Time-lapse d'imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d'Arabidopsis avec la manipulation rapide de l'environnement root en utilisant le RootChip

Cet article fournit un protocole pour la culture de jeunes plants d'Arabidopsis dans le RootChip, une plate-forme d'imagerie qui combine microfluidique de contrôle automatisé des conditions de croissance avec un suivi racine microscopique et FRET basée sur la mesure de niveaux intracellulaires de métabolites.

Afin de fournir des rendements maximaux, les plantes doivent recevoir une série de nutriments, des carences en nutriments, des stress tels que le froid ou une chaleur extrême, la sécheresse ou des agents pathogènes qui entraînent des pertes massives de rendement des cultures chaque année. L’origine de bon nombre de ces problèmes se trouve souvent sous terre. La racine est l’ancrage physique de la plante, mais c’est aussi l’organe responsable de l’absorption de l’eau et de l’absorption des nutriments minéraux tels que l’azote, le sulfate de phosphore et de nombreux oligo-éléments.

Si nous voulons développer des approches durables pour produire des cultures à haut rendement, nous devons mieux comprendre comment les racines se développent, comment elles absorbent ce large éventail de nutriments et comment elles interagissent avec les organismes symbiotiques et pathogènes. Pour ce faire, nous devons être en mesure d’explorer les racines au niveau microscopique Pour des raisons évidentes. L’étude de la biologie des racines a toujours été plus difficile que l’étude des parties aériennes de la plante.

Étant donné que les racines sont généralement cachées sous terre, elles ne sont pas facilement accessibles pour les études microscopiques. L’enlèvement du sol cause de graves dommages au système racinaire et n’est donc pas un bon moyen d’étudier leur comportement. Une solution pour rendre les racines plus accessibles est de les cultiver sur jeed ou est illustrée dans cet exemple en milieu hydroponique.

Les plans de culture en milieu jelled ou en milieu hydroponique ont été utilisés avec beaucoup de succès dans de nombreuses études racinaires, mais avec ces méthodes, il est encore très difficile d’étudier les racines en détail microscopique et sur de longues périodes de temps pour se rapprocher le plus possible de la racine en croissance et éviter tout stress physique lié à la préparation de l’imagerie. Nous construisons une plate-forme qui nous permet de cultiver et d’imager des racines, et en même temps nous permet de contrôler et de modifier le microenvironnement des racines avec une précision et une vitesse très élevées. Cette plate-forme, nous l’avons appelée la puce racine. La puce racinaire est un dispositif microfluidique fabriqué à partir de PDMS, un polymère organique à base de silicone.

La puce comporte des chambres d’observation pour la croissance et l’imagerie des racines d’un semis d’opsis de lapin. Les graines germent d’abord dans des cônes en plastique fabriqués à partir d’embouts de pipette en plastique, que nous remplissons avec un support solide. L’extrémité de la racine se développe ensuite à travers le milieu et atteint la chambre où elle subit un flux continu de milieu liquide, maintenant les conditions dans la chambre.

Les vannes micromécaniques constantes développées par le laboratoire de Steve Quake à l’Université de Stanford sont ici illustrées en rouge. Le flux puisque la puce est montée sur un verre de protection transparent comme généralement utilisé pour la microscopie, tous les processus dans la chambre d’observation peuvent être surveillés sur un microscope inversé. La structure des canaux bifurqués qui guide l’écoulement du fluide peut être observée au microscope.

L’éclat radiculaire se compose de deux couches, une couche de contrôle contenant les vannes et une couche d’écoulement contenant les canaux par lesquels les solutions d’essai de milieu de croissance s’écoulent vers les chambres d’observation. Le volume de ces chambres est d’environ 400 nanolitres. Cela signifie que seules de très petites quantités de solution sont nécessaires et que les conditions peuvent être modifiées très rapidement.

Ce protocole décrit comment les racines vivantes de huit semis d’Arabidopsis sont préparées pour une imagerie microscopique parallèle sur la puce racinaire et observées jusqu’à trois jours, en commençant par remplir une boîte de Pétri de 10 millimètres avec un milieu de croissance contenant 1 % de gélose pendant que le milieu est encore liquide. Remplissez des pointes de pipette de 10 microlitres avec cinq microlitres de fluide provenant de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette multicanaux. Les pointes remplies sont stockées dans la boîte à pointes de pipette jusqu’à ce que le milieu soit solide.

Ensuite, coupez en cônes en plastique de quatre millimètres de long et placez-les à la verticale dans une boîte de Pétri contenant un milieu de croissance solide. Après la stérilisation de surface, des graines simples sont placées sur les cônes remplis de support. Le plat est ensuite scellé avec du ruban adhésif microporeux et la plaque est stockée à quatre degrés pour synchroniser la germination.

