Name: Lexamen BCL-2 Fonction famille avec de grandes vésicules unilamellaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des interactions des protéines BCL-2 utilisant des vésicules unilamellaires larges (LUV) pour modéliser la membrane mitochondriale externe. Cette approche permet d'étudier la régulation de l'apoptose.

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Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Chipuk pour leur collaboration et leur soutien. De plus, nous tenons à exprimer notre reconnaissance à Tomomi Kuwana et Donald Newmeyer pour avoir établi les bases expérimentales de ce travail. Ce travail a été financé par : NIH CA157740 (attribué à J.E.C.) et un projet pilote du NIH P20AA017067 (attribué à J.E.C.). Ce travail a également été partiellement soutenu par une subvention de recherche 5-FY11-74 de la March of Dimes Foundation (attribuée à J.E.C.).

1. Associer les lipides et former un film lipidique
<ol>
	<li>En travaillant sous une hotte avec un éclairage minimal, les lipides solubilisés dans le chloroforme sont combinés dans un flacon en verre ambré de 1,5 ml à l’aide d’une seringue en verre étanche aux gaz de Hamilton rincée au chloroforme. Ce mélange donnera environ 4 mg de lipides (Figure 1A).
	<ul>
		<li>Cardiolipine 10 mg/ml (CL) - 63 μl</li>
		<li>Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl</li>
		<li>Phosphatidyléthanolamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl</li>
		<li>Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl</li>
		<li>Phosphatidylsérine 10 mg/ml (PS) - 65 μl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Pour éliminer le chloroforme, appliquer un flux doux de gaz inerte (par exemple, de l’azote ou de l’argon) dans le flacon. Un film lipidique devient visible au fond et sur les parois du flacon une fois sec, ce qui prend généralement de 2 à 3 heures (Figure 1A).</li>
</ol>
2. Préparer la solution de liposomes
<ol>
	<li>Dans des tubes microcentrifuge de 1,7 ml, préparer 500 μl d'ANTS à 12,5 mM dans du tampon LUV (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) et 500 μl de DPX à 45 mM dans du tampon LUV (Figure 1B).</li>
	<li>Mélanger les solutions d'ANTS et de DPX, vortexer pendant 1 min et soniquer pendant 1 min à température ambiante. La sonication s'effectue dans un bain à ultrasons (par exemple, Branson 3510MTH, sans réglage particulier, simplement allumé). Cela garantit que les solutions sont entièrement solubilisées et homogènes.</li>
	<li>Ajouter la solution ANTS/DPX au film lipidique et sceller le flacon avec du parafilm (Figure 1B).</li>
	<li>Soniquer le film lipidique dans le bain d'eau décrit ci-dessus pendant 5 min. La solution apparaîtra laiteuse après la sonication. S'assurer que le film lipidique est complètement solubilisé, car la présence d'agrégats lipidiques résiduels nuira aux étapes suivantes. Vérifier également les parois et le fond du flacon afin de s'assurer qu'aucun film lipidique n'est resté (Figure 1B).</li>
</ol>
3. Extrusion et purification des liposomes
<ol>
	<li>Assembler l'extrudeuse conformément aux instructions du fabricant en utilisant le tampon LUV pour humidifier les supports de filtre et la membrane en polycarbonate. Serrer le boîtier de l'appareil afin d'éviter toute perte de volume pendant l'extrusion, sans toutefois trop serrer pour ne pas endommager la membrane. Il est également conseillé de tester l'extrudeuse avec le tampon LUV afin de s'assurer qu'il n'y a ni fuite ni problème.</li>
	<li>Commencer avec la solution lipidique dans la seringue de droite, effectuer 31 passages de la solution lipidique ; les LUV se retrouveront alors dans la seringue de gauche. Cette procédure garantit que tous les lipides ont traversé la membrane au moins une fois. Les premiers passages peuvent nécessiter une pression légèrement plus élevée pour franchir la membrane. Si la solution traverse soudainement la membrane très rapidement, vérifier la membrane pour détecter une éventuelle rupture et la remplacer si nécessaire (Figure 1C).</li>
	<li>Préparer une colonne de sépharose S-500 de 10 ml à écoulement gravitaire (1,0 cm x 20 cm, volume de gel de 10 ml). Laver avec 3 volumes de colonne de tampon LUV, laisser l'écoulement s'arrêter, puis boucher la colonne. Étant donné que cette étape prend un certain temps, il est préférable de commencer le lavage pendant que les lipides s'assèchent. Garder simplement la colonne bouchée jusqu'à ce qu'elle soit prête à être utilisée.</li>
