Name: Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence pour visualiser la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères sur plusieurs générations. Cette technique permet d'observer en temps réel le comportement des génomes viraux.

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Ce travail a été financé par des subventions du NIH et de l&#39;ACS, y compris T32CA009135, CA133027, CA070723, CA022443 et. Le projet de loi Sugden est un professeur American Cancer Society Research.

1. Ingénierie des cellules avec des plasmides visibles <ol><li> Utilisez une digestion de restriction standard ou techniques de recombinaison homologue pour introduire un fragment d&#39;ADN contenant environ 250 copies de la séquence opérateur lactose (LACO) dans le plasmide pour être visualisées. Notre plasmide est un bacmide d&#39;environ 170 kpb et contenant le génome complet de sarcome de Kaposi associé au virus de l&#39;herpès (KSHV) et la résistance à l&#39;hygromycine codé 12. </li><li> Présentez-Laco contenant de l&#39;ADN plasmidique dans les cellules de mammifères par transfection avec Lipofectamine 2000. Nous avons transfecté des cellules HeLa et SLK en boîtes de 60 mm pour 4 h avec 10 ug d&#39;ADN plasmidique purifié avec 25 ul de Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, et 3,5 ml de DMEM. </li><li> Changer le milieu de culture à 5 ml de DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin cellules et incuber pendant 48 h. </li><li> Plaque les cellules à faible densité dans de grands plats et des cellules de culture dans un milieu contenant un antibiotique de sélection pour l&#39;introduction plasmid; nous avons sélectionné les cellules dans du DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal avec 300 pg / ml d&#39;hygromycine pendant 3 semaines. </li><li> Utilisez des morceaux de stériles, la trypsine imbibé de papier filtre pour transférer hygromycine colonies résistantes à de nouvelles boîtes de culture. </li><li> Lorsque clones transfectés sont cultivés à remplir le récipient métallique, pour isoler l&#39;ADN digestion de restriction et de Southern blot en sorte que le polymère du plasmide lacO est homogène et de la taille attendue. </li><li> Si le plasmide n&#39;a pas été modifié pour exprimer une fusion de LacI, infecter clones appropriés avec un rétrovirus codant pour le répresseur lactose (LACI) fusionné à une protéine fluorescente rouge, comme LacI-tdTomato. Nous utilisons tdTomato plutôt que de protéines qui sont fluorescents rapprocher au vert pour réduire photoxicity qui se produirait à partir de multiples expositions plus longues durées 13. </li><li> Une fois la protéine de fusion est introduite LacI, la culture des cellules en présence de 200 ug / ml d&#39;isopropyl-bD-galactoside (IPTG) pour bloquer les protéines de fusion de liaisonADN. </li><li> Culture des cellules pendant au moins 3 jours pour permettre l&#39;expression de la protéine LacI-tdTomato. </li><li> Clones écran (en emportant l&#39;IPTG et la visualisation des cellules comme décrit ci-dessous) pour les personnes ayant des niveaux optimaux de LacI-tdTomato qui révèlent signaux distincts avec des niveaux de fond minimal de protéine de fusion non liée. </li></ol> 2. Développement du système d&#39;imagerie Notre système d&#39;imagerie se compose d&#39;un Zeiss Axiovert 200M équipé d&#39;une platine motorisée et le Plan-Aochromat 63x/1.4 objectif huile. La lumière d&#39;excitation de fluorescence est fourni par le &quot;blanc neutre&quot; d&#39;un système de LED Colibri. D&#39;émission est détecté par une CascadeII: 1024 EMCCD caméra. Il s&#39;agit d&#39;un refroidissement, la caméra de recul dilué avec un registre de gain pour amplifier des signaux, le courant d&#39;obscurité est 0,061 électrons par pixel par seconde, et l&#39;efficacité quantique est supérieur à 0,90. Le système est contrôlé par le logiciel AxioVision 4.8, y compris le module SmartExperiments. Pour la détection de tdTomad&#39;, nous utilisons un jeu de filtres Zeiss 75HE pour laquelle 85% de la lumière qui passe peut exciter le fluor et 95% de la lumière émise passeront le filtre d&#39;émission. <ol><li> Assembler un système de formation d&#39;image avec un microscope inversé et une caméra pour la détection sensible EMCCD de signaux, une source de lumière LED pour l&#39;excitation spécifique et rapide de coffrage, et une platine motorisée bras principale, et le contrôle de logiciels pour l&#39;acquisition automatique d&#39;images de plus longs intervalles de temps multiples avec z-piles. Le système doit reposer sur une table pneumatique à être isolé des vibrations. </li><li> Monter un incubateur étape-top pour maintenir les cellules à 37 ° C, 5-10% de CO 2 dans une chambre humidifiée. Prévoyez suffisamment de temps pour que le système atteindre une température stable pour minimiser les artéfacts de mouvement pendant