de souris à la suite d&#39;UV-B réactivation induite. Souris infectées de façon latente ont été amenés à réactiver avec UV-B et les souris ont été suivis pendant une néovascularisation cornéenne pendant 35 jours. Le nombre de souris utilisées pour ces études étaient les suivants: hommes, n= 15; femmes, n = 15. Les résultats indiquent la moyenne ± SEM. * Il était significativement plus élevée induite par le virus maladie chez les souris C57BL / 6 femelles pour les jours de 14 à 28 (P = 0,001 à 0,01).

<ol><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li>
<li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li>
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<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li>
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<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+and+CD8%2B+cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective%2C+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+vaccination+with+vhs%28-%29+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li>
<li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li>
<li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li>
<li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le modèle récurrent de kératite stromale herpétique (HSK) décrit ici permet à l&#39;enquêteur d&#39;étudier HSK humain dans un modèle qui est plus conforme à ce qui est observé au cours de la maladie humaine. Ainsi, les forces du modèle sont que la maladie se produit dans le cadre d&#39;un système immunitaire qui a déjà stimulé par la maladie pendant primaire. Étant donné que ces souris ont déjà une réponse immunitaire contre le HSV-1, les facteurs qui réactivent que la réponse immunitaire sont probablement différentes ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Sérum humain</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>52-21</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur</td><td>UVP</td><td>95-0452-02</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Oak Ridge</td><td>Nalgene</td><td>Z 720410</td><td></td></tr><tr><td>Flacons - 7150</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Plaques - 12 puits</td><td>Corning</td><td>CLS 3513</td><td></td></tr><tr><td>Plaques - 48 puits</td><td>Corning</td><td>CLS 3548</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques stériles - 30 ml</td><td>Corning</td><td>CLS 430828</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs stériles avec embout en coton</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 30G</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 25G</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 ml</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l&#39;étude de l&#39;homme hsk

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Maladie oculaire herpétique, appelée kératite herpétique stromal (HSK), est une infection potentiellement cécitante de la cornée qui se traduit par plus de 300.000 visites cliniques chaque année pour le traitement. Entre 1 et 2 pour cent de ces patients atteints de la maladie clinique constatez une perte de la vision de la cornée infectée. La grande majorité de ces cas sont le résultat d&#39;une réactivation d&#39;une infection latente par l&#39;herpès simplex virus de type I et non en raison d&#39;une maladie aiguë. Fait intéressant, l&#39;infection aiguë est le modèle le plus souvent utilisé pour étudier cette maladie. Toutefois, il a été estimé que le modèle récurrent de HSK serait plus représentatif de ce qui se passe au cours de la maladie clinique. Les modèles animaux récurrents pour HSK ont employé deux lapins et des souris. L&#39;avantage des lapins est qu&#39;ils éprouvent la réactivation de la latence absence de tout stimulus connu. Cela dit, il est difficile d&#39;étudier le rôle que de nombreux facteurs immunologiques jouer dans HSK récurrente parce que le modèle de lapin n&#39;a pas l&#39;immunitéressources méthodologiques et génétique de la souris a. Nous avons choisi d&#39;utiliser le modèle de souris pour HSK récurrente car elle a l&#39;avantage de l&#39;existence de nombreuses ressources disponibles et aussi savoir quand aura lieu la réactivation parce réactivation est induite par l&#39;exposition aux rayons UV-B. Jusqu&#39;à présent, ce modèle a permis à ces laboratoires de l&#39;utiliser pour définir plusieurs facteurs immunologiques qui sont importantes pour cette maladie. Il nous a également permis de tester à la fois thérapeutique et l&#39;efficacité du vaccin.

La plupart des études de la maladie de la cornée herpétique utiliser un modèle d&#39;infection primaire. Cependant, la primo-infection par le HSV-1 habituellement, n&#39;aboutit pas à la maladie humaine. Nous décrivons ici un modèle récurrent de la maladie herpétique cornée, ce qui rapproche le plus de la maladie humaine.

Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l&#39;étude de l&#39;homme HSK

La maladie herpétique de l'œil, appelée kératite stromale herpétique (KSH), est une infection de la cornée pouvant entraîner la cécité et qui cause plus de 300 000 cas cliniques...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'infection récurrente par le virus de l'herpès simplex ou HSV. Cela est réalisé en infectant d'abord des souris de manière à ce qu'elles deviennent latemment infectées sans lésion cornéenne. Une fois la latence complètement établie, l'étape suivante consiste à réactiver le virus par exposition à la lumière UVB. Dans la dernière étape, le film lacrymal est recueilli afin de détecter l'excrétion virale, puis les souris sont observées pendant au moins cinq semaines pour surveiller l'évolution de la maladie.En fin de compte, l'ampleur de la maladie qui se développe chez les souris peut être évaluée par un score de maladie de la kératite stromale herpétique. Il s'agit d'une maladie qui affecte de nombreuses personnes à travers le monde. Cette maladie particulière est l'une des principales causes de cécité infectieuse.Nous disposons d'un modèle que nous utilisons chez la souris pour imiter cette maladie particulière. Il existe d'autres modèles capables d'imiter effectivement cette maladie, mais nous considérons que celui-ci constitue la meilleure représentation de cette maladie spécifique. J'aimerais prendre quelques minutes aujourd'hui pour vous présenter les personnes que vous verrez dans cette vidéo.Voici Chloe, qui travaille avec moi depuis plusieurs mois. Voici Nippo, un étudiant d'été qui travaille au laboratoire. Commencez l'expérience en cultivant l'HSV de type 1 sur des cellules Vero pendant trois à quatre jours jusqu'à une confluence de 80 % dans un flacon T150.Les cellules seront arrondies à ce stade et se détacheront facilement en tapotant le flacon. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres, puis centrifugez les cellules pendant 15 minutes. Ajoutez 1 510 ×g à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table.Ensuite, transférez le surnageant dans des tubes stériles de type Oak Ridge de 50 millilitres, puis répartissez cinq millilitres de milieu au total entre chacun des tubes coniques pour la resuspension. Suspendez les gros culots, puis soniquez les culots resuspendus pendant une minute en deux impulsions de 32e. Après centrifugation du surnageant dans une centrifugeuse au sol à grande vitesse, un petit culot viral est obtenu.Après avoir éliminé le surnageant, combinez les sots avec de petits culots viraux et soniquez à nouveau pendant 45 secondes. Centrifugez maintenant la solution soniquée contenant les cellules et le virus dans une centrifugeuse de table pendant cinq minutes à 280 × g et à 4 °C, puis aliquotez le surnageant pour le stocker comme stock viral à −70 °C en vue d'une titration sur plaque.Des dilutions dix fois plus faibles du virus, à partir du surnageant de la souche virale, allant de 10 à la puissance zéro à 10 à la puissance moins huit, sont préparées deux fois à partir de deux jeux de dilutions distincts sur des cellules Vero cultivées dans des plaques stériles de 12 puits. Commencer la procédure d'infection en anesthésiant la souris. La souris doit rester complètement anesthésiée pendant 20 à 30 minutes afin de permettre l'absorption du virus avant qu'elle ne se réveille.Ensuite, sous un microscope stéréoscopique, utilisez une aiguille de calibre 30 pour rayer la cornée de l’œil droit. Numérotez maintenant l’animal par perforation de l’oreille. Ensuite, injectez à la souris un millilitre de sérum humain poolé afin de protéger les cornées des lésions pendant l’infection primaire.Ensuite, utilisez une pipette de 20 microlitres pour infecter l’œil rayé avec 10 à la puissance six unités formant des plaques, et ajoutez cinq microlitres de HBSS dans l’autre œil afin de le maintenir humide pendant que l’animal est anesthésié pour confirmer l’infection. Hydratez un applicateur stérile en coton avec un millilitre de milieu Vero. Trois jours après l’infection, prélève l’œil infecté avec l’applicateur, puis transférez 100 microlitres du milieu prélevé sur des cellules Vero cultivées dans des plaques de 48 puits, au moins cinq semaines après l’infection primaire.Prélève par écouvillonnage l’œil infecté d’une souris anesthésiée comme vient d’être montré. Indique sur le couvercle de la plaque de 48 puits que cet écouvillonnage correspond au jour zéro afin de contrôler les clignotements spontanés. Puis place la souris dans un transilluminateur capable d’émettre des UVB à une longueur d’onde maximale de 302 nanomètres, de sorte qu’un seul œil soit exposé à la lumière UVB, et expose la souris à 250 millijoules de lumière UVB par centimètre carré.Ensuite, prélève l'œil quotidiennement du premier au septième jour. Après l'irradiation UVB, pour les prélèvements contenant un virus infectieux, quantifie la quantité de virus à l'aide d'un dosage par plaque standard utilisant des plaques de 12 puits afin d'évaluer la maladie oculaire clinique chez les souris. Place la souris sous un microscope stéréo binoculaire.L'opacité cornéenne est évaluée sur une échelle de zéro à quatre, où zéro indique un stroma clair, un indique une opacification stromale légère, deux indique une opacité modérée avec des détails de l'iris discernables, trois indique une opacité dense avec perte des détails définis de l'iris sauf au niveau des marges pupillaires, et quatre indique une opacité totale sans vision des structures postérieures.La néovascularisation est évaluée sur une échelle de un à huit en divisant la cornée en quatre quadrants égaux et en déterminant l'importance de la vascularisation dans chacun de ces quadrants. Sur cette première figure, des souris infectées de manière latente ont été induites à réactiver l'infection par irradiation UVB, puis ont été surveillées pendant 35 jours pour l'opacité cornéenne. Ces données montrent que les souris mâles C57BL/6 présentent une opacité cornéenne significativement moindre que les souris femelles C57BL/6, car une maladie induite par le virus nettement plus importante a été observée chez les souris femelles C57BL/6 entre les jours 14 et 35.De même, lorsque la néovascularisation cornéenne a été évaluée dans les mêmes conditions expérimentales, les souris mâles ont présenté une croissance significativement moindre de nouveaux vaisseaux dans la cornée par rapport aux souris femelles, et, là encore, on observe une maladie induite par le virus nettement plus importante chez les souris C57BL/6 femelles entre les jours 14 et 28. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à anesthésier complètement les souris afin qu'elles restent endormies pendant une durée comprise entre 20 et 30 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous comprenez désormais comment utiliser le modèle murin de kératite stromale récidivante pour étudier cette maladie humaine.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cet article, nous décrivons vidéo l'utilisation d'une...

