Synthèse de la Phase-shift nanoémulsions à distributions de taille étroite de vaporisation des gouttelettes acoustique et bulles améliorée échographie médiée par ablation

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'effet des bulles générées par la vaporisation acoustique d'émulsions nano-lipidiques sur l'ablation médiée par ultrasons. Ceci est réalisé en dispersant d'abord des émulsions nano-lipidiques dans des hydrogels d'acrylamide chargés d'albumine. Dans un deuxième temps, un transducteur focalisé émet des impulsions courtes et de haute amplitude dans l'hydrogel, provoquant la vaporisation locale des nano-émulsions au foyer. Ensuite, les bulles résultantes sont continuellement excitées par ultrasons, et l'énergie acoustique rayonnée par ces bulles est rapidement absorbée par l'hydrogel, ce qui accélère le taux de chauffage médié par ultrasons.

Les résultats montrent que la présence de bulles réduit considérablement le temps et l'énergie nécessaires pour chauffer l'hydrogel au-delà de la température seuil de dénaturation des protéines, entraînant une ablation médiée par ultrasons plus rapide et plus efficace. La taille de la nanoémulsion à changement de phase constitue un facteur déterminant critique pour le seuil de pression. Pour la vaporisation acoustique, nous avons mis au point un protocole permettant de produire des nanoémulsions stables à changement de phase, présentant des distributions de taille étroites et des seuils de vaporisation bien définis, ainsi qu'un système in vitro pour évaluer leur impact sur l'ablation par ultrasons.

Bien qu'un système in vitro soit décrit, la conception des nanoémulsions vise à cibler les tissus extravasculaires et les tumeurs solides à l'aide de particules pouvant être vaporisées de manière acoustique. Les bulles formées peuvent ensuite être utilisées à des fins diagnostiques ou thérapeutiques dans la prise en charge du cancer. Pour commencer la procédure de préparation d'une nanoémulsion à changement de phase, ou PSNE, mélangez d'abord les lipides ensemble en dissolvant 11 milligrammes de DPPC et 1,7 milligramme de DSPE.

Placez le PEG 2000 dans du chloroforme dans un ballon rond en verre. Placez le ballon rond dans un bain d'eau à 50 degrés Celsius sous la hotte chimique, et utilisez un courant de gaz argon pour évaporer le solvant organique. Pour former un film lipidique sec, placez le ballon dans un dessiccateur et laissez-le sous vide toute la nuit afin de dessécher le film lipidique, le lendemain matin.

Réhydratez le film lipidique avec 5,5 millilitres de PBS. Chauffez la solution dans un bain-marie à 45 degrés Celsius jusqu'à dissolution du film lipidique pour la mise en suspension. Transférez périodiquement la solution lipidique dans un flacon de sept millilitres, puis soniquez avec un sonicateur à sonde pendant deux minutes à une amplitude de 20 %.

Diviser la solution en deux vials de 2,5 millilitres chacun. Les 0,5 millilitres restants sont éliminés. Ajouter 2,5 millilitres de PBS dans chaque vial, puis placer les deux vials dans un bain d’eau glacée à zéro degré Celsius.

Ajouter 50 microlitres de doca fluoro pentane, ou DDFP, à chaque échantillon. Fils du mélange lipidique DDFP. Dans un bain d’eau glacée se trouve la partie la plus critique de cette procédure.

Le bain d'eau glacée sert à prévenir l'évaporation du liquide par fluorocarbone. Pendant ce processus, soniquez chaque tube dans le bain d'eau glacée en utilisant les paramètres suivants : amplitude à 25 %, mode pulsé, et durée totale de 60 secondes. Après la sonication, transférez la solution PSNE dans des tubes scintillants de 20 millilitres en ajoutant 5 millilitres de PBS à chaque tube, ce qui donne un volume final de 10 millilitres par tube.

Assemblez l'extrudeuse en suivant les instructions du fabricant afin de préparer l'extrudeuse. Pipetez 10 millilitres d'eau déionisée dans le port d'échantillonnage supérieur. Bouchonnez l'ouverture et serrez la vanne de purge.

Ouvrir lentement la ligne de gaz azote pour augmenter la pression, forçant ainsi l'échantillon à traverser les membranes. Recueillir l'échantillon à partir du tube de sortie, extruder le PSNE 16 fois à travers un filtre de 100 nanomètres ou de 200 nanomètres afin d'obtenir une distribution étroite de tailles. Commencer cette procédure en préparant un hydrogel de polyacrylamide contenant le PSNE.

