Un protocole simple pour agglutination des plaquettes induite par des Plasmodium falciparum infectées dans une ressource Mauvais réglage

Cette procédure offre des lignes directrices normalisées pour effectuer des tests d’agglutination par les plaquettes d’isolats cliniques ou de laboratoire de faux parem de plasmodium. Tout d’abord, prélever le sang d’un patient infecté et récolter les érythrocytes parasités par centrifugation, puis cultiver et purifier les stades matures asexués. Ensuite, prélevez le sang d’un donneur sain afin de préparer et d’uniformiser le plasma riche en plaquettes par centrifugation.

Combinez à la fois les plaquettes et les érythrocytes parasités pour le test d’agglutination. Disons que les résultats de la microscopie à immunofluorescence peuvent montrer des amas de P Fal sperum médiés par les plaquettes. Cette technique est spécialement conçue pour mesurer le phénotype agglomérant de plasmodium sra.Isolats

cliniques dans un environnement pauvre en ressources. Des variations minimes dans les procédures auraient eu pour but d’accroître l’influence sur le résultat de l’agglomération de l’acide sur le terrain. Un protocole clair et facile à suivre, adapté aux milieux à faibles ressources, était donc nécessaire pour normaliser l’ensemble des sites de terrain endémiques du paludisme. Dans un citrate de sodium, vacutainer prélève environ cinq millilitres de sang total d’un hôte naïf de paludisme ou 2,5 millilitres de sang de patients atteints de paludisme CM ou SM.

Centrifugez le sang entier à 250 G pendant 10 minutes à température ambiante. Transférez ensuite soigneusement le surnageant trouble dans un tube propre de 15 millilitres. N’oubliez pas que les plaquettes sont facilement activées par la température, les variations et les chocs physiques.

Énumérer la suspension de PRP à l’aide d’un cytomètre hémologique et ajuster à la concentration souhaitée avec du PBS pour obtenir une pastille de plasma pauvre en plaquettes, la majorité des plaquettes d’une partie de la fraction PRP par centrifugation à 1500 GS pendant 10 minutes. Conservez les fractions PRP et PPP à quatre degrés Celsius pendant huit à 10 jours maximum. Idéalement, en utilisant des plaquettes fraîches pour le test d’agglutination.

Lavez les globules rouges périphériques granulés trois fois avec cinq à 10 millilitres de RPMI 1640 dans un flacon de culture. Complétez le PRBC avec une culture standard de paludisme, des globules rouges non infectés moyens et frais pour obtenir un hématocrite de 5 %. Imprégnez les flacons de culture d’un mélange de 92,5 % d’azote, 2,5 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Puis scellement et culture pour les parasites matures à partir des pBCS du patient.

Incuber le ballon de culture pendant 24 à 36 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone. Placez environ 10 à 15 microlitres de sang à l’une des extrémités d’une lame en verre dépoli reposant sur une surface plane. Touchez la goutte de sang avec le bord d’une deuxième lame jusqu’à ce que le sang soit uniformément réparti sur le bord de la deuxième lame tout en tenant la deuxième lame à un angle de 45 degrés.

Rapidement mais doucement, sans exercer trop de pression sur la première lame, répartissez uniformément le sang sur la première lame. Ensuite, séchez à l’air libre la fine pellicule de sang, déshydratez la zone de l’échantillon avec du méthanol pendant 10 secondes. Ensuite, séchez à l’air, immergez l’échantillon avec 2 % de keem.

Maintenez pendant au moins 10 minutes. Rincez abondamment jusqu’à ce que l’eau soit claire et séchez à l’air. Examinez les échantillons sous une lentille d’émulsion d’huile 100x au microscope optique.

Ensuite, purifiez et synchronisez le parum PFS mature, PRBC comme décrit dans le protocole texte. Tous transfèrent la culture dans un tube propre et stérile de 15 millilitres. Granulez les cellules par centrifugation à température ambiante à 370 GS pendant cinq minutes.

Maintenant, aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Ensuite, remettez les cellules en suspension de manière à ce qu’une moitié du volume total soit constituée de fusion de gelée. Un tiers de la seconde moitié est un milieu sans protéines et deux tiers de la seconde moitié sont des PBC.

Transférez la suspension dans un tube stérile de 15 millilitres et incubez pendant 15 à 20 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’une démarcation claire se forme entre les niveaux supérieur et inférieur. Transférez soigneusement la couche supérieure dans un tube stérile frais de 15 millilitres et ajoutez 10 millilitres de centrifugeuse RPMI fraîche à 370 à 430 GS pendant cinq minutes. Ensuite, jetez soigneusement le surnageant.

Évaluez maintenant l’analyse et le stade de développement par un frottis sanguin mince et examinez-les au microscope optique, comme décrit précédemment. Ajustez la suspension de globules rouges phosphorétiques obtenue après flottation du gel plasma à une fois 10 puissance huit globules rouges en P par microlitre dans un tube frais de 1,5 millilitre. Nous suspendons les pbcs à 5 % d’hématocrite, l’orange aïne ou le bromure d’atérium à 20 microgrammes par millilitre, la concentration finale et le PRP à 10 % du volume total.

De même, préparez les contrôles suivants : globules rouges non infectés et PRP et PRBC avec PPP pour déterminer le rôle des plaquettes dans l’agglutination de la PBC. Transférez maintenant la suspension dans un flacon à bouchon à vis de deux millilitres. Placez le flacon sous une légère agitation en le roulant à 10 à 12 RRP à température ambiante, en échantillonnant à des intervalles de 15 à 20 minutes pendant un total de 120 minutes pour vérifier la formation d’agglomérats.

Pipeter 10 microlitres de l’échantillon sur une lame de verre et couvrir avec une lamelle de verre pour examiner sous fluorescence, Un amas est considéré comme un agrégat de trois érythrocytes infectés ou plus. Cette expérience a permis de doser environ 70 % des stades matures de p FALs parem après enrichissement par gel de plasma. Les amas de flottation de gel sont facilement repérables au microscope comme à la lumière normale. Ils apparaissent sous forme d’agrégats cellulaires et sous fluorescence sous forme de taches vertes ou rouges.

Lorsqu’il est coloré avec de l’acro et de l’orange ou de l’atérium, le bromure meurt respectivement. La taille des touffes augmente considérablement pour atteindre une moyenne supérieure à 15 pbcs par touffe après une incubation de 120 minutes, certaines touffes contenant de nombreuses pbcs par touffe qui n’ont pas pu être comptées visuellement. La fréquence du phénotype agglomérant est calculée comme le nombre de cellules infectées présentes en amas pour 1000 cellules infectées comptées dans les tests en double.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une compréhension claire de la façon d’effectuer un test d’agglutination à médiation plaquettaire de plasmodium falciparum. Attention à ne pas activer les plaquettes avec des mouvements saccadés et des variations de température. Ce test peut également être appliqué pour mesurer le test d’agglutination médié par les plaquettes dans le paludisme grave.