L'examen BCL-2 Fonction famille avec de grandes vésicules unilamellaires

Ce système modèle biochimiquement défini de grandes vésicules Ella imite la membrane mitochondriale externe afin d'observer in vitro la fonction des protéines BCL-2. Tout d'abord, mélangez les lipides et formez un film lipidique dans un flacon scellé. Ensuite, préparez une solution fraîche de LUV et solubilisez le film lipidique.

Ensuite, extrudez la solution lipidique et purifiez les grands LUV par filtration sur gel. La dernière étape consiste à analyser les LUV pour détecter une augmentation de la fluorescence induite par un détergent. En définitive, le système modèle de LUV est utilisé pour évaluer la fonction et la régulation de protéines perméables à la membrane, telles que les protéines BCL-2 recombinantes.

Cette approche utilisant de grandes vésicules ular présente plusieurs avantages par rapport aux systèmes existants tels que les mitochondries. Les vésicules sont générées à partir de lipides purifiés en l'absence de protéines. Leur composition et leur taille sont définies sur le plan biochimique.

Cela permet une interprétation claire des résultats, puisque les seules protéines étudiées sont celles que vous ajoutez. Cette méthode peut fournir des informations mécanistiques sur la capacité de la famille BCL-2 à réguler l'intégrité de la membrane mitochondriale externe. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes étudiant le remodelage membranaire et l'activité perméabilisante.

Cela inclurait les machines dynamiques mitochondriales ou les toxines formant des bactéries. Travailler sous une hotte avec un éclairage minimal. Rincer une seringue en verre de type Hamilton Gast avec du chloroforme.

Ensuite, dans un flacon en verre GL de 1,5 millilitre, combiner les quatre milligrammes de lipides solubilisés dans le chloroforme. Puis, pour éliminer le chloroforme, appliquer un léger courant de gaz inerte tel que l'azote ou l'argon. Après deux à trois heures, vérifier la présence d'un film lipidique sec au fond et sur les parois du flacon dans le tampon LUV.

Préparez des solutions de 500 microlitres du colorant polyanionique et du vortex du réactif inactivateur ionique CAS. Les solutions à mélanger. Puis, combinez les solutions de NTS A et de DPX, vortexez pendant une minute et soniquez dans un bain d’eau ultrasonique afin de garantir que les solutions soient complètement solubilisées et homogènes.

Ajoutez maintenant la solution A-N-T-S-D-P-X au film lipidique et scellez le flacon avec du film parafilm. Soniquez le film lipidique pendant cinq minutes. La solution apparaîtra laiteuse après la sonication. Assurez-vous que la solution est complètement solubilisée, car les agrégats lipidiques résiduels pourraient nuire aux étapes suivantes. Vérifiez également le fond et les parois du flacon afin de vous assurer qu'aucun film lipidique n'est resté.

Assemblez l'extrudeuse conformément aux instructions du fabricant, en utilisant du tampon LUV pour humidifier les supports de filtre et la membrane en polycarbonate, puis serrez le boîtier de l'appareil afin d'éviter toute perte de volume durant l'extrusion, sans toutefois serrer excessivement. Pour rompre la membrane, testez l'extrudeuse avec le tampon LUV afin de vous assurer qu'il n'y a ni fuite ni problème. Remplissez ensuite la seringue de droite avec la solution lipidique et effectuez 31 passages pour que les grandes vésicules ELLA traversent la membrane au moins une fois et soient recueillies dans la seringue de gauche. Les premiers passages peuvent nécessiter une légère pression supplémentaire si la solution traverse soudainement la membrane rapidement.

Vérifiez la membrane pour détecter toute rupture et remplacez-la si nécessaire. Ajoutez en une seule étape à la colonne. Évitez de perturber l'interface des billes.

Laisser le tampon s’écouler de la colonne. Lorsque l’écoulement s’arrête, boucher la colonne et remplir doucement avec le tampon LUV, en prenant soin de ne pas perturber les billes. Ensuite, retirer le bouchon et recueillir six fractions d’un millilitre.

Les AUV sont normalement élués dans les fractions trois et quatre et peuvent être identifiés par une apparence trouble afin de recycler le lavage de colonne et de le conserver à quatre degrés Celsius. Les UUV présents dans la fraction de colonne sont détectés par une augmentation de la fluorescence due à la présence de chaps. Pensez à utiliser des plaques noires opaques de 96 puits pour toutes les études de LUV.

Introduisez 100 microlitres de tampon LUV ou de LUV contenant 0,5 % de CHAPS dans six puits. Ajoutez à chacun 5 microlitres de la fraction appropriée et mélangez pour la synergie biotechnologique H1. Ouvrez le logiciel Gen5 2.0, réglez la longueur d'onde d'excitation à 355 nanomètres et la longueur d'onde d'émission à 520 nanomètres.

Régler la tension de gain à la position optique 125 en haut et augmenter la hauteur de lecture à 5,5 millimètres. Lisez maintenant la plaque à 37 degrés Celsius et identifiez les fractions contenant des LUV. Prélevez les fractions de LUV purifiés.

Ces tests sont conçus pour mesurer la capacité des protéines BCL deux à induire directement la perméabilisation des vésicules unilamellaires de grande taille (LUV) ainsi que la régulation de l'activité de perméabilisation. Associez les composants du test dans l'ordre d'ajout. Des détails sur les titrations des protéines BS et bid sont disponibles dans le manuscrit accompagnant.

Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant les intervalles de temps du dosage. Insérer la plaque dans le lecteur de microplaque, qui agitera la plaque et mesurera la fluorescence comme indiqué précédemment. Cette expérience utilise des billes activées par un détergent OG pour générer un contrôle positif de perméation des LUV.

À noter, les concentrations d'OG inférieures à 0,025 % n'affectent pas directement la perméation des LUV ici. Un traitement à 0,5 % de CHAPS est également utilisé pour déterminer la quantité maximale de fluorescence des LUV par essai. Un point de départ nécessaire pour l'étude de la perméation des LUV par les protéines de la famille BCL-2 consiste à établir les concentrations de Bax et de Bid permettant une libération optimale.

Ces courbes de titration de backs et de bid montrent une libération du fond minimale et une synergie optimale. Alternativement, la perméation des LUV peut être mesurée de manière cinétique. Ces mesures ont été effectuées toutes les deux minutes pendant 30 minutes, avec deux secondes d'agitation douce de la plaque avant chaque mesure.

Cette expérience détermine l'influence d'une protéine anti-apoptotique sur la perméabilisation des LUV dépendante de Bax et Bid ici. BCL-XL inhibe l'activité de Bax et de Bid de manière dépendante de la dose. Dans un test de désinhibition, l'effet inhibiteur peut être inversé par l'ajout de protéines BH3 uniquement.

Par exemple, la puma bêta se lie à BCL xl, permettant ainsi aux protéines backs et bid d'agir de manière synergique et de former des pores. Les grands vésicules ELLA. Une fois maîtrisée, cette technique de génération de grandes vésicules ular permet l'analyse rapide et efficace des protéines de la famille BCL deux, des peptides et des petites molécules dans un environnement biochimiquement défini, similaire à la membrane externe mitochondriale. Importamment, ce test permet l'analyse rapide de centaines de conditions à l'aide de paramètres cinétiques et de points finaux.

N'oubliez pas que les deux protéines UUV et BCL sont très sensibles aux artéfacts induits par les détergents. Utilisez un matériel propre et sans détergent pour garantir des résultats reproductibles.