Préparez d'abord une solution à 24 % d'albumine de sérum bovin ou BSA en dissolvant 2,4 grammes de poudre de BSA dans 10 millilitres d'eau déionisée. Préparez ensuite une solution à 10 % de persulfate d'ammonium ou aPS en diluant un gramme de poudre d'aPS dans 10 millilitres d'eau déionisée. Mélangez ces réactifs dans un moule en plastique dans l'ordre suivant : 2,1 millilitres de solution d'acrylamide, 1,2 millilitres de tampon tris, 0,1 millilitre de solution à 10 % d'aPS, 4,5 millilitres de solution à 24 % de BSA et 3,6 millilitres d'eau déionisée. Chauffez la solution à 40 degrés Celsius dans un bain-marie, puis placez-la sous vide pendant une heure afin de dégazer le liquide.

Cela est nécessaire pour éviter la formation de bulles indésirables dans l'hydrogel après une heure. Retirer du vide, ajouter 480 microlitres de suspension de PSNE et mélanger soigneusement en faisant tourner doucement la chambre en plastique. Dans une hotte chimique, ajouter 12 microlitres de tétraéthylène, d'éthylène diamine ou de T-E-M-E-D afin de polymériser l'acrylamide, puis placer la chambre dans un bain d'eau à 12 degrés Celsius pendant deux heures.

La polymérisation est exothermique, donc un bain froid est nécessaire pour éviter la vaporisation du PSE pendant la polymérisation. Une fois la polymérisation de l'acrylamide terminée, placez un transducteur d'énergie focalisé et une sonde d'imagerie dans un réservoir acrylique rempli d'eau désionisée DGA de manière à ce que le plan d'imagerie coïncide avec le volume focal du transducteur. Ensuite, placez l'hydrogel de polyacrylamide chargé en PSNE au foyer du transducteur d'énergie, puis vaporisez le PSNE à l'intérieur de l'hydrogel à l'aide d'impulsions acoustiques brèves, suivies d'une exposition en onde continue de 15 secondes pour une ablation améliorée par bulles.

Comme la BSA est dénaturée, l'hydrogel devient opaque en raison de l'absorption des ultrasons et de la génération de chaleur entraînant la vaporisation du moniteur et la formation de bulles à l'aide d'un scanner à ultrasons diagnostiques. Dans cette image d'exemple, la flèche indique la région focale où un nuage de bulles a été formé par la vaporisation des PSNE. Répétez l'exposition acoustique à un nouvel emplacement dans l'hydrogel sans retirer les PSNE afin de comparer le temps et le volume d'ablation.

Ce protocole permet d'obtenir des gouttelettes de fluorocarbone enrobées de lipides présentant une distribution de taille étroite. La distribution de taille mesurée par diffusion dynamique de la lumière est présentée ici pour des PSNE extrudés à l’aide de filtres de 100 et 200 nanomètres. Les unités des axes des ordonnées sont basées sur l’intensité de la lumière diffusée par des particules de taille donnée par rapport à l’intensité totale de la lumière diffusée par l’échantillon.

Lorsque le diamètre moyen et l'écart type des PSNE à un et sept jours après extrusion à l'aide de filtres de 100 et 200 nanomètres sont mesurés par diffusion dynamique de la lumière, les résultats montrent que les PSNE sont stables pendant au moins une semaine. Cette figure présente des images en mode B des PSNE avant et après vaporisation. Dans un hydrogel de polyacrylamide, la flèche indique la région focale où un nuage de bulles a été formé par la vaporisation des PSNE.

Il s'agit d'images d'un hydrogel de polyacrylamide contenant de l'albumine et des PSNE avant et après la vaporisation et la sonication par ultrasons focalisés de haute intensité ou Hy Fu. Une lésion est formée par 15 secondes de chauffage induit par Hy Fu. La forme asymétrique de la lésion résulte d'un chauffage préfocal dû à la présence d'un nuage de bulles sur le trajet des ultrasons. Le chauffage préfocal et la formation de la lésion dus à la diffusion provoquée par les bulles peuvent être minimisés en réduisant la puissance acoustique transmise après son développement.

Cette méthode de production d'émulsions nano-métriques à changement de phase stable ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie assistée par ultrasons pour explorer l'ablation HIFU améliorée par bulles dans les tumeurs solides. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des émulsions nano-métriques à changement de phase stable avec des distributions de taille étroites et d'étudier la nucléation des bulles ainsi que l'ablation améliorée par ultrasons.