Name: Lutilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en C. elegans Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez une technique de microscopie confocale à disque tournant pour imager la dynamique subcellulaire chez les embryons de C. elegans en anoxie. Cette méthode permet d'étudier l'arrêt du cycle cellulaire en temps réel.

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Nous tenons à exprimer notre reconnaissance pour la contribution et les commentaires des membres du Laboratoire Padilla. Souches de nématodes dans ce travail ont été fournies par le Centre de Caenorhabditis Genetics, qui est financé par le NIH Centre National de Ressources de recherche (NCRR). Nous reconnaissons et remercions le Dr Lon-Turnbull pour l&#39;assistance technique en microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (NSF-IOS, carrière) au PAP

1. Préparation des échantillons <ol><li> Produire ou obtenir approprié transgénique C. elegans souche d&#39;intérêt en utilisant des méthodes transgéniques ou de Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) ou d&#39;un collègue. Dans ce cas, nous utilisons souche TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP, tarte-1 :: GFP :: H2B) 5 à visualiser les chromosomes et les centrosomes comme marqueurs de la division cellulaire. </li><li> Générer une population synchronisée en utilisant l&#39;une des trois méthodes suivantes: 1) se désintègrent adultes gravides dans une solution d&#39;hypochlorite et d&#39;utiliser des embryons restants 6, 2) choisir adultes gravides ensemencées sur une plaque et laissez-les poser embryons pendant 1-2 heures, ou 3) prendre L4 larves d&#39;une population mixte et de passer à une nouvelle plaque ensemencée. </li><li> Cultivez les nématodes à 20 ° C à l&#39;âge adulte gravide, ce qui prendra environ 96 heures à partir de l&#39;éclosion, les larves de 72 heures à partir de L1 ou L4 24 h après la mue. Embryons (2-20 cellules) in utero contiennent de grandes blastomères et des noyaux qui sont optimales pour imagtion des changements sub-cellulaires et sub-nucléaire, respectivement. Cette méthodologie fournit un moyen pour générer une population de jeunes adultes qui contiennent un nombre abondant d&#39;embryons précoces. </li></ol> 2. Préparation Faites glisser et anoxie Chambre Set Up <ol><li> Faites une chambre humide à tenir lames préparées en plaçant une serviette en papier humide à l&#39;intérieur d&#39;un grand plat de Pétri ou dans le bac recouvert d&#39;un couvercle de taille suffisante. </li><li> Préparer fondu 2% d&#39;agarose dans désionisée H 2 O par chauffage dans de la verrerie mélange par micro-ondes ou bain d&#39;eau. </li><li> Placer 1-3 gouttes d&#39;eau tiède agarose sur une lame de microscope en verre propre. Placer immédiatement une deuxième lame inversée verticalement au-dessus de la chute d&#39;agarose (s), appuyez légèrement de sorte que le coussin résultant sera mince et sans bulles d&#39;air. </li><li> Laisser le temps de refroidir lentement et démonter les deux lames de microscope en laissant intact le tampon d&#39;agarose sur une des diapositives. Il est important d&#39;assurer le pad agarose est assez mince pour ne pas perturre avec la capacité de se concentrer au microscope après. Possibilité de visualiser l&#39;échantillon dépend aussi de la distance optique spécifique de l&#39;objectif utilisé, qui peut varier entre microscopes. </li><li> Utilisez une lame de rasoir propre pour façonner tampon d&#39;agarose dans un petit carré. Conserver dans la chambre humide préparée jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Soigneusement, en utilisant la même lame de rasoir propre, prendre le bord du pad agarose et le transférer de la faire glisser sur un rond de 25 mm lamelle micro, en évitant l&#39;accumulation de bulles d&#39;air sous le clavier. La lamelle ronde choisi d&#39;utiliser s&#39;insère correctement dans le microincubator. </li><li> On ajoute une goutte d&#39;anesthésique (0,5% tricaïne, tétramisole 0,05% en tampon M9) sur le bloc d&#39;agarose destiné à être utilisé comme anesthésique. Choisissez les vers 5-10 et lieu dans la goutte d&#39;anesthésique. Laisser 1-3 min pour les vers à cesser le mouvement. </li><li> La justification de l&#39;observation des embryons dans l&#39;utérus adulte, au lieu d&#39;embryons disséqués, est de minimiser le potentiel de l&#39;embryon desiccation et le mouvement dû à l&#39;écoulement du gaz d&#39;azote dans l&#39;embryon. </li><li> Immédiatement ajouter