Un

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'activité électrique des nerfs, des muscles et des neurones, ainsi que les mouvements correspondants de l'appareil alimentaire pendant les programmes moteurs de l'alimentation. Cela est réalisé en premier lieu en retirant la masse buccale d'un plegia anesthésié et en fixant des électrodes en forme de crochet aux nerfs et muscles clés. La deuxième étape consiste à placer la masse buccale dans une cuve d'enregistrement et à préparer les ganglions pour un enregistrement extracellulaire.

Ensuite, les neurones cibles sont localisés à l’aide d’électrodes extracellulaires. La dernière étape consiste à induire et enregistrer des programmes moteurs liés à l’alimentation, tels que la morsure, la déglutition et le rejet. En définitive, la préparation du massif buccal suspendu permet de visualiser l’activité des nerfs, des muscles et des neurones individuels durant différents mouvements de type alimentaire du massif buccal.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les études de ganglions isolés, est que les enregistrements provenant des nerfs, des muscles et des neurones individuels peuvent être directement associés aux mouvements de l'appareil alimentaire. Pour illustrer la procédure, huu, un étudiant diplômé de notre laboratoire, nous aidera. Pour commencer la procédure, anesthésiez un spécimen sain de plegia pesant entre 200 et 300 grammes dans un plateau de dissection en injectant environ 50 % du poids corporel en chlorure de magnésium isotonique. Après la première injection près de la queue de l'animal, massez doucement la surface de l'animal afin de répartir le chlorure de magnésium.

Effectuez des injections supplémentaires près de la tête de l'animal selon les besoins. Une fois que l'animal cesse de réagir aux stimuli tactiles doux, fixez-le sur le plateau avec le dos vers le haut. Placez une épingle dans la queue et une épingle dans chaque tentacule antérieur.

Ensuite, utilisez la pince pour pincer et soulever la peau de l'animal au milieu de la tête. Juste derrière les quatre cornes du rhinocéros, effectuez une incision coronaire traversant la tête de l'animal, juste derrière le point maintenu. Ensuite, pratiquez une incision sagittale médiane entre les quatre cornes du rhinocéros en direction de la bouche afin d'exposer la masse buccale.

Ensuite, éloignez la lamelle de peau de la masse buccale et sectionnez les nerfs et les tissus conjonctifs qui s'attachent à la paroi du corps. Afin de séparer complètement cette lamelle de peau de la masse buccale, veillez à ne pas couper les nerfs ou tissus intrinsèques à la masse buccale. Par la suite, saisissez et maintenez l'œsophage.

Couper l'œsophage en arrière du point maintenu. Relever l'œsophage et soulever la masse buccale située derrière la masse buccale. Les ganglions cérébral, pleural et pédonculé forment un anneau, le ganglion cérébral étant relié aux ganglions buccaux par les connectifs cérébro-buccaux.

Laisser ces ganglions annulaires attachés à la masse buccale et sectionner tous les nerfs qui partent de ces ganglions vers d'autres parties du corps. Ensuite, couper les tissus conjonctifs entourant la masse buccale et continuer à soulever la masse buccale à mesure qu'elle devient moins reliée au corps. Une fois que la masse buccale n'est plus attachée qu'à la bouche, tenir l'œsophage et la masse buccale.

Directement. Effectuez une coupe finale juste en avant des mâchoires afin de libérer la masse buccale du corps. Placez la masse buccale dans une solution composée à 50 % de chlorure de magnésium isotonique et à 50 % de solution saline SIA afin de maintenir une anesthésie partielle pendant l'attachement des électrodes.

Ensuite, placer la masse buccale avec la solution dans une boîte de Pétri munie d'un fond en forme de cigare, en coupant l'artère buccale sur la surface ventrale de la masse buccale. Puis retirer les ganglions pléuraux et pédonculaires en sectionnant leurs connexions avec le ganglion cérébral. Laisser le ganglion cérébral attaché aux ganglions buccaux et à la masse buccale par l'intermédiaire des CBC et sectionner les autres connexions entre le ganglion cérébral et la masse buccale.

Raccourcir l'œsophage et les glandes salivaires en les taillant. À cette étape, fixer les électrodes crochets au nerf oculaire ulaire, aux deux nerfs buccaux musculaires deux et trois, ainsi qu'à la branche A du nerf buccal deux. Utiliser une procédure similaire à celle décrite dans la publication JoVE par Collins et Shield, brièvement résumée ici.