Après trois jours, les plaques sont transférées dans une armoire de croissance pour commencer la germination. Nos conditions de croissance dans cette expérience sont de 23 degrés. À un point culminant de 16 heures, un cycle d’obscurité de huit heures entre cinq et sept jours après la germination, le semis doit être prêt à être transféré à la longueur des racines et, le cas échéant, l’expression d’un marqueur fluorescent doit être vérifiée au microscope à dissection.

Dès que les extrémités des racines des semis atteignent la sortie inférieure du cône en plastique, les semis individuels sont marqués pour être transférés sur la puce. Environ 10 plants doivent être sélectionnés au cas où l’un d’entre eux serait endommagé pendant le transfert pour stériliser la puce de racine. Pour les expériences à long terme, le dispositif est enveloppé dans du tissu, placé dans une boîte de Pétri en verre et un autoclave.

Cette puce vient d’être autoclave auparavant. L’expérience après refroidissement de la puce est recouverte d’un milieu de croissance liquide. La puce doit être complètement recouverte, mais le niveau de liquide ne doit pas dépasser trois millimètres au-dessus de la surface de la puce.

Une pipette de 20 microlitres est utilisée pour tirer le support à travers l’entrée de la racine et la sortie de la chambre. Celle-ci remplit la salle d’observation. Avec le support sélectionné, les cônes en plastique sont maintenant branchés sur la puce racine.

Le cône doit s’adapter parfaitement aux entrées. Étant donné que la puce racine est montée sur une fine couche de verre optique, il faut faire attention à ne pas appliquer trop de pression sur la puce. Au cours de cette étape, la puce est maintenant préparée pour une incubation pendant la nuit dans le milieu liquide afin d’éviter que la puce ne flotte.

Deux lames de verre, dont une coupée en deux, sont placées sur la puce. Une barre d’agitation magnétique est ajoutée et le plat est fermé. L’ensemble est maintenant transféré à un agitateur magnétique, qui agitera doucement le milieu pour faciliter la croissance des racines vers les sorties.

La puce racine. Les entrées sont perforées à un angle pour soutenir davantage la croissance dans la direction souhaitée. Inclinez légèrement l’ensemble en soulevant le côté de la puce qui se trouve à l’opposé des sorties.

La puce est éclairée par une lampe annulaire connectée à une minuterie pour maintenir le rythme de la lumière et de l’obscurité. Après l’incubation d’une nuit, le milieu de croissance liquide est préparé dans un flacon pressurable refermable. Les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement et sans interruption pour éviter le dessèchement des semis.

La puce est maintenant retirée du milieu liquide et placée à l’envers dans l’ouverture inférieure du support de puce, qui est également inversée. La puce doit être orientée de telle sorte que le côté contenant les entrées de la couche de contrôle soit orienté vers le côté de la conduite de pression. Deux gros connecteurs dans la paroi latérale du support.

Le verre de protection au bas de la puce est séché par tamponnage doux avec du papier de soie et fixé au support. Avec du ruban adhésif, l’ensemble est ensuite inversé. Les connecteurs de tube sont remplis d’eau à l’aide d’une seringue, et chaque connecteur de tube est branché dans l’entrée correspondante.

Sur la puce. Le tube est branché sur le support et la solution. Les flacons et l’air sont ensuite retirés des conduites en appliquant une pression sur la solution de bile avec une seringue d’air, le support est recouvert de plastique transparent.

Pour maintenir une humidité élevée dans l’ensemble, le support est placé sur la platine du microscope. Il doit s’insérer exactement dans les encoches de la scène. Les vannes à puce, ainsi que le débit de fluide à travers la puce sont contrôlés par la pression de l’air.

Deux conduites avec régulateurs sont ramifiées à partir d’une conduite de pression principale. L’un est utilisé pour contrôler le débit de fluide et l’autre est connecté à des électrovannes d’air. Ces vannes sont commandées à partir de l’ordinateur via le contrôleur de vanne USB et sont responsables de l’actionnement des vannes sur la puce.

Les deux régulateurs de pression doivent être fermés avant que la puce ne soit connectée. Les tubes, les connecteurs et les flacons de solution sont maintenant fixés aux conduites de pression correspondantes. Quelques millilitres d’eau sont ajoutés dans les réservoirs du support.

Il peut être nécessaire de répéter cette étape au cours d’expériences plus longues. Pour maintenir l’humidité élevée, maintenez la charge volumique afin de minimiser la quantité potentielle de liquide qui pourrait être déversée sur le microscope. La lumière annulaire est déplacée en position sur la puce pour maintenir le cycle d’obscurité de la lumière jusqu’au début de l’expérience.