l&#39;expérience. </li><li> Utiliser un collier chauffant pour objectif d&#39;empêcher le siphonnage objectif de la chaleur à partir de l&#39;échantillon. </li></ol> 3. Visualisation de l&#39;ADN marqué <ol><li> Cellules de la plaque de 35 mmverre à fond plat, à une densité de confluence moins de 10%, ce qui permettra aux paires de cellules à se diviser en colonies de 8-16 cellules sans chevauchement. Pour ce faire, au moins 24-48 heures avant l&#39;imagerie de telle sorte que les cellules viables ont le temps de se diviser. </li><li> Un à trois heures avant le début de la formation d&#39;image, la plaque de rinçage 3 fois avec du milieu de culture dépourvu de ces deux médicaments sélectifs et IPTG. Cette procédure nettoie les cellules non viables et permet Laci protéines de fusion pour lier les sites Laco dans les plasmides. </li><li> Remplacez le milieu de culture avec 2 ml de DMEM avec 10% de sérum de veau foetal et 25 mM d&#39;HEPES. </li><li> Remplacer la partie supérieure de la boîte de culture avec CultFoil étiré dans une bague de montage pour un plat de 35 mm. Cette couverture va inhiber l&#39;évaporation du milieu de culture, ce qui augmenterait la concentration de sel dans le temps et tuer les cellules. </li><li> Utiliser interférence contraste différentiel (DIC) d&#39;imagerie pour visualiser les cellules et déterminer le plan focal de la partie supérieure et inférieure des cellules dans plusieurs champs de vision.Dans chaque domaine, passer à un plan focal d&#39;environ 1/3 de la voie à partir du haut de la cellule. Enregistrer les coordonnées x, y, z dans la liste des postes de scène enregistrés. Remarque: Les signaux plasmides peut ne pas être visible à travers les oculaires lorsque les cellules sont éclairées par des LED de la longueur d&#39;onde appropriée pour la protéine de fusion LacI. Signaux faibles ne peuvent être visibles à l&#39;utilisation de l&#39;appareil photo EMCCD, ce qui permet l&#39;intégration du signal dans le temps et donc amplifie efficacement des signaux faibles. </li><li> Dans le logiciel de commande microscope, définir une z-pile d&#39;images devant être effectuées au niveau de chaque position de phase enregistrée. Choisissez la taille de l&#39;étape az 0,35 à 0.50 pm, ce qui vous permettra de Nyquist d&#39;échantillonnage approximative dans la dimension z 14. Inclure les &quot;extra&quot; tranches au-dessus et en dessous des plans dans lesquels se trouvent les cellules, ces tranches de permettre la détection suivre les mouvements cellulaires au cours du cycle cellulaire, et sont également utilisés dans le traitement post-acquisition (déconvolution) des piles d&#39;images. Cette inclusion seraentraîner une pile de 40-60 images, en fonction de l&#39;épaisseur des cellules. </li><li> Dans le logiciel de contrôle de microscope, de définir une expérience de séries chronologiques pour recueillir une image de champ lumineux de la z-piles à intervalles de 30 min (pour le suivi des divisions cellulaires et les migrations sur de longues périodes) et des images de fluorescence à 10-60 minutes d&#39;intervalle (pour visualiser des plasmides à l&#39;intérieur des cellules). Ne pas utiliser l&#39;imagerie DIC cours de l&#39;expérience, car elle nécessite plus de lumière que l&#39;imagerie standard du champ lumineux, ce qui peut exposer les cellules inutilement à la phototoxicité au cours de longues expériences. </li><li> Commencez l&#39;expérience contrôlée par logiciel. Assurez-vous que le système n&#39;est pas perturbé (frappée, exposé à la lumière ambiante excessive, etc) pendant l&#39;expérience. </li><li> Le cas échéant, remplacer l&#39;eau dans le système d&#39;humidification lors de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Post-traitement des images d&#39;acquisition <ol><li> Passez en revue les images pour chaque point z-pile et le temps. Rogner sur les zones inutiles d&#39;les images afin de réduire le temps de traitement de l&#39;ordinateur à l&#39;étape suivante. </li><li> Utiliser un algorithme de déconvolution pour ré-attribuer à l&#39;intensité du signal du pixel d&#39;origine de chaque pile 15-z. Bien que cette déconvolution peut être basée sur une fonction d&#39;étalement du point théorique de votre système d&#39;imagerie, il est préférable de mesurer la fonction d&#39;étalement de point de votre système d&#39;imagerie par microsphères fluorescentes, et d&#39;utiliser cette mesure dans l&#39;algorithme de déconvolution. Nous avons mesuré la fonction d&#39;étalement de point de notre système d&#39;imagerie et appliqué un. Limité algorithme itératif du maximum de vraisemblance dans AxioVision logiciel (description du logiciel AxioVision, Zeiss) </li><li> Examinez les images pour suivre les changements d&#39;intensité et les mouvements des plasmides cours du cycle cellulaire et la séparation des plasmides dans les cellules filles. </li></ol>