Pour chaque détachement d'électrode, positionnez l'électrode près du nerf ou du muscle, insérez le nerf cible dans le crochet et soulevez délicatement à l’aide d’un manipulateur. Ensuite, séchez la section de nerf à l’aide d’un essuie-tout Kim. Appliquez une goutte de colle super rapide en gel sur le nerf accroché, et assurez-vous que le crochet est entièrement recouvert de colle et que l’extrémité du fil de référence n’est pas recouverte de colle.

Utilisez ensuite une seringue munie d'un embout en tube de polyéthylène pour appliquer la solution contenue dans la boîte sur la colle, ce qui provoquera la prise de la surface de la colle. L'étape suivante consiste à préparer une boîte d'enregistrement ronde en Pyrex de 100 par 50 millimètres à utiliser comme chambre d'enregistrement ; appliquez une fine couche de graisse à vide dans l'encoche située entre les chambres cérébrale et courbée à l'aide d'une pointe de pipette afin de minimiser les fuites. Remplissez ensuite la chambre avant avec une solution saline de plescia.

Transférez délicatement la masse buccale de la boîte de Pétri vers la chambre avant du plat rond en Pyrex, et veillez à ce qu'aucun des électrodes ne soit trop tendu, ce qui pourrait endommager les nerfs. Manipulez avec beaucoup de précaution les électrodes crochets si le plat doit être transféré vers un autre microscope stéréoscopique. Pour l'amincissement de la gaine.

Regroupez les électrodes de chaque côté de la masse buccale. Tenez délicatement les électrodes en pinçant le ruban adhésif de laboratoire qui recouvre les broches de connexion, et vérifiez à nouveau qu’aucune des électrodes n’est tendue. Lorsque la boîte est placée sous le microscope, les électrodes doivent être disposées doucement par-dessus les bords de la boîte et reposer sur la plateforme pendant les pauses et entre les étapes de l’expérience. Aérez le liquide physiologique dans la chambre contenant la masse buccale à l’aide d’une pierre à air d’aquarium.

Ensuite, épingler le ganglion cérébral dans la chambre arrière en faisant passer les CBC par l'entaille. Appliquer davantage de graisse à vide sur les CBC. Puis ajouter davantage de solution saline SIA dans les deux parties de la boîte afin que les ganglions soient complètement immergés.

S'assurer que le niveau de la solution saline est inférieur à la hauteur de la graisse à vide entre les chambres cérébrale et buccale afin qu'aucune fuite ne se produise entre les chambres. À ce stade, la masse buccale doit reposer au fond de la chambre avant. Ensuite, épingler les ganglions buccaux sur la plateforme intermédiaire pour éviter d'endommager les nerfs encore attachés à la masse buccale.

Placez uniquement les épingles sur la gaine située entre deux nerfs. Ajoutez ensuite deux autres épingles sur les côtés des CBC afin de les étirer et de les fixer. Maintenez les ganglions buccaux à plat ou en rotation selon l'emplacement des neurones d'intérêt.

Pour faire pivoter le ganglion buccal, utilisez une paire de fines pinces pour saisir une partie excédentaire de la gaine du CBC et fixez-la entre le nerf buccal deux et le nerf buccal trois. Ensuite, la plupart des corps cellulaires situés près de la chambre postérieure et difficilement accessibles depuis le sommet du ganglion buccal deviennent visibles. Enfin, insérez deux broches dans la gaine du ganglion buccal près du côté de la masse buccale.

Pour minimiser les mouvements du ganglion buccal, saisissez la gaine du ganglion buccal près de la chambre postérieure et retirez l'excès de gaine à l'aide de ciseaux fins, sans exposer les corps cellulaires. Afin de minimiser les dommages, retirez uniquement la quantité de gaine nécessaire pour voir les corps cellulaires une fois l'amincissement de la gaine terminé. Fixez toutes les broches d'électrode à leurs douilles sur les câbles qui se raccordent aux amplificateurs.

Veillez à ce que les électrodes ne soient pas tendues et qu'elles soient correctement fixées à leurs câbles respectifs, et que les polarités soient correctes pour éliminer tout chlorure de magnésium résiduel. Remplacez la solution saline SIA dans la chambre du massif buccal par une solution saline SIA fraîche. Ensuite, faites passer un fil de soie à travers les tissus mous à l'avant du massif buccal et en dorsal du cartilage de la mâchoire.

Utilisez deux morceaux d'