une goutte d&#39;huile halocarbone au-dessus des vers de terre pour empêcher les vers de déshydratation de gaz s&#39;écoule à travers la chambre. Comme l&#39;huile est visqueuse halocarbures, on peut utiliser un embout de pipette ou de la pointe d&#39;un ver prendre pour recueillir l&#39;huile et déposer sur les vers de terre. </li><li> Une fois la lamelle circulaire contenant les vers est prêt, les deux moitiés de la fermeture Leiden perfusion microincubator sont séparées, et la lamelle est ensuite soigneusement placé à la verticale sur l&#39;anneau inférieur. Les deux côtés de la chambre sont ensuite fermées hermétiquement ensemble. </li><li> La chambre est ensuite reliée au réservoir d&#39;azote gazeux par l&#39;intermédiaire de tubes en matière plastique souple et placé à l&#39;endroit approprié sur la platine du microscope (figure 1C). À ce moment le tube et microincubator doit être soigneusement contrôlée pour les fuites en assurant une fixation sûre de la tuyauterie et des bouchons d&#39;orifice le long du côté de la chambre. On peut ALsi légèrement étaler une petite quantité d&#39;eau savonneuse sur le tube de chercher des bulles, qui formeront si une fuite est présente. </li></ol> 3. Microscopie en anoxie <ol><li> Localiser les animaux à faible grossissement, puis déplacez le grossissement supérieur approprié (64x pour cette application) pour les tissus d&#39;image ou cellules d&#39;intérêt tels que blastomères embryonnaires ou des ovocytes chez les adultes. Activer le laser 488 nm pour afficher signal de la GFP et de localiser la protéine de fusion GFP dans la cellule (s) d&#39;intérêt. </li><li> Pour visualiser l&#39;arrestation au stade précis de l&#39;arrêt du cycle cellulaire (par exemple prophase tardive) d&#39;identifier un blastomère à un stade antérieur de la division cellulaire (par exemple interphase prophase tardive ou précoce). Marqueurs cellulaires tels que la position centriole, l&#39;initiation de la condensation des chromosomes, la localisation chromosomique et la présence ou l&#39;absence de l&#39;enveloppe nucléaire aidera à identifier les étapes du cycle cellulaire (figure 2A). </li><li> La chambre est ensuite perfusé avec de l&#39;azote gazeux (99,999%N 2; &lt;2 ppm O 2). Dans ce cas, nous utilisons une pression de 6 psi, mais la pression peut avoir besoin d&#39;être ajustée et optimisée en fonction de la taille de chaque microincubator et le diamètre du tuyau en cours d&#39;utilisation. Continuer à surveiller le blastomère (s) que l&#39;azote remplit la chambre, le réglage du plan focal selon les besoins. </li><li> À ce stade, imagerie time-lapse a commencé. L&#39;imagerie est réalisée aussi longtemps que nécessaire pour capturer phénomène d&#39;intérêt, dans ce cas prophase arrestation et l&#39;amarrage des chromosomes à la membrane nucléaire interne. Les images sont prises une fois toutes les 10 sec pour une durée de 30 min. Les fréquences de capture d&#39;image et des paramètres tels que le gain et la puissance du laser doit être ajustée si nécessaire. </li><li> Le temps pendant lequel les embryons répondre à l&#39;environnement anoxique peut varier selon le stade du cycle cellulaire lors de l&#39;exposition anoxie. Typiquement arrestation prophase anoxie induite se produit dans les 20-30 min de commencer flux d&#39;azote gazeux. Nous avons observé une anoxie induite occu arrêt du cycle cellulairerring à &lt;20 min. Les images peuvent être obtenus au cours de cette période, ou des images spécifiques peuvent être isolés par la suite d&#39;une série time-lapse. Une autre option est d&#39;utiliser la vidéo-microscopie de visualiser des structures subcellulaires dans les embryons. </li><li> Pour documenter la récupération de l&#39;état d&#39;anoxie induite par arrêté, le gaz est éteint et que la chambre est autorisé à retourner à la normoxie par diffusion lors de l&#39;enregistrement d&#39;une série time-lapse. Reprise de la progression du cycle cellulaire et le désarrimage des chromosomes se produit généralement dans les 5-20 min de transformer l&#39;azote gazeux hors tension. </li><li> Notez que dans des expériences séparées un indicateur anoxie, résazurine, a été placé dans la microchambre accréditives, il a été déterminé que la chambre devient anoxique, en moyenne, d&#39;environ 19 minutes après l&#39;écoulement du gaz d&#39;azote a commencé. </li><li> Images et vidéos sont traitées à l&#39;aide Imaris, Image J ou Photoshop et importés dans QuickTime pour l&#39;affichage. </li></ol>