	<li>Ajouter les LUV extrudés à la colonne en une seule étape, en évitant de perturber l'interface des billes. Laisser le tampon s'écouler de la colonne jusqu'à l'arrêt complet du flux, puis boucher. Remplir délicatement la colonne avec du tampon LUV. Là encore, faire attention lors de l'ajout du tampon afin de ne pas perturber les billes (Figure 1C).</li>
	<li>Retirer le bouchon et recueillir 6 fractions de 1 ml chacune. Les LUV éluent généralement dans les fractions 3 et 4, et peuvent être identifiés par leur aspect trouble. Une fois les fractions recueillies, laver la colonne avec 5 volumes d'eau, puis avec 2 volumes d'éthanol à 20 %. Conserver la colonne à 4 °C (Figure 1C).</li>
	<li>Conserver les fractions à 4 °C à l'abri de la lumière jusqu'à leur analyse.</li>
</ol>
4. Tester les fractions de colonne
<ol>
	<li>Les fractions de colonne sont maintenant testées pour la fluorescence en comparant le tampon LUV et le tampon LUV supplémenté avec 0,5 % de CHAPS. Les fractions dont la fluorescence augmente en présence de CHAPS contiennent des LUV. Pipeter 100 μl de tampon LUV ou de tampon LUV + 0,5 % CHAPS dans six puits chacun, puis ajouter 5 μl de la fraction appropriée et mélanger. Utiliser des plaques non traitées, opaques et noires de 96 puits pour toutes les études sur les LUV (Figure 1D).</li>
	<li>Lire la plaque à 37 °C avec les paramètres suivants : longueur d'onde d'excitation : 355 nm ; longueur d'onde d'émission : 520 nm ; gain (tension) : 125 ; position des optiques : supérieure ; hauteur de lecture : 5,5 mm. Ce réglage concerne le BioTek H1 Synergy utilisant le logiciel Gen 5 2.0 (Figure 1D).</li>
	<li>Les fractions 3 et 4 montrent généralement une augmentation de fluorescence de 5 à 10 fois. Une fois l'analyse terminée, combiner les fractions contenant des LUV et les conserver à 4 °C à l'abri de la lumière ; environ 2 ml de lipide à ~ 2 mM seront purifiés (Figure 1D).</li>
</ol>
5. Études des protéines de la famille BCL-2 à l'aide de VUG
<ol>
	<li>Les protéines BCL-2 sont testées pour leur capacité à induire directement la perméabilisation des LUV, ainsi que pour leur rôle dans la régulation de cette activité. Les essais sur LUV sont généralement réalisés en volumes de 100 μl, à 37 °C, et peuvent être analysés soit en un seul point temporel après 30 à 60 min (Figures 2A-C, 3A-B), soit par des études cinétiques toutes les 1 à 2 min pendant jusqu'à 1 h (Figure 2D). Un schéma représentatif de l'essai, décrivant les composants, les concentrations initiales/finales et l'ordre d'ajout, est fourni (Tableau 1). Il est également conseillé de faire agiter doucement la plaque par le lecteur de microplaque avant chaque mesure. Les premières minutes donnent souvent des lectures irrégulières (probablement dues aux variations de température, au mélange, etc.), nous considérons donc généralement les points de données après 2 à 3 lectures dans une étude cinétique. Il n'est pas rare d'observer de grandes barres d'erreur pour certaines conditions, en raison de la variabilité entre les lots de LUV et de l'efficacité des interactions protéiques à des concentrations limites d'activation ou d'inhibition.</li>
	<li>Les stocks de protéines de la famille BCL-2 doivent être dilués dans le tampon LUV à une concentration 100x, et des titrations de BAX, BID et de toutes les autres protéines sont effectuées afin de déterminer les plus faibles concentrations nécessaires pour détecter une perméabilisation minimale des LUV dépendante de BAX en l'absence de BID, ainsi qu'une synergie significative entre BAX et BID. En outre, toutes les autres protéines nécessitent des titrations afin de réduire le gaspillage de protéines et de minimiser les concentrations des ajouts protéiques ultérieurs.</li>
</ol>
6. Résultats représentatifs
Il existe une myriade d'options pour observer et examiner la régulation dépendante de la famille BCL-2 de la perméabilisation des LUV. Pour générer un contrôle positif de perméabilisation des LUV, nous utilisons la BAX activée par un détergent12. Le détergent, le n-octyl-β-D-glucoside (OG), déclenche artificiellement l'activation de la BAX (pour 100 μl de BAX-OG à 2,3 μM : 5 μg de BAX + 0,7 % d'OG dans du tampon LUV, incuber 60 min à 4 °C, aliquoter et conserver à -80 °C), et par conséquent, la BAX-OG (10 - 100 nM) peut être utilisée comme un contrôle positif fiable. À noter que les concentrations d'OG inférieures à 0,025 % n'affectent pas directement la perméabilisation des LUV. Un traitement à 0,5 % de CHAPS est utilisé pour déterminer la quantité maximale de fluorescence des LUV par test, et cette valeur correspond à 100 %. Tous les traitements doivent être réalisés en triplets. Un exemple de configuration d'un test de contrôle des LUV est présenté dans Tableau 1, et les données correspondantes sont illustrées dans Figure 2A.
