L'utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en C. elegans Embryons

L’objectif général de cette procédure est de décrire une technique in vivo pour imager la dynamique subcellulaire dans des embryons d’élégance marine exposés à l’anoxie à l’aide d’un système de flux de gaz sur un microscope de haute puissance. Pour ce faire, il faut d’abord préparer un échantillon de jeunes animaux transgéniques adultes afin de générer une population appropriée de jeunes embryons pour l’imagerie. Ensuite, préparez de fines lames agros pour une utilisation dans la chambre de micro-incubation.

Ensuite, l’élégance de la mer est correctement anesthésiée et recouverte d’huile de carbone halo pour éviter la dessiccation lorsqu’elle est exposée au flux de gaz. Enfin, le verre de couverture rond avec les animaux anesthésiés est placé dans la chambre de micro-incubation. La chambre est ensuite placée sur la platine du microscope et remplie d’azote gazeux pour produire un environnement anoxique tout en imageant finalement l’utilisation d’un flux de gaz à travers une micro-chambre d’incubation.

En conjonction avec la microscopie à fluorescence in vivo, la microscopie permet des vidéos et des images détaillées à haute résolution de l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’anoxie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunofluorescence indirecte est que les changements subcellulaires peuvent être documentés in vivo pendant que les animaux sont exposés à des conditions spécifiques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’animation suspendue induite par l’anoxie chez les embryons d’elegans.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que la levure, la culture cellulaire ou d’autres petits embryons d’invertébrés ou de vertébrés. Des conditions supplémentaires telles que l’hyperoxie thermique, le stress ou le traitement avec de petites molécules peuvent également être appliquées. Anastacia Garcia et Mary Latt, deux étudiantes diplômées de mon laboratoire, font la démonstration de cette procédure : Commencez avec une souche transgénique appropriée de C Elgan d’intérêt dans cette étude, la souche transgénique TH 32 sera utilisée pour visualiser les chromosomes et les centrosomes en tant que marqueurs de la division cellulaire.

Générer une population synchronisée en désintégrant les adultes gravitaires dans une solution d’hypochlorite et utiliser les embryons restants en cueillant les adultes gravitaires sur une plaque ensemencée et l’œuf, pondant une à deux heures, ou en ramassant les larves L quatre d’une population mixte sur une nouvelle plaque ensemencée. Cultivez les nématodes à 20 degrés Celsius jusqu’à l’âge adulte, ce qui prendra environ 96 heures à partir de l’éclosion, 72 heures à partir de L une larve ou 24 heures après la mue L 4. Cette méthodologie permet de générer une population de jeunes adultes contenant un nombre abondant de jeunes embryons, contenant de grands blasphémères et des noyaux optimaux pour l’imagerie des changements subcellulaires et subnucléaires.

Pour installer une chambre humide pour contenir les lames préparées, placez une serviette en papier humide à l’intérieur d’une grande boîte de Pétri ou d’un bac recouvert d’un couvercle de taille suffisante. Préparez des aros fondus à 2 % dans de l’eau déminéralisée en chauffant le mélange dans de la verrerie au micro-ondes ou au bain-marie. Ensuite, placez une à trois gouttes d’aros chaudes sur une lame de microscope en verre propre Placez immédiatement une deuxième lame inversée perpendiculairement sur les gouttes aros, et appuyez légèrement pour que le tampon résultant soit mince et exempt de bulles d’air.

Une fois que l’aros a refroidi, démontez lentement les deux lames de microscope, en laissant le tampon aros intact sur l’une des lames. Il est important de s’assurer que le tampon aros est suffisamment fin pour ne pas interférer avec la capacité de mise au point du microscope. Plus tard. Utilisez une lame de rasoir propre pour façonner le tampon Aros en un petit magasin carré.

Glisse dans la chambre humide préparée jusqu’au moment de l’utiliser. À l’aide de la même lame de rasoir propre, prenez soigneusement le bord du tampon aros et transférez-le de la glissière sur un verre rond de protection micro de 25 millimètres. En évitant l’accumulation de bulles d’air sous le couvercle rond, le verre doit s’adapter correctement dans le micro-incubateur.

Ajoutez une goutte d’anesthésique sur le tampon aros. Choisissez cinq à 10 vers et placez-les dans la goutte d’anesthésique. Attendez une à trois minutes pour que les vers cessent de bouger.

À l’aide d’une pointe de pipette, ajoutez une goutte d’huile de carbone sacrée sur les vers pour éviter que les vers ne se déshydratent lorsque le gaz circule dans la chambre. Ensuite, connectez une extrémité du tube en plastique flexible à la chambre. Séparez les deux moitiés du micro-incubateur à perfusion fermé et placez soigneusement le verre de protection à la verticale sur l’anneau inférieur.

Fermez bien les deux côtés de la chambre. Connectez ensuite la chambre via le tube en plastique flexible au réservoir d’azote gazeux et placez-la sur la platine du microscope. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites en veillant à ce que le tube et les bouchons de port soient bien fixés sur le côté de la chambre pour imager les embryons.

Tout d’abord, localisez les animaux à faible grossissement. Passez ensuite au grossissement plus élevé approprié. Pour imager les blasphémateurs embryonnaires chez les adultes, utilisez le laser de 488 nanomètres pour localiser la protéine de fusion GFP dans les cellules d’intérêt.

Pour visualiser une étape spécifique de l’arrêt du cycle cellulaire, par exemple, la prophase tardive, identifiez un blasphémateur à un stade antérieur de la division cellulaire tel que l’interphase tardive ou la prophase précoce. Perfuser la chambre avec de l’azote gazeux et continuer à surveiller les blasphémateurs pendant que l’azote remplit la chambre, en ajustant le plan focal si nécessaire. Effectuez une imagerie en accéléré pour capturer le phénomène d’intérêt souhaité dans ce cas.

Arrêt de la prophase et amarrage des chromosomes à la membrane nucléaire interne. Prenez des images toutes les 10 secondes pendant 30 minutes maximum. En règle générale, l’arrêt de la prophase induit par l’anoxie se produit dans les 20 à 30 minutes suivant le début de l’écoulement de l’azote gazeux.

Pour documenter la récupération de l’état d’arrêt induit par l’anoxie, éteignez le gaz et laissez la chambre revenir à la normoxie tout en enregistrant une série de time-lapse. La reprise du cycle cellulaire et l’annulation des chromosomes se produisent généralement dans les cinq à 20 minutes. Utilisez erris image J ou Photoshop pour traiter des images et des vidéos et les importer dans QuickTime pour les afficher.

Au sein de l’embryon exposé à l’anoxie, les chromosomes de la prophase. Les blasphémateurs se condenseront et s’aligneront avec la périphérie nucléaire intérieure. Un phénomène appelé amarrage chromosomique lors de la réoxygénation, la progression du cycle cellulaire reprendra et les chromosomes de prophase.

Le blasphème se déplacera de la périphérie nucléaire vers la plaque équatoriale, indiquant une progression vers la métaphase. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en trois à quatre heures à l’aide d’animaux correctement mis en scène. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de n’utiliser que de jeunes animaux adultes en bonne santé pour réserver suffisamment de temps pour terminer l’expérience et d’être patient lorsque vous apprenez à choisir des blasphémateurs correctement mis en scène.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de capturer les événements subcellulaires induits par l’anoxie in vivo à l’aide d’embryons de GaN et d’une chambre à flux de gaz sur un microscope de haute puissance.