<ol><li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li>
<li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation%2C+diapause+and+quiescence%3A+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
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<li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief%2C+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li>
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<li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La privation d&#39;oxygène et de Suspended Animation Bien que l&#39;exposition à la privation d&#39;oxygène graves peuvent être mortels pour certains organismes, certains organismes sont capables de survivre à l&#39;exposition à l&#39;anoxie. Dans le cas de C. elegans, la survie de l&#39;exposition anoxie dépend du stade de développement et de réponse à l&#39;anoxie est entrée dans un état ​​d&#39;animation suspendue réversible dans lequel un certain nombre de processus biologiques obs...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs / Équipement </td><td></td><td></td><td> Composition </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hypochlorite </td><td></td><td></td><td> 0,7 g de KOH, 12 ml de NaOCl 5%, porter à 50 ml avec de ddH 2 0 </td></tr><tr><td> M9 tampon </td><td></td><td></td><td> 3 g de KH 2 PO 4, 11 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 pour 1 L ddH O 2 </td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x1.0 mm </td></tr><tr><td> Round micro lamelle </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 72223-01 </td><td> 25 mm Diamètre </td></tr><tr><td> Huile halocarbone 700 </td><td> Sigma </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Anesthésique </td><td></td><td></td><td> Trique de 0,5%aine, tétramisole 0,05% </td></tr><tr><td> Leiden perfusion fermé Microincubator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azote UHP </td><td> CALGAZ (Air Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99,9990% de N 2 &lt;2 ppm O 2 </td></tr><tr><td> Tubes en plastique </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0.062 &quot;ID x 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td> Microscope confocal Spinning Disk </td><td> Systèmes McBain </td><td></td><td> Zeiss inversé microscope optique, système d&#39;éclairage à épifluorescence, CSU-10 Yokogawa confocale scanner, Hamamatsu multiplicateur d&#39;électrons caméra CCD. </td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de la microscopie à time lapse visualisez anoxie induite suspended animation en<em&gt; c. elegans</em&gt; embryons