<ol><li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li>
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<li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+Kaposi%27s+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode décrite ici peut être utilisé pour suivre en direct plasmides dans les cellules de mammifères au cours du temps couvrant plusieurs générations. En limitant l&#39;exposition à la lumière d&#39;excitation, nous avons utilisé ces techniques pour suivre les cellules de paires nouvellement divisées par des colonies de cellules 16-32, représentant au moins 72 heures et 3 divisions cellulaires. Ces expériences fournissent des informations qui ne peuvent être obtenues à partir d&#39;essais statiques telles que la PCR...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfate de streptomycine </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycine </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 pg / ml pour SLK, 300 pg / ml pour HeLa </td></tr><tr><td> Isopropyl-bD-galactoside (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Concentration finale de 200 pg / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> À fond de verre plats </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Neutre LED blanche </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Cube filtre 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif 63x/1.4 Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD caméra </td><td> Photométrie </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> TempControl mini- </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> TempControl 37-2 numérique </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI 3700 Contrôleur numérique </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif chauffe </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Étape de chauffage insert P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Stage-dessus Incubateur S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Système humidificateur </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Peu de plasmides d&#39;origine naturelle sont maintenus dans des cellules de mammifères. Parmi ceux-ci sont des génomes des herpèsvirus gamma, y compris les virus Epstein-Barr (EBV) et sarcome de Kaposi associé au virus de l&#39;herpès (KSHV), qui provoquent de multiples tumeurs malignes humaines 1-3. Ces deux génomes sont répliquées de manière licence, chacun utilisant une seule protéine virale et de la machinerie de réplication cellulaire, et sont transmis aux cellules filles lors de la division cellulaire en dépit de leurs centromères traditionnels manquent 4-8. Beaucoup de travail a été fait pour caractériser les répliques de ces génomes plasmidiques en utilisant des méthodes telles que transfert de Southern et hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces méthodes sont limitées, cependant. PCR quantitative et transferts de Southern fournir des informations sur le nombre moyen de plasmides par cellule dans une population de cellules. FISH est un test unicellulaire qui révèle à la fois le nombre et la répartition moyenne de plasmide<html> s par cellule dans la population de cellules, mais est statique, ce qui permet pas d&#39;informations sur la société mère ou la descendance de la cellule examinée. Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser plasmides dans des cellules vivantes. Cette méthode est basée sur la liaison d&#39;une protéine fluorescente marqués répresseur lactose à des sites multiples dans le plasmide d&#39;intérêt 9. L&#39;ADN d&#39;intérêt est conçu pour inclure environ 250 répétitions en tandem de l&#39;opérateur lactose (lacO) séquence. LacO est spécifiquement lié par la protéine répresseur lactose (LACI), qui peut être fusionnée à une protéine fluorescente. La protéine de fusion peut être exprimée à partir du plasmide génétiquement ou introduit par un vecteur rétroviral. De cette façon, les molécules d&#39;ADN sont marqués par fluorescence et deviennent donc visibles par microscopie à fluorescence. La protéine de fusion est bloquée de lier l&#39;ADN plasmidique par culture de cellules en présence d&#39;IPTG jusqu&#39;à ce que les plasmides sont prêtes à être visualisées. ontenu &quot;&gt; Ce système permet aux plasmides à surveiller dans les cellules vivantes à travers plusieurs générations, révélant les propriétés de leur synthèse et de partitionnement aux cellules filles. Idéal cellules sont adhérentes, facilement transfectées, et ont de gros noyaux. Cette technique a été utilisée pour déterminer que 84% de l&#39;EBV plasmides dérivés sont synthétisés chaque génération et 88% de la partition nouvellement synthétisé plasmides fidèlement aux cellules filles dans des cellules HeLa. Paires de ces plasmides EBV ont été vus pour être attachés ou associés à chromatides sœurs après leur synthèse dans S- phase jusqu&#39;à ce que ils ont été vus pour séparer les chromatides sœurs séparés dans Anaphase 10. La méthode est actuellement utilisée pour étudier la réplication des génomes KSHV dans des cellules HeLa et les cellules SLK. cellules HeLa sont immortalisés cellules épithéliales humaines, et les cellules sont immortalisées SLK endothéliales humaines cellules. Bien que les cellules SLK ont été à l&#39;origine dérivé d&#39;une lésion KSHV, ni la lignée cellulaire HeLa, ni SLK naturellement harbeurs génomes KSHV 11. En plus d&#39;étudier la réplication virale, cette technique de visualisation peut être utilisée pour étudier les effets de l&#39;ajout, la suppression ou la mutation des divers éléments de séquence d&#39;ADN sur la synthèse, la localisation et le partitionnement des autres recombinantes ADN plasmidiques.

