Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

L’objectif global de cette procédure est d’observer le partitionnement des génomes viraux dans les cellules en division. Ceci est accompli en fabriquant d’abord un plasmide qui peut être visualisé par microscopie à fluorescence. Ici, un plasmide est conçu pour inclure des répétitions en tandem de la séquence de l’opérateur du lactose ou LAC O.La deuxième étape consiste à introduire le plasmide dans les cellules en division, suivi d’une infection des cellules par un rétrovirus codant pour le répresseur de lactose ou l’œil lac fusionné à une protéine fluorescente.

Les protéines de fusion du répresseur de lactose vont spécifiquement lier les séquences de l’opérateur du lactose dans le sous-plasmide. Les cellules sont surveillées par microscopie à fluorescence pour suivre les plasmides individuels à travers plusieurs cycles cellulaires. En fin de compte, les images acquises sont traitées pour déterminer comment les génomes viraux sont maintenus dans les cellules en division.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR quantitative, le transfert de Southern ou l’hybridation en fluorescence in situ, est que cette technique permet d’observer des plasmides individuels à plusieurs moments dans le temps. Pour permettre la visualisation du plasmide par microscopie à fluorescence, des techniques standard de clonage moléculaire sont utilisées pour introduire un fragment d’ADN contenant environ 250 copies de la séquence de l’opérateur du lactose ou LAC O dans le plasmide. Dans cet exemple, le plasmide est un milieu arrière d’environ 170 paires de kilobases qui contient l’intégralité du génome du virus de l’herpès associé au sarcome de la coiffe ou KSHV et code pour la résistance à l’hygromycine.

Introduisez l’ADN plasmidique contenant LAC O dans les cellules de mammifères hela et SLK par transfection Dans des boîtes de 60 millimètres, incubez des cellules avec 10 microgrammes de plasmide purifié, d’ADN 25 microlitres, de lipectomie, 2000 0,5 millilitres, Optum et 3,5 millilitres. DMEM pendant quatre heures. Changez le milieu en DMEM avec 10 % de sérum bovin fœtal et laissez les cellules se rétablir pendant 48 heures.

Par la suite, plaquez les cellules transfectées à faible densité dans de grandes boîtes et cultivez pendant trois semaines dans du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal et 300 microgrammes par millilitre d’hygromycine pour sélectionner le plasmide introduit, utilisez des morceaux de voyages stériles et du papier filtre trempé pour transférer les colonies résistantes à l’hygromycine dans de nouvelles boîtes de culture. Placez les boîtes dans l’incubateur après une à deux semaines, lorsque les clones transfectés ont poussé pour remplir l’ADN isolé de la boîte pour la digestion de restriction et le transfert méridional afin de s’assurer que le polymère du plasmide LAC O est homogène et de la taille attendue. Cet exemple de transfert montre que le polymère LAC O du premier clone est homogène et identique à celui du témoin positif.

Dans le couloir sept, si le plasmide n’a pas été conçu pour exprimer une fusion du répresseur de lactose lac infecter les clones appropriés avec un rétrovirus codant pour une protéine fluorescente rouge telle que l’œil lac, la tomate TD, la tomate TD est choisi au lieu de protéines fluorescentes plus proches du vert pour minimiser la phototoxicité qui se produirait lors d’expositions multiples sur de longues périodes. Une fois que la protéine de fusion oculaire LAC est introduite, la culture, les cellules en présence de 200 microgrammes par millilitre IPTG pour bloquer les protéines de fusion de lier l’ADN. L’un des aspects les plus critiques de cette procédure est l’obtention de clones avec l’intensité de fluorescence appropriée.

Un grand nombre de clones doivent être examinés pour identifier ceux dont la culture de fluorescence est optimale. Les cellules pendant au moins trois jours pour permettre l’expression des clones de dépistage de la protéine de tomate TD de l’œil LAC pour ceux qui ont des niveaux optimaux de l’œil de laque, la tomate TD qui révèlent des signaux distincts avec des niveaux de fond minimaux de protéine de fusion non liée, 24 à 48 heures avant d’imager les cellules exprimant la tomate LAC I TD les plaquent dans une boîte à fond de verre de 35 millimètres à une densité inférieure à 10 % de confluence. Cela permettra à des paires de cellules de se diviser en colonies de huit à 16 cellules sans se chevaucher une à trois heures avant le début de l’imagerie.

Rincez la plaque trois fois avec un milieu de culture qui ne contient pas à la fois de médicaments sélectifs et d’IPTG. Cela élimine les cellules non viables et permet aux protéines de fusion oculaire de se lier aux cytes LAC dans les plasmides. Remplacez le milieu de culture par deux millilitres, le DMEM par 10 % de sérum de veau fœtal et 25 millimolaires d’Hippies à incuber pendant une à trois heures juste avant l’imagerie, remplacez le haut de la boîte de culture par une feuille de culte étirée dans un anneau de montage pour une boîte de 35 millimètres.