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Elegans Caenorhabdits a été largement utilisé dans l&#39;étude de la résistance au stress, ce qui est facilité par la transparence des stades adultes et d&#39;embryons ainsi que par la disponibilité de mutants génétiques et des souches transgéniques exprimant une myriade de 1-4 des protéines de fusion. En outre, les processus dynamiques comme la division cellulaire peut être consulté en utilisant des protéines marquées par fluorescence reporter. L&#39;étude de la mitose peut être facilitée par l&#39;utilisation de time-lapse expériences dans divers systèmes, y compris les organismes intacts; ainsi le début C. embryon elegans est bien adapté pour cette étude. Présentée ici est une technique par laquelle l&#39;imagerie in vivo de structures subcellulaires en réponse à anoxique (99,999% de N 2; &lt;2 ppm 2 O) le stress est possible en utilisant un flux de gaz simple grâce à l&#39;installation sur un microscope très puissant. Une chambre microincubation est utilisé en conjonction avec un débit d&#39;azote gazeux à travers et un microscope confocal à disque rotatifà créer un environnement contrôlé dans lequel les animaux peuvent être imagé in vivo. Utilisant la GFP-tubuline marqués gamma et des histones, la dynamique et arrêt de la division cellulaire peut être surveillé avant, pendant et après l&#39;exposition à un environnement privé d&#39;oxygène. Les résultats de cette technique sont en haute résolution, des vidéos et des images détaillées des structures cellulaires au sein de blastomères d&#39;embryons exposés à la privation d&#39;oxygène.

C. elegans embryons exposés à la privation d&#39;oxygène sévère (anoxie) sont capables de survivre en arrêtant les processus biologiques, y compris le développement et 7 de la division cellulaire. L&#39;arrestation anoxie induite par la division cellulaire peut être contrôlé, à un niveau sub-cellulaire, en utilisant une chambre microincubation en conjonction avec flux d&#39;azote gazeux à travers un microscope et confocale à disque rotatif pour créer un environnement contrôlé dans lequel les animaux ...

Décrit ici est un<em&gt; In vivo</emTechnique&gt; à l&#39;image des structures sous-cellulaires chez les animaux exposés à une anoxie en utilisant un écoulement de gaz à travers la chambre microincubation en liaison avec un microscope confocal à disque rotatif. Cette méthode est simple et suffisamment souple pour s&#39;adapter à une variété de paramètres expérimentaux et des systèmes modèles.

L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

*Caenorhabditis elegans* a été largement utilisé dans l'étude de la résistance au stress, laquelle est facilitée par la transparence des stades adulte et embryonnaire...