<html> Les projections d&#39;intensité maximale de Z-piles acquises dans une expérience représentative sont présentés dans la figure 3. Typiques des signaux plasmide sont présents dans 3-8 tranches de la z-stack, selon qu&#39;ils représentent unique ou de groupes de plasmides. Dans le cas de l&#39;EBV et KSHV plasmides dérivés, les signaux se déplacent lentement à l&#39;intérieur de la cellule jusqu&#39;à ce que la pile atteint la mitose. Les cellules elles-mêmes migrent au cours de l&#39;expérience. Ils...

Procédé d&#39;observation des molécules d&#39;ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d&#39;une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d&#39;ingénierie dans l&#39;ADN d&#39;intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Peu de plasmides naturels sont maintenus dans les cellules mammaliennes. Parmi ceux-ci figurent les génomes de gamma-herpèsvirus, notamment le virus d'Epstein-Barr (EBV)...

L'objectif général de cette procédure est d'observer la répartition des génomes viraux dans les cellules en division. Cela est réalisé en premier lieu en construisant un plasmide pouvant être visualisé par microscopie de fluorescence. Ici, un plasmide est conçu pour inclure des répétitions en tandem de la séquence opérateur de la lactose, ou LAC O. La deuxième étape consiste à introduire le plasmide dans des cellules en division, suivie de l'infection des cellules par un rétrovirus codant pour le répresseur de la lactose, ou lac eye, fusionné à une protéine fluorescente.Les protéines de fusion du répresseur de lactose se lieront spécifiquement aux séquences opérateurs du lactose présentes sur le plasmide sub. Les cellules sont observées par microscopie à fluorescence afin de suivre les plasmides individuels au cours de plusieurs cycles cellulaires. En fin de compte, les images obtenues sont traitées pour déterminer comment les génomes viraux sont maintenus dans les cellules en division.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR quantitative, le transfert Southern ou l'hybridation in situ par fluorescence, est qu'elle permet d'obser

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Un procédé basé sur des protéines fluorescentes de cellules vivantes pour éclairer des vacuoles cellulaires (inclusions) contenant Chlamydia est décrit. Cette stratégie permet une détermination rapide et automatisée de l’infectiosité de Chlamydia dans les échantillons et peut être utilisée pour étudier quantitativement la dynamique de croissance des inclusions.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Les études de biomolécules in vivo sont cruciales pour comprendre la fonction moléculaire dans un contexte biologique. Nous décrivons ici une nouvelle méthode permettant l’internalisation de biomolécules fluorescentes, telles que l’ADN ou les protéines, dans des micro-organismes vivants. L’analyse des données in vivo enregistrées par microscopie à fluorescence est également présentée et discutée.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

Notre approche expérimentale fournit une stratégie pour suivre l'abondance plasmide et la résistance aux antibiotiques au fil du temps dans les populations bactériennes.

Quantification de la résistance aux antibiotiques médiées par Plasmid dans une approche expérimentale d'évolution

Un flux de travail microfluidique accessible et open-source est présenté pour l’analyse parallélisée de la rétention plasmidique chez les bactéries. En utilisant la microscopie à fluorescence pour quantifier la présence de plasmides dans des microcolonies unicellulaires au sein de microgouttelettes de gel, cette méthode offre une alternative précise, accessible et évolutive au comptage traditionnel sur plaque.

Analyse de la stabilité des plasmides avec la microfluidique de gouttelettes open source

Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence pour visualiser la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères sur plusieurs générations. Cette technique permet d'observer en temps réel le comportement des génomes viraux.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

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