L'utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en

L'objectif général de cette procédure est de décrire une technique in vivo permettant d'observer les dynamiques subcellulaires dans des embryons de sea elegance exposés à l'anoxie, à l'aide d'un dispositif à flux gazeux sur un microscope à fort grossissement. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon d'animaux transgéniques jeunes adultes afin d'obtenir une population adéquate d'embryons jeunes destinés à l'imagerie. Ensuite, préparez des lames avec coussinets d'agar minces à utiliser dans la chambre d'incubation microscopique.

Ensuite, les étoiles de mer sont correctement anesthésiées et recouvertes d'huile de carbone halogéné afin d'éviter la dessiccation lorsqu'elles sont exposées au flux de gaz. Enfin, la lamelle ronde contenant les animaux anesthésiés est placée dans la chambre de micro-incubation. La chambre est ensuite positionnée sur la platine du microscope et remplie de gaz azote afin de créer un environnement anoxique pendant l'acquisition d'images, en utilisant finalement un flux de gaz à travers la chambre de micro-incubation.

Permet conjointement avec la microscopie à fluorescence in vivo d'obtenir des vidéos et des images détaillées à haute résolution de l'arrêt du cycle cellulaire en réponse à l'anoxie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'immunofluorescence indirecte, est que les modifications subcellulaires peuvent être documentées in vivo pendant que les animaux sont exposés à des conditions spécifiques. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la suspension animée induite par l'anoxie chez les embryons de elegans.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes tels que la levure, la culture cellulaire ou les embryons d'autres petits invertébrés ou vertébrés. D'autres conditions telles qu'une hyperoxie, une température élevée, un stress ou un traitement par de petites molécules peuvent également être appliquées. Cette procédure est démontrée par Anastacia Garcia et Mary Latt, deux étudiantes diplômantes de mon laboratoire. Commencez avec une souche transgénique de C. elegans appropriée selon l'objet de l'étude ; dans ce cas, la souche transgénique TH32 sera utilisée afin de visualiser les chromosomes et les centrosomes comme marqueurs de la division cellulaire.

Générer une population synchronisée en dissociant des adultes gravitaires dans une solution d'hypochlorite et en utilisant les embryons restants, en sélectionnant les adultes gravitaires sur une boîte ensemencée et en laissant pondre les œufs pendant une à deux heures, ou en sélectionnant des larves L4 provenant d'une population mixte et en les plaçant sur une nouvelle boîte ensemencée. Faire croître les nématodes à 20 degrés Celsius jusqu'au stade de jeunes adultes GR, ce qui prendra environ 96 heures à partir de l'éclosion, 72 heures à partir des larves L1, ou 24 heures après la mue L4. Cette méthodologie permet d'obtenir une population de jeunes adultes contenant un grand nombre d'embryons jeunes, qui possèdent de grandes cellules germinales et des noyaux optimaux pour l'imagerie des modifications subcellulaires et subnucléaires.

Pour préparer une chambre humide destinée à accueillir des lames préparées, placez une serviette en papier humide à l’intérieur d’une grande boîte de Pétri ou d’un récipient couvert d’un couvercle de taille suffisante. Préparez de l’agarose fondue à 2 % dans de l’eau déionisée en chauffant le mélange dans un matériel en verre au bain-marie ou au micro-ondes. Ensuite, déposez une à trois gouttes d’agarose tiède sur une lame de microscope en verre propre, puis placez immédiatement une seconde lame inversée perpendiculairement au-dessus des gouttes d’agarose, et appuyez légèrement afin que le coussin obtenu soit mince et exempt de bulles d’air.

Après que l'aros se soit refroidi, séparez lentement les deux lames de microscope, en laissant le coussinet d'aros intact sur l'une des lames. Il est important de s'assurer que le coussinet d'aros est suffisamment mince pour ne pas gêner la mise au point du microscope. Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour façonner le coussinet d'aros en un petit carré de stockage.

Conserver les lames dans la chambre humide préparée jusqu'à leur utilisation. À l'aide de la même lame de rasoir propre, soulever délicatement le bord du coussin d'aros et le transférer de la lame vers un couvre-objet rond de 25 millimètres. Éviter l'accumulation de bulles d'air sous le couvre-objet rond, qui doit s'ajuster correctement dans le micro-incubateur.

Ajoutez une goutte d'anesthésique sur le tampon aros. Choisissez cinq à dix vers et placez-les dans la goutte d'anesthésique. Attendez une à trois minutes pour que les vers cessent tout mouvement.

À l’aide d’une pipette, ajoutez une goutte d’huile de carbone creuse sur les vers afin d’éviter leur dessèchement pendant que le gaz circule dans la chambre. Ensuite, reliez une extrémité du tube en plastique souple à la chambre. Séparez les deux moitiés de l’incubateur microperfusion fermé et placez délicatement la lame de verre verticalement sur l’anneau inférieur.

Fermer hermétiquement les deux côtés de la chambre. Ensuite, relier la chambre au réservoir d'azote gazeux à l'aide du tube en plastique flexible et la placer sur la platine du microscope. Vérifier l'absence de fuites en s'assurant que le tube et les bouchons d'entrée sont solidement fixés le long du côté de la chambre pour imager les embryons.

Tout d'abord, localisez les animaux en faible grossissement. Puis passez au grossissement plus élevé approprié. Pour imager les blastomères embryonnaires chez les adultes, utilisez le laser de 488 nanomètres pour localiser la protéine de fusion GFP dans les cellules d'intérêt.

Pour visualiser un stade spécifique d'arrêt du cycle cellulaire, par exemple le stade de prométaphase tardive, identifiez une cellule en un stade antérieur de la division cellulaire, tel que l'interphase tardive ou la prophase précoce. Parfuser la chambre avec du gaz azote et continuez à surveiller les cellules pendant que l'azote remplit la chambre, en ajustant le plan focal selon les besoins. Réalisez un enregistrement par laps de temps afin de capturer le phénomène d'intérêt souhaité dans ce cas précis.

Arrêt en prophase et ancrage des chromosomes à la membrane nucléaire interne. Acquérir des images toutes les 10 secondes pendant une durée maximale de 30 minutes. Généralement, l'arrêt en prophase induit par l'anoxie se produit entre 20 et 30 minutes après le début du flux de gaz azote.

Pour documenter la récupération à partir de l'état d'arrêt induit par l'anoxie, éteignez le gaz et laissez la chambre revenir à la normoxie tout en enregistrant une série en laps de temps. La reprise du cycle cellulaire et la désagrégation des chromosomes se produisent généralement entre cinq et vingt minutes. Utilisez ImageJ ou Photoshop pour traiter les images et les vidéos, puis importez-les dans QuickTime pour les afficher.

Dans l'embryon exposé à l'anoxie, les chromosomes en prophase s'agglomèrent et s'alignent avec la périphérie interne de l'enveloppe nucléaire. Un phénomène appelé ancrage des chromosomes ; après la réoxygénation, la progression du cycle cellulaire reprendra et les chromosomes en prophase.

Blasphemy passera de la périphérie nucléaire vers la plaque équatoriale, indiquant une progression en métaphase. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures en utilisant des animaux convenablement stades. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser uniquement des animaux adultes jeunes et en bonne santé, de prévoir suffisamment de temps pour mener à bien l'expérience et de faire preuve de patience lors de l'apprentissage du choix des blasphémateurs correctement stades.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment capturer in vivo les événements subcellulaires induits par l'anoxie à l'aide d'embryons GaN et d'une chambre à flux de gaz sur un microscope à fort grossissement.