L'objectif général de cette procédure est de décrire une technique in vivo permettant d'observer les dynamiques subcellulaires dans des embryons de sea elegance exposés à l'anoxie, à l'aide d'un dispositif à flux gazeux sur un microscope à fort grossissement. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon d'animaux transgéniques jeunes adultes afin d'obtenir une population adéquate d'embryons jeunes destinés à l'imagerie. Ensuite, préparez des lames avec coussinets d'agar minces à utiliser dans la chambre d'incubation microscopique.Ensuite, les étoiles de mer sont correctement anesthésiées et recouvertes d'huile de carbone halogéné afin d'éviter la dessiccation lorsqu'elles sont exposées au flux de gaz. Enfin, la lamelle ronde contenant les animaux anesthésiés est placée dans la chambre de micro-incubation. La chambre est ensuite positionnée sur la platine du microscope et remplie de gaz azote afin de créer un environnement anoxique pendant l'acquisition d'images, en utilisant finalement un flux de gaz à travers la chambre de micro-incubation.Permet conjointement avec la microscopie à fluorescence in vivo d'obtenir des vidéos et des images détaillées à haute résolution de l'arrêt du cycle cellulaire en réponse à l'anoxie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'immunofluorescence indirecte, est que les modifications subcellulaires peuvent être documentées in vivo pendant que les animaux sont exposés à des conditions spécifiques. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la suspension animée induite par l'anoxie chez les embryons de elegans.Il peut également être appliqué à d'autres systèmes tels que la levure, la culture cellulaire ou les embryons d'autres petits invertébrés ou vertébrés. D'autres conditions telles qu'une hyperoxie, une température élevée, un stress ou un traitement par de petites molécules peuvent également être appliquées. Cette procédure est démontrée par Anastacia Garcia et Mary Latt, deux étudiantes diplômantes de mon laboratoire. Commencez avec une souche transgénique de C. elegans appropriée selon l'objet de l'étude ; dans ce cas, la souche transgénique TH32 sera utilisée afin de visualiser les chromosomes et les centrosomes comme marqueurs de la division cellulaire.Générer une population synchronisée en dissociant des adultes gravitaires dans une solution d'hypochlorite et en utilisant les embryons restants, en sélectionnant les adultes gravitaires sur une boîte ensemencée et en laissant pondre les œufs pendant une à deux heures, ou en sélectionnant des larves L4 provenant d'une population mixte et en les plaçant sur une nouvelle boîte ensemencée. Faire croître les nématodes à 20 degrés Celsius jusqu'au stade de jeunes adultes GR, ce qui prendra environ 96 heures à partir de l'éclosion, 72 heures à partir des larves L1, ou 24 heures après la mue L4. Cette méthodologie permet d'obtenir une population de jeunes adultes contenant un grand nombre d'embryons jeunes, qui possèdent de grandes cellules germinales et des noyaux optimaux pour l'imagerie des modifications subcellulaires et subnucléaires.Pour préparer une chambre humide destinée à accueillir des lames préparées, placez une serviette en papier humide à l’intérieur d’une grande boîte de Pétri ou d’un récipient couvert d’un couvercle de taille suffisante. Préparez de l’agarose fondue à 2 % dans de l’eau déionisée en chauffant le mélange dans un matériel en verre au bain-marie ou au micro-ondes. Ensuite, déposez une à trois gouttes d’agarose tiède sur une lame de microscope en verre propre, puis placez immédiatement une seconde lame inversée perpendiculairement au-dessus des gouttes d’agarose, et appuyez légèrement afin que le coussin obtenu soit mince et exempt de bulles d’air.Après que l'aros se soit refroidi, séparez lentement les deux lames de microscope, en laissant le coussinet d'aros intact sur l'une des lames. Il est important de s'assurer que le coussinet d'aros est suffisamment mince pour ne pas gêner la mise au point du microscope. Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour façonner le coussinet d'aros en un petit carré de stockage.Conserver les lames dans la chambre humide préparée jusqu'à leur utilisation. À l'aide de la même lame de rasoir propre, soulever délicatement le bord du coussin d'aros et le transférer de la lame vers un couvre-objet rond de 25 millimètres. Éviter l'accumulation de bulles d'air sous le couvre-objet rond, qui doit s'ajuster correctement dans le micro-incubateur.Ajoutez une goutte d'anesthésique sur le tampon aros. Choisissez cinq à dix vers et placez-les dans la goutte d'anesthésique. Attendez une à trois minutes pour que les vers cessent tout mouvement.À l’aide d’une pipette, ajoutez une goutte d’huile de carbone creuse sur les vers afin d’éviter leur dessèchement pendant que le gaz circule dans la chambre. Ensuite, reliez une extrémité du tube en plastique souple à la chambre. Séparez les deux moitiés de l’incubateur microperfusion fermé et placez délicatement la lame de verre verticalement sur l’anneau inférieur.Fermer hermétiquement les deux côtés de la chambre. Ensuite, relier la chambre au réservoir d'azote gazeux à l'aide du tube en plastique flexible et la placer sur la platine du microscope. Vérifier l'absence de fuites en s'assurant que le tube et les bouchons d'entrée sont solidement fixés le long du côté de la chambre pour imager les embryons.Tout d'abord, localisez les animaux en faible grossissement. Puis passez au grossissement plus élevé approprié. Pour imager les blastomères embryonnaires chez les adultes, utilisez le laser de 488 nanomètres pour localiser la protéine de fusion GFP dans les cellules d'intérêt.Pour visualiser un stade spécifique d'arrêt du cycle cellulaire, par exemple le stade de prométaphase tardive, identifiez une cellule en un stade antérieur de la division cellulaire, tel que l'interphase tardive ou la prophase précoce. Parfuser la chambre avec du gaz azote et continuez à surveiller les cellules pendant que l'azote remplit la chambre, en ajustant le plan focal selon les besoins. Réalisez un enregistrement par laps de temps afin de capturer le phénomène d'intérêt souhaité dans ce cas précis.Arrêt en prophase et ancrage des chromosomes à la membrane nucléaire interne. Acquérir des images toutes les 10 secondes pendant une durée maximale de 30 minutes. Généralement, l'arrêt en prophase induit par l'anoxie se produit entre 20 et 30 minutes après le début du flux de gaz azote.Pour documenter la récupération à partir de l'état d'arrêt induit par l'anoxie, éteignez le gaz et laissez la chambre revenir à la normoxie tout en enregistrant une série en laps de temps. La reprise du cycle cellulaire et la désagrégation des chromosomes se produisent généralement entre cinq et vingt minutes. Utilisez ImageJ ou Photoshop pour traiter les images et les vidéos, puis importez-les dans QuickTime pour les afficher.Dans l'embryon exposé à l'anoxie, les chromosomes en prophase s'agglomèrent et s'alignent avec la périphérie interne de l'enveloppe nucléaire. Un phénomène appelé ancrage des chromosomes ; après la réoxygénation, la progression du cycle cellulaire reprendra et les chromosomes en prophase. Blasphemy passera de la périphérie nucléaire vers la plaque équatoriale, indiquant une progression en métaphase. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures en utilisant des animaux convenablement stades. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser uniquement des animaux adultes jeunes et en bonne santé, de prévoir suffisamment de temps pour mener à bien l'expérience et de faire preuve de patience lors de l'apprentissage du choix des blasphémateurs correctement stades.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment capturer in vivo les événements subcellulaires induits par l'anoxie à l'aide d'embryons GaN et d'une chambre à flux de gaz sur un microscope à fort grossissement.