Un point de départ nécessaire pour l'étude de la perméabilisation des LUV par les protéines de la famille BCL-2 consiste à déterminer les concentrations optimales de BAX et de BID favorisant une libération maximale. Étant donné que différentes préparations protéiques présentent des activités de perméabilisation de fond variables, il est conseillé de réaliser un titrage avant d'entreprendre des analyses plus sophistiquées. Les concentrations de BAX (50 - 200 nM) et de BID (0 - 10 nM) doivent être ajustées de manière à obtenir une libération de fond minimale et une synergie optimale, comme illustré respectivement dans les Figures 2B-C. Différentes formes de la protéine BID peuvent être achetées auprès de R&amp;D Systems ; en alternative, le peptide correspondant au domaine BH3 de BID est disponible chez Anaspec. Aucune forme commerciale de BAX n'est adaptée aux essais sur LUV ; elle doit donc être exprimée et purifiée selon des méthodes publiées3,13.
Une fois les concentrations de BAX et de BID ainsi que leur synergie établies, un essai courant consiste à déterminer l'influence des protéines anti-apoptotiques sur la perméabilisation des LUV dépendante de BAX et de BID. BCL-xL est un membre anti-apoptotique de la famille BCL-2 disponible commercialement, qui inhibe de manière dose-dépendante l'activité de BAX et de BID, généralement dans une fourchette d'excès molaire de 5 à 10 fois par rapport à BAX ou BID (Figure 3A). Cet effet inhibiteur peut être inversé par l'ajout de protéines BH3-only ultérieures (excès molaire de 2 à 5 fois par rapport à BCL-xL) ou de peptides du domaine BH3 (excès molaire de 5 à 10 fois par rapport à BCL-xL), qui se lient à BCL-xL, permettant ainsi à BAX et BID de synergie et de perméabiliser les LUV (Figure 3B). Dans la Figure 3B, nous illustrons l'effet de la PUMAβ humaine recombinante complète, dont le peptide du domaine BH3 présente une fonctionnalité similaire (données non montrées)8. Cet essai est couramment appelé « essai de dé-répression », car la protéine PUMA supprime l'effet inhibiteur de BCL-xL sur BAX et BID. Idéalement, l'ajout de la protéine ou du peptide BH3-only dé-répresseur devrait avoir des effets minimes sur l'activation de BAX14.
<img alt="Schéma du processus de synthèse et de purification des lipides ; étapes détaillées de chromatographie et d'analyse des fractions." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. (A) Les lipides solubilisés dans le chloroforme sont combinés, séchés pour former un film lipidique, puis bouchonnés. (B) Des solutions d'ANTS et de DPX sont préparées, mélangées puis soniquées afin d'assurer une solubilisation et une homogénéisation complètes. La solution est ajoutée au film lipidique, le flacon est scellé avec du parafilm et soniqué pendant 5 min dans un bain d'eau. La solution apparaît alors laiteuse. (C) La solution lipidique soniquée est chargée dans l'extrudeuse miniaturisée, traitée 31 fois, puis ajoutée à une colonne Sepharose S-500 préparée pour une purification ultérieure. (D) Les fractions obtenues après chromatographie d'exclusion par taille sont analysées en comparant les unités de fluorescence relative (RFUs) dans le tampon LUV et le tampon LUV + 0,5 % de CHAPS. La mesure « tampon LUV » indique la fluorescence de fond avec des LUV intacts ; la condition « tampon LUV + 0,5 % CHAPS » montre un accroissement de fluorescence dû à la lyse, caractéristique des LUV. Les fractions 3 et 4 contiennent généralement les LUV et sont combinées après analyse. Les fractions 5 et 6 contiennent de l'ANTS non incorporé (i.e., pas à l'intérieur des LUV après extrusion), qui présente une forte fluorescence indépendamment du CHAPS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4291/4291fig1large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.
