Un protocole simple pour agglutination des plaquettes induite par des

Cette procédure fournit des directives normalisées pour réaliser des tests d'agglutination médiés par les plaquettes à partir d'isolats cliniques ou de laboratoire de Plasmodium falciparum. Tout d'abord, prélève du sang sur un patient infecté et isole les érythrocytes parasités par centrifugation, puis cultive et purifie les stades asexués matures. Ensuite, prélève du sang sur un donneur sain afin de préparer et de normaliser le plasma riche en plaquettes par centrifugation.

Associer les plaquettes et les érythrocytes parasités pour le test d'agglutination. Dire que les résultats de la microscopie par immunofluorescence peuvent montrer des agrégats de P. falciparum médiés par les plaquettes. Cette technique est spécifiquement conçue pour mesurer le phénotype d'agglutination de Plasmodium falciparum.

Isolats cliniques dans un contexte à ressources limitées. Des variations minimes des procédures ont été signalées comme augmentant l'influence sur les résultats de l'acide de clumping sur le terrain. Un protocole clair et facile à suivre, adapté aux contextes à faibles ressources, afin d'assurer une standardisation entre les sites d'étude endémiques pour le paludisme, était donc nécessaire. Dans un tube sous vide contenant du citrate de sodium, prélever environ cinq millilitres de sang total à partir d'un hôte naïf au paludisme ou 2,5 millilitres de sang à partir de patients atteints de paludisme CM ou SM.

Centrifuger le sang total à 250 G pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférer soigneusement le surnageant trouble dans un tube propre de 15 millilitres. Garder à l'esprit que les plaquettes sont facilement activées par les variations de température et les chocs physiques.

Numérez la suspension de PRP à l’aide d’un cytocompteur hémocyto-métrique annoy bower's et ajustez-la à la concentration souhaitée avec du PBS afin d’obtenir un culot de plasma pauvre en plaquettes. La majorité des plaquettes provenant d’une portion de la fraction de PRP est séparée par centrifugation à 1500 ×g pendant 10 minutes. Conservez les fractions de PRP et de PPP à quatre degrés Celsius pendant huit à dix jours maximum. Il est préférable d’utiliser des plaquettes fraîches pour le test d’agrégation.

Laver les globules rouges périphériques en culot trois fois avec cinq à 10 millilitres de RPMI 1640 dans un flacon de culture. Compléter les GRP avec un milieu de culture standard pour le paludisme et des globules rouges frais non infectés afin d'obtenir un hématocrite de 5 %. Perméabiliser les flacons de culture avec un mélange de 92,5 % d'azote, 2,5 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Puis sceller et cultiver pour obtenir des parasites matures à partir des PBC du patient.

Incuber le flacon de culture pendant 24 à 36 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Déposer environ 10 à 15 microlitres de sang à une extrémité d'une lame en verre dépolie posée sur une surface plane. Toucher la goutte de sang avec le bord d'une deuxième lame jusqu'à ce que le sang soit uniformément réparti sur le bord de cette deuxième lame, en maintenant celle-ci à un angle de 45 degrés.

Étaler rapidement mais doucement, sans exercer une pression excessive sur la première lame, le sang uniformément sur la première lame. Ensuite, faire sécher à l'air le film mince de sang, déshydrater la zone de l'échantillon avec du méthanol pendant 10 secondes. Puis faire sécher à l'air, puis immerger l'échantillon dans du keem à 2 %.

Prolonger pendant au moins 10 minutes. Rincer abondamment jusqu'à ce que l'eau devienne claire et laisser sécher à l'air. Examiner les échantillons au microscope optique avec un objectif à immersion huile 100 x.

Ensuite, purifiez et synchronisez les PFS matures de *P. falciparum*, les GRBC, comme décrit dans le protocole textuel. Transférez ensuite complètement la culture dans un tube stérile propre de 15 millilitres. Faites tomber les cellules en centrifugant à température ambiante à 370 ×g pendant cinq minutes.

Aspirez maintenant soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Ensuite, resuspendez les cellules de manière à ce qu'une moitié du volume total soit constituée de jello fusing. Un tiers de la seconde moitié correspond à un milieu sans protéine et les deux tiers de la seconde moitié correspondent à des pbcs.

Transférez la suspension dans un tube stérile de 15 millilitres et incubez de 15 à 20 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu'à l'apparition d'une démarcation nette entre les niveaux supérieur et inférieur. Transférez soigneusement la couche supérieure dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres et ajoutez 10 millilitres de RPMI frais. Centrifugez à 370 à 430 ×g pendant cinq minutes. Puis jetez soigneusement le surnageant.

Évaluer maintenant le taux de parasitémie et le stade de développement par frottis sanguin mince et examiner au microscope optique comme décrit précédemment. Ajuster la suspension de GRP obtenue après la flottaison sur gel de plasma à une concentration de 1 × 10⁸ GRP par microlitre dans un tube neuf de 1,5 millilitre. Nous suspendons les PBMC à un hématocrite de 5 % avec de l’orange Aine ou du bromure d’athérium à une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre, et le PPP à 10 % du volume total.

De la même manière, préparez les contrôles suivants : globules rouges non infectés, PRP et PRBC avec PPP, afin de déterminer le rôle des plaquettes dans l'agglutination des PBC. Transférez maintenant la suspension dans un flacon de deux millilitres à bouchon vissé. Placez le flacon sous agitation douce en le faisant rouler à 10 à 12 tr/min à température ambiante, et effectuez des prélèvements toutes les 15 à 20 minutes pendant une durée totale de 120 minutes afin de vérifier la formation d'agglomérats.

Prélvez à l’aide d’une pipette 10 microlitres de l’échantillon sur une lame de verre et recouvrez-le avec une lamelle de verre afin de l’examiner en fluorescence. Un agrégat est défini comme un groupement de trois érythrocytes infectés ou plus. Cette expérience a révélé environ 70 % de stades matures de p FALs parem après enrichissement par flottation sur gel de plasma. Les agrégats sont facilement visibles au microscope, tout comme à la lumière normale. Ils apparaissent sous forme d’agrégats cellulaires en lumière classique et comme des taches vertes ou rouges en fluorescence.

Lorsqu'ils sont colorés respectivement avec l'acro et l'orange ou des colorants au bromure d'athérium, la taille des agrégats augmente significativement, atteignant en moyenne plus de 15 PBC par agrégat après une incubation de 120 minutes, certains agrégats contenant un nombre élevé de PBC par agrégat qui ne pouvaient pas être décomptés visuellement. La fréquence du phénotype d'agrégation est calculée comme étant le nombre de cellules infectées présentes dans les agrégats par 1000 cellules infectées comptées dans des essais réalisés en double.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une compréhension claire de la manière d'effectuer un test de regroupement médié par les plaquettes de Plasmodium falciparum. Veillez à ne pas activer les plaquettes par des mouvements brusques ou des variations de température. Ce test peut également être utilisé pour mesurer le regroupement médié par les plaquettes dans le paludisme sévère.