Cette couverture inhibera l’évaporation du milieu de culture, ce qui augmenterait la concentration en sel au fil du temps et tuerait les cellules. Le système d’imagerie utilisé dans cette expérience se compose d’un microscope inversé Zeiss Axio 200 M, équipé d’une platine motorisée et d’une caméra CCD EM pour la détection sensible des signaux. La lumière d’excitation fluorescente est fournie par la LED blanche neutre d’un système Collima.

Le système d’imagerie est contrôlé par un logiciel permettant des acquisitions automatisées d’images sur de longs intervalles avec plusieurs piles Z. Un incubateur est utilisé pour maintenir les cellules à 37 degrés Celsius, 5 à 10 % de dioxyde de carbone dans une chambre humidifiée. Utilisez un collier chauffant pour l’objectif à huile afin d’éviter que l’objectif ne siphonne.

La chaleur de l’échantillon laisse suffisamment de temps au système pour atteindre une température stable. Pour minimiser les artefacts de mouvement pendant l’expérience, le système d’imagerie doit être placé sur une table d’air pour être isolé des vibrations. Pour commencer la procédure de visualisation de l’ADN marqué, utilisez l’imagerie DIC pour visualiser les cellules et déterminer le plan focal du haut et du bas des cellules dans plusieurs champs de vision dans chaque champ, déplacez-vous vers un plan focal à environ un tiers de la hauteur du haut de la cellule, enregistrez le x, y, Z dans la liste des positions de scène enregistrées.

Chacune de ces positions enregistrées sera le centre d’une série d’images pour capturer la cellule dans le logiciel de contrôle du microscope, définir une série d’images à effectuer à chaque position de la platine enregistrée, définir suffisamment de coupes pour que la cellule entière soit capturée avec des tranches supplémentaires au-dessus et en dessous des plans dans lesquels les cellules sont situées. Choisissez une taille de pas Z de 0,35 à 0,50 micron pour permettre un échantillonnage approximatif de Nyquist dans la dimension Z. Ces coupes permettent la détection suivant les mouvements des cellules pendant le cycle cellulaire et sont également utilisées dans le traitement post-acquisition des piles d’images.

Cela se traduira par une pile de 40 à 60 images selon l’épaisseur des cellules. Définir une expérience de série chronologique pour collecter une image en champ clair des Zacks à des intervalles de 30 minutes et des images de fluorescence à des intervalles de 10 à 60 minutes. N’utilisez pas l’imagerie DIC pendant l’expérience, car elle nécessite plus de lumière que l’imagerie en fond clair standard, ce qui peut exposer inutilement les cellules à la phototoxicité au cours de longues expériences.

Démarrez l’expérience contrôlée par logiciel. Assurez-vous que le système n’est pas perturbé pendant l’expérience. Une fois que toutes les images de l’expérience ont été acquises, examinez les images de chaque Zack et recadrez toutes les zones inutiles des images pour réduire le temps de traitement de l’ordinateur.

À l’étape suivante, réattribuer l’intensité du signal au pixel d’origine dans chaque pile Z. Utilisez un algorithme de déconvolution dans le logiciel de vision Axio basé sur la fonction d’étalement du point mesuré du système d’imagerie. Le résultat de la déconvolution est illustré ici.

Examinez les images pour suivre les changements d’intensité et les mouvements des plasmides au cours du cycle cellulaire et la répartition des plasmides entre les cellules filles. Ces images, qui sont faites par calcul pour inclure plusieurs plans Z dans lesquels résident les différents signaux, montrent que les noyaux des cellules HELOC exprimant LAC eye TD tomato sont fluorescents en raison du signal de localisation nucléaire sur la protéine de fusion, la localisant dans le noyau. En l’absence d’I-P-T-G-K-S-H-V, les génomes codant pour les séquences LAC O recrutent de nombreuses copies de la protéine fluorescente et se démarquent comme des signaux brillants sur l’intensité de fond du noyau.

En revanche, en présence d’IPTG, les protéines fluorescentes de l’œil LAC sont empêchées de se lier à sa reconnaissance manque de séquence O, projections d’intensité maximale de Zack acquises d’un cycle cellulaire he a à cinq temps. Les points d’une expérience représentative sont illustrés sur cette figure. Les génomes viraux marqués par fluorescence dans la cellule visible dans le panneau A sont synthétisés dans le panneau B.Les génomes viraux sont ensuite divisés en cellules filles lors de la division cellulaire, comme observé dans les panneaux C, D et E.Le cycle cellulaire des cellules HELOC saines dure environ 24 heures, et les cellules filles se fixent généralement les unes à côté des autres et se divisent en même temps dans le cycle cellulaire suivant.

En utilisant ce protocole, les génomes viraux de la cellule peuvent être suivis pendant plusieurs générations lors de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de surveiller la morphologie des cellules au moment de la génération pour s’assurer que les cellules sont saines tout au long de l’expérience.