<img alt="Graphiques en barres montrant la perméabilisation des VLUs et les effets de la titration de BAX et BID ; graphique de l'intensité de fluorescence en fonction du temps." fo:content-width="5.45in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Expériences de contrôle de la famille BCL-2 et titrations de BAX/BID à l’aide de VLUs. (A) Expériences de contrôle. Les VLUs ont été traitées uniquement avec le tampon des VLUs, avec 0,025 % d’octylglucoside « OG », avec 50 nM de BAX ou avec 50 nM de BAX-OG. Les VLUs ont été incubées pendant 60 min à 37 °C. Le pourcentage (%) de perméabilisation est déterminé en soustrayant la fluorescence du traitement au tampon de toutes les échantillons ; la perméabilisation à 100 % est déterminée à l’aide d’un échantillon solubilisé par 0,5 % de CHAPS ; les valeurs expérimentales sont divisées par la valeur CHAPS afin d’obtenir le pourcentage de perméabilisation des VLUs. Le BAX-OG est une forme de BAX activée par un détergent, servant de contrôle positif fiable pour la perméabilisation des VLUs. (B) Détermination de la concentration optimale de BAX. Les VLUs ont été traitées avec des concentrations croissantes de BAX (50 - 200 nM) en présence de 10 nM de C8-BID « BID » ou du tampon seul. (C) Détermination de la concentration optimale de BID. Les VLUs ont été traitées avec des concentrations croissantes de BID (0 - 10 nM) en présence de 100 nM de BAX. (D) Exemple d’un ensemble de données cinétiques de perméabilisation des VLUs. Les VLUs ont été traitées avec BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Des mesures ont été effectuées toutes les deux minutes pendant 30 min, avec deux secondes d’agitation douce de la plaque avant chaque mesure. Les trois premières lectures (0, 2 et 4 min) ne sont pas incluses dans le graphique. Les unités de fluorescence relative (UFR) minimales et maximales ont été déterminées comme décrit dans la section 4.3. Les barres d’erreur dans les Figures 2A-C représentent l’écart type de données triplicates. Les données de la figure 2D proviennent d’un essai en double.
<img alt="Graphiques en barres de la perméabilisation des LUV ; influence de BID/BAX/BCL-xL et de PUMA ; analyse expérimentale." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Exemples d'interactions courantes au sein de la famille BCL-2 étudiées à l'aide de LUV. (A) La perméabilisation des LUV induite par BAX et BID est inhibée par BCL-xL. Les LUV ont été incubées avec 100 nM de BAX, 10 nM de BID et des concentrations croissantes de BCL-xL (0 - 500 nM). L'incubation des LUV a duré 60 min à 37 °C. (B) PUMA déréprime BCL-xL afin de favoriser l'activité de BAX et de BID. Les LUV ont été incubées avec des combinaisons de 100 nM de BAX, 10 nM de BID, 500 nM de BCL-xL et de PUMA (0 - 2,5 μM) pendant 60 min à 37 °C. PUMA a été utilisé à 2,5 μM avec BAX seul. Les barres d'erreur représentent l'écart type de données triplicates.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ordre d'ajout :</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONDITIONS</td>
			<td>LUV 
			Buffer</td>
			<td>OG 
			(0,7 %)</td>
			<td>BAX 
			(2,3 μM)</td>
			<td>OG-BAX 
			(2,3 μM)</td>
			<td>CHAPS 
			(10 %)</td>
			<td>LUVs 
			(2 mM)</td>
			<td>TOTAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>95 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG (0,015 %)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAX (50 nM)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td>-</td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG-BAX (50 nM)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS (0,5 %)</td>
			<td>90 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1. Un exemple de dosage témoin pour déterminer l'effet de OG-BAX sur la perméabilisation des LUV.

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d'intérêts déclaré.