Les vannes sur la puce sont fermées en appliquant une pression, dans ce cas en ouvrant les électrovannes d’air. L’interface de vue laboratoire permet de contrôler les vannes en cliquant sur le bouton situé sous le numéro de la vanne. Le vert vif indique l’application d’une pression et la fermeture d’une vanne à copeaux.

Ce schéma illustre l’organisation du système de soupapes, tandis que les soupapes quatre à huit agissent comme des vannes simples, les vannes zéro à trois agissent. Dans les groupes équipés de ce système, une chambre individuelle peut être adressée en activant une combinaison de vannes, par exemple, pour guider le flux de fluide exclusivement vers la troisième chambre à partir des vannes supérieures zéro, trois et quatre doivent être fermées. De plus, les vannes six, sept et huit contrôlent la solution utilisée pour rincer les entrées A, B et C activent désormais les trois vannes d’entrée de solution pour les fermer.

L’interface du contrôleur dispose d’une boucle de rétroaction, qui permet de surveiller l’état du système. Cette fonction peut être activée en cliquant sur le bouton de relecture. Le régulateur de pression de la couche de contrôle est ouvert en premier et réglé sur 15 PSI.

Ensuite, le régulateur de la couche d’écoulement est ouvert et réglé sur cinq PSI. La vanne d’entrée du fluide de croissance de votre choix est ouverte et les chambres sont rincées avec des voies d’écoulement du fluide doivent être vérifiées au microscope. Dans la plupart des cas, l’air est emprisonné dans les canaux et doit être évacué.

De plus, les canaux de l’air de contrôle contiennent toujours de l’air qui doit être expulsé et remplacé par l’eau des connecteurs de tuyaux. Ce processus s’appelle le remplissage d’impasse. Les deux tâches sont accomplies en rinçant plusieurs fois chacune des huit chambres jusqu’à ce que tout l’air soit forcé des canaux vers le PDMS.

Le système peut être programmé pour automatiser les expériences. De telles routines peuvent également être utilisées pour dégazer la puce. L’objectif principal de la puce racine est de combiner une plate-forme d’imagerie et un système de profusion dans un seul appareil.

Pour démontrer la manipulation du microenvironnement des racines, nous avons rincé les chambres avec un colorant et mesuré l’échange de fluide à l’intérieur des chambres. À la pression recommandée de cinq PSI, nous avons mesuré un remplacement complet en 10 secondes à un débit calculé d’environ 1,5 microlitre par minute. Nous avons également observé la croissance racinaire de semis, dans ce cas cultivés dans l’obscurité et alimentés en glucose de 10 millimolaires comme source d’énergie externe.

En fonction des conditions de croissance telles que la lumière et la composition du milieu, les plantes peuvent être observées dans l’éclat de racine jusqu’à trois jours. Ce système a été utilisé pour surveiller les niveaux intracellulaires de glucose et de galactose dans les racines exprimant des nanocapteurs génétiquement codés. Ces capteurs basés sur le transfert d’énergie de première résonance ou frette ont été développés dans le laboratoire Fromer.

Pour cette expérience, les racines de la puce ont été perfusées avec des impulsions carrées de solution de glucose ou de galactose. Les niveaux intracellulaires de sucres ont été surveillés et sont présentés ici, exprimés en rapport entre l’intensité de la fluoro quatre citrine accepteur et l’intensité de l’ECFP du donneur à gauche. Nous observons la quantité de capteurs de citrine au milieu ou rapport image métrique de l’extrémité de la racine, et à droite, nous suivons la quantité de sucre en réponse à trois impulsions carrées répétées de glucose en vert et de galactose en rouge.

L’augmentation du rapport indique une accumulation de sucre. Les principaux avantages de l’éclatement radiculaire par rapport aux méthodes de croissance conventionnelles sont la préparation peu invasive à la microscopie, la capacité de modifier de manière réversible et répétée l’environnement racinaire et la capacité d’observation continue des tissus aptes au développement et physiologiquement sains sur une période de plusieurs jours. Un autre avantage très important est que seules des quantités minimes de liquide sont nécessaires pour fournir aux racines tous les nutriments nécessaires au fil du temps.

Cela rend le chipp racinaire très rentable, en particulier lorsque des réactifs coûteux sont appliqués. Nous continuons d’optimiser la puce racinaire et d’étendre sa facilité d’utilisation, car nous pensons qu’en rendant cet organe important plus accessible pour les traitements et l’observation, les outils microfluidiques comme la puce racinaire ouvriront potentiellement de nouvelles dimensions à la recherche sur les plantes. Vous trouverez plus d’informations sur la façon de construire un système de puce racine sur notre site Web.

Les puces peuvent être commandées auprès de la fonderie de Stanford.