Ex Vivo modèle organotypique cornéenne aiguë de l&#39;herpès simplex virus type épithéliales je infection

Cette vidéo montre une méthode de génération d’un modèle de souris humanisée double avec un système immunitaire humain et des cellules hépatiques. Il s’agit de transplanter des cellules hépatiques humaines et des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques dans une souris immunodéficiente transgénique par injection intrasplénique, conduisant à la greffe de cellules hépatiques et au développement de cellules immunitaires humaines.

Développement d’un modèle de souris humanisé avec des cellules hépatiques humaines et des cellules immunitaires

Hypertension oculaire chronique est induite en utilisant la photocoagulation au laser du trabéculum dans les yeux de souris. La pression intraoculaire (PIO) est élevée pendant plusieurs mois après le traitement au laser. La diminution de l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste des animaux expérimentaux sont surveillés en utilisant le test optomoteur.

Un modèle de souris induite par laser de l&#39;hypertension oculaire chronique pour caractériser les défauts d&#39;apparence

Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.

Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

La peau est un tissu cible du virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1). Pour explorer la voie d’invasion du HSV-1 dans les tissus, nous avons établi un modèle d’infection ex vivo de feuillets épidermiques murins qui représentent la couche la plus externe de la peau.

Ex Vivo infection de murin épiderme avec le virus Herpes simplex de type 1

Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH

On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l'étude des événements d'infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l'étude des événements aigus après l'infection primaire ou la réactivation virale.

Infection chronique, aigue et réactivée du VIH dans des modèles de souris immunodéficientes humanisés

Le modèle d’inoculation de la carte de pied est un outil précieux pour caractériser les réponses neuroinflammatoires induites par le virus in vivo. En particulier, il fournit une évaluation claire de la cinétique virale et des processus immunopathologiques associés initiés dans le système nerveux périphérique.

Modèle d’inoculation de tapis de souris pour étudier les réponses neuroinflammatoires virales induites

Nous décrivons l’utilisation d’une cornée porcine pour tester l’efficacité antivirale de médicaments expérimentaux.

L’explantation de tissu cornéen porcin étudiera l’efficacité des antiviraux du virus de l’herpès simplex-1

L’hypersensibilité de contact (SHC) est un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique (DCA). Le SHC est basé sur la sensibilisation à l’haptène réactif en peignant la peau rasée de la poitrine et de l’abdomen, avec un défi cutané ultérieur de l’oreille avec un haptène dilué, provoquant une réaction de gonflement qui est évaluée de diverses manières.

Hypersensibilité de contact comme modèle murin de dermatite de contact allergique

Ce protocole expliquera comment établir un modèle murin de cicatrisation hypertrophique qui augmente la signalisation de mécanotransduction pour simuler une cicatrisation de type humain. Cette méthode consiste à augmenter la tension mécanique le long d’une incision de cicatrisation chez une souris et à utiliser un appareil spécialisé pour créer un tissu cicatriciel excessif reproductible pour des analyses histologiques et bioinformatiques détaillées.

Un modèle murin de cicatrice hypertrophique de type humain induite par la mécanotransduction

Découvrez un modèle de kératite herpétique stromale récurrente chez la souris pour étudier les infections HSV. Cette méthode permet d'évaluer la progression de la maladie et de tester des interventions thérapeutiques potentielles.

Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l'étude de l'homme HSK

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