La méthode décrite pour générer des VLG permet un moyen rapide et efficace de tester la fonction de diverses protéines de la famille BCL-2, de peptides et de réactifs associés dans un environnement membranaire défini sur le plan biochimique, similaire à celui de la MOM. Si l'on utilise des valeurs ponctuelles pour déterminer la perméabilisation des VLG, plusieurs plaques peuvent être préparées afin d'analyser des centaines de conditions au cours d'une seule journée. Nous constatons que les réactifs limitants dans ces dos...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph&amp;#8211;thanolamine &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine (Œuf, Poulet) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylinositol (Foie, Bovin) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylsérine (Cerveau, Porcin) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipine (Cœur, Bovin - Sel de sodium) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble mini-extrudeur</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Mémoire PC 0,2 mM</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Plaque Costar noire à 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-8 clivée BID humain</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>BCL-xL humain (moins extrémité C-terminale)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>Peptides des domaines BH3 de BID/PUMA</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques hybride Synergy H1 à modes multiples</td><td>BioTek</td><td>None</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;examen bcl-2 fonction famille avec de grandes vésicules unilamellaires

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

La famille des protéines BCL-2 (cellules B CLL/lymphome) comprend environ vingt membres qui coopèrent pour maintenir la survie cellulaire ou initier l'apoptose1. Suite à un stress cellulaire (par exemple, des lésions de l'ADN), les effecteurs pro-apoptotiques de la famille BCL-2, BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) et/ou BAX (BCL-2 associated X protein), s'activent et compromettent l'intégrité de la membrane mitochondriale externe (MME), par un processus appelé perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MME)1. Après la survenue de la MME, les protéines pro-apoptotiques (par exemple, le cytochrome c) pénètrent dans le cytoplasme, favorisent l'activation des caspases, et l'apoptose s'ensuit rapidement2.
Pour induire la perméabilisation mitochondriale externe (MOMP), BAK/BAX nécessitent des interactions transitoires avec des membres d'un autre sous-groupe de protéines pro-apoptotiques de la famille BCL-2, les protéines contenant uniquement le domaine d'homologie BCL-2 (BH3), telles que BID (agoniste du domaine d'interaction BH3)3-6. Les protéines anti-apoptotiques de la famille BCL-2 (par exemple le gène apparenté à BCL-2, isoforme longue, BCL-xL ; la leucémie des cellules myéloïdes 1, MCL-1) régulent la survie cellulaire en contrôlant étroitement les interactions entre BAK/BAX et les protéines BH3 uniquement capables d'activer directement BAK/BAX7,8. De plus, la disponibilité des protéines anti-apoptotiques BCL-2 est également régulée par des protéines BH3 uniquement de type sensibilisateurs/dérépresseurs, telles que BAD (antagoniste de la mort cellulaire BCL-2) ou PUMA (modulateur de l'apoptose induit par p53), qui se lient et inhibent les membres anti-apoptotiques7,9. Comme la majorité du répertoire des protéines anti-apoptotiques BCL-2 est localisé dans la membrane mitochondriale externe (OMM), la décision cellulaire de maintenir la survie ou d'induire la MOMP dépend de multiples interactions entre protéines de la famille BCL-2 au niveau de cette membrane.
 Les vésicules unilamellaires de grande taille (LUV) constituent un modèle biochimique permettant d'étudier les relations entre les interactions de la famille BCL-2 et la perméabilisation membranaire.10Les VUL sont composées de lipides définis assemblés selon des rapports identifiés dans les études de composition lipidique réalisées à partir de mitochondries de Xenopus extraites au solvant (46,5 % de phosphatidylcholine, 28,5 % de phosphatidyléthanolamine, 9 % de phosphatidylinositol, 9 % de phosphatidylsérine et 7 % de cardiolipine).10. Ce système de modèle constitue un outil pratique pour explorer directement la fonction de la famille des BCL-2, car les composants protéiques et lipidiques sont entièrement définis et accessibles, ce qui n'est pas toujours le cas avec les mitochondries primaires. Bien que la cardiolipine ne soit généralement pas présente à une concentration aussi élevée dans toute la membrane mitochondriale externe (OMM), ce modèle imite fidèlement l'OMM afin de favoriser la fonction de la famille des BCL-2. Par ailleurs, une modification plus récente du protocole ci-dessus permet d'effectuer des analyses cinétiques des interactions protéiques et des mesures en temps réel de la perméabilisation membranaire, basées sur des vésicules unilamellaires de grande taille (LUVs) contenant un colorant polyanionique (ANTS : acide 8-aminonaphtalène-1,3,6-trisulfonique) et un agent extincteur cationique (DPX : p-bromure de xylène-bis-pyridinium11Au fur et à mesure que les LUVs deviennent perméables, les molécules d'ANTS et de DPX diffusent séparément, entraînant une augmentation de la fluorescence qui est détectée. On décrit ici des combinaisons couramment utilisées de protéines recombinantes de la famille BCL-2 ainsi que des contrôles utilisant des LUVs contenant ANTS/DPX.

Les vésicules unilamellaires de grande taille (LUV) définies sur le plan biochimique constituent un système modèle pratique pour analyser les interactions des protéines de la famille BCL-2, avec des implications directes dans une meilleure compréhension de la voie mitochondriale de l'apoptose. Une méthode de production des LUV, ainsi que des combinaisons standard de protéines de la famille BCL-2 et des contrôles permettant d'examiner la perméabilisation des LUV, sont présentées.

L&#39;examen BCL-2 Fonction famille avec de grandes vésicules unilamellaires

La famille BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) est composée d'environ vingt protéines qui collaborent pour maintenir la survie cellulaire ou initier...

Ce système modèle biochimiquement défini de grandes vésicules Ella imite la membrane mitochondriale externe afin d'observer in vitro la fonction des protéines BCL-2. Tout d'abord, mélangez les lipides et formez un film lipidique dans un flacon scellé. Ensuite, préparez une solution fraîche de LUV et solubilisez le film lipidique.Ensuite, extrudez la solution lipidique et purifiez les grands LUV par filtration sur gel. La dernière étape consiste à analyser les LUV pour détecter une augmentation de la fluorescence induite par un détergent. En définitive, le système modèle de LUV est utilisé pour évaluer la fonction et la régulation de protéines perméables à la membrane, telles que les protéines BCL-2 recombinantes.Cette approche utilisant de grandes vésicules ular présente plusieurs avantages par rapport aux systèmes existants tels que les mitochondries. Les vésicules sont générées à partir de lipides purifiés en l'absence de protéines. Leur composition et leur taille sont définies sur le plan biochimique.Cela permet une interprétation claire des résultats, puisque les seules protéines étudiées sont celles que vous ajoutez. Cette méthode peut fournir des informations mécanistiques sur la capacité de la famille BCL-2 à réguler l'intégrité de la membrane mitochondriale externe. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes étudiant le remodelage membranaire et l'activité perméabilisante.Cela inclurait les machines dynamiques mitochondriales ou les toxines formant des bactéries. Travailler sous une hotte avec un éclairage minimal. Rincer une seringue en verre de type Hamilton Gast avec du chloroforme.Ensuite, dans un flacon en verre GL de 1,5 millilitre, combiner les quatre milligrammes de lipides solubilisés dans le chloroforme. Puis, pour éliminer le chloroforme, appliquer un léger courant de gaz inerte tel que l'azote ou l'argon. Après deux à trois heures, vérifier la présence d'un film lipidique sec au fond et sur les parois du flacon dans le tampon LUV.Préparez des solutions de 500 microlitres du colorant polyanionique et du vortex du réactif inactivateur ionique CAS. Les solutions à mélanger. Puis, combinez les solutions de NTS A et de DPX, vortexez pendant une minute et soniquez dans un bain d’eau ultrasonique afin de garantir que les solutions soient complètement solubilisées et homogènes.Ajoutez maintenant la solution A-N-T-S-D-P-X au film lipidique et scellez le flacon avec du film parafilm. Soniquez le film lipidique pendant cinq minutes. La solution apparaîtra laiteuse après la sonication. Assurez-vous que la solution est complètement solubilisée, car les agrégats lipidiques résiduels pourraient nuire aux étapes suivantes. Vérifiez également le fond et les parois du flacon afin de vous assurer qu'aucun film lipidique n'est resté.Assemblez l'extrudeuse conformément aux instructions du fabricant, en utilisant du tampon LUV pour humidifier les supports de filtre et la membrane en polycarbonate, puis serrez le boîtier de l'appareil afin d'éviter toute perte de volume durant l'extrusion, sans toutefois serrer excessivement. Pour rompre la membrane, testez l'extrudeuse avec le tampon LUV afin de vous assurer qu'il n'y a ni fuite ni problème. Remplissez ensuite la seringue de droite avec la solution lipidique et effectuez 31 passages pour que les grandes vésicules ELLA traversent la membrane au moins une fois et soient recueillies dans la seringue de gauche. Les premiers passages peuvent nécessiter une légère pression supplémentaire si la solution traverse soudainement la membrane rapidement.Vérifiez la membrane pour détecter toute rupture et remplacez-la si nécessaire. Ajoutez en une seule étape à la colonne. Évitez de perturber l'interface des billes.Laisser le tampon s’écouler de la colonne. Lorsque l’écoulement s’arrête, boucher la colonne et remplir doucement avec le tampon LUV, en prenant soin de ne pas perturber les billes. Ensuite, retirer le bouchon et recueillir six fractions d’un millilitre.Les AUV sont normalement élués dans les fractions trois et quatre et peuvent être identifiés par une apparence trouble afin de recycler le lavage de colonne et de le conserver à quatre degrés Celsius. Les UUV présents dans la fraction de colonne sont détectés par une augmentation de la fluorescence due à la présence de chaps. Pensez à utiliser des plaques noires opaques de 96 puits pour toutes les études de LUV.Introduisez 100 microlitres de tampon LUV ou de LUV contenant 0,5 % de CHAPS dans six puits. Ajoutez à chacun 5 microlitres de la fraction appropriée et mélangez pour la synergie biotechnologique H1. Ouvrez le logiciel Gen5 2.0, réglez la longueur d'onde d'excitation à 355 nanomètres et la longueur d'onde d'émission à 520 nanomètres.Régler la tension de gain à la position optique 125 en haut et augmenter la hauteur de lecture à 5,5 millimètres. Lisez maintenant la plaque à 37 degrés Celsius et identifiez les fractions contenant des LUV. Prélevez les fractions de LUV purifiés.Ces tests sont conçus pour mesurer la capacité des protéines BCL deux à induire directement la perméabilisation des vésicules unilamellaires de grande taille (LUV) ainsi que la régulation de l'activité de perméabilisation. Associez les composants du test dans l'ordre d'ajout. Des détails sur les titrations des protéines BS et bid sont disponibles dans le manuscrit accompagnant.Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant les intervalles de temps du dosage. Insérer la plaque dans le lecteur de microplaque, qui agitera la plaque et mesurera la fluorescence comme indiqué précédemment. Cette expérience utilise des billes activées par un détergent OG pour générer un contrôle positif de perméation des LUV.À noter, les concentrations d'OG inférieures à 0,025 % n'affectent pas directement la perméation des LUV ici. Un traitement à 0,5 % de CHAPS est également utilisé pour déterminer la quantité maximale de fluorescence des LUV par essai. Un point de départ nécessaire pour l'étude de la perméation des LUV par les protéines de la famille BCL-2 consiste à établir les concentrations de Bax et de Bid permettant une libération optimale.Ces courbes de titration de backs et de bid montrent une libération du fond minimale et une synergie optimale. Alternativement, la perméation des LUV peut être mesurée de manière cinétique. Ces mesures ont été effectuées toutes les deux minutes pendant 30 minutes, avec deux secondes d'agitation douce de la plaque avant chaque mesure.Cette expérience détermine l'influence d'une protéine anti-apoptotique sur la perméabilisation des LUV dépendante de Bax et Bid ici. BCL-XL inhibe l'activité de Bax et de Bid de manière dépendante de la dose. Dans un test de désinhibition, l'effet inhibiteur peut être inversé par l'ajout de protéines BH3 uniquement.Par exemple, la puma bêta se lie à BCL xl, permettant ainsi aux protéines backs et bid d'agir de manière synergique et de former des pores. Les grands vésicules ELLA. Une fois maîtrisée, cette technique de génération de grandes vésicules ular permet l'analyse rapide et efficace des protéines de la famille BCL deux, des peptides et des petites molécules dans un environnement biochimiquement défini, similaire à la membrane externe mitochondriale. Importamment, ce test permet l'analyse rapide de centaines de conditions à l'aide de paramètres cinétiques et de points finaux.N'oubliez pas que les deux protéines UUV et BCL sont très sensibles aux artéfacts induits par les détergents. Utilisez un matériel propre et sans détergent pour garantir des résultats reproductibles.

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