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Ce protocole décrit comment l'image des cellules en division dans un tissu en Caenorhabditis elegans embryons. Bien que de nombreux protocoles décrivent comment la division cellulaire de l'image dans l'embryon précoce, ce protocole décrit comment l'image de la division cellulaire dans un tissu en développement au cours de l'embryogenèse tardive milieu.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

Un protocole est décrit qui utilise anoxie / famine dans C. elegans pour modéliser l'ischémie / reperfusion. Les résultats fonctionnels incluent une mortalité accrue, des anomalies visibles dans les processus neuronaux GFP-étiquetée, et les réponses comportementales douteux qui nécessitent la fonction neuronale.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Ici, on montre comment suivre et quantifier les processus de développement chez C. elegans. Les méthodes présentées sont basées sur des outils open-source qui peuvent être facilement mis en œuvre. Il est démontré comment reconstruire des modèles de forme cellulaire 3D, comment suivre manuellement les structures subcellulaires et comment analyser le flux contractile cortical.

Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Ici, nous détaillons des protocoles spécifiquement conçus pour surveiller les défauts morphogéniques qui se produisent pendant les phases précoces et tardives de l’élongation embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans. En fin de compte, ces protocoles sont conçus pour identifier les gènes qui régulent ces phases et pour caractériser leurs besoins différentiels le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Nous présentons ici un protocole pour la préparation et le montage des embryons de Caenorhabditis elegans , l’enregistrement du développement sous un microscope 4D et le traçage de la lignée cellulaire.

Microscopie 4D: Démêler le développement embryonnaire de Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie Nomarski

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Ici, nous présentons des protocoles et des outils pour visualiser le calcium pendant la fécondation et l’embryogenèse précoce à l’aide d’un rapporteur de calcium génétiquement codé exprimé dans la lignée germinale du nématode modèle C. elegans.

Visualisation in vivo des transitoires calciques pendant la fécondation et le développement précoce chez C. elegans

Découvrez une technique de microscopie confocale à disque tournant pour imager la dynamique subcellulaire chez les embryons de C. elegans en anoxie. Cette méthode permet d'étudier l'arrêt du cycle cellulaire en temps réel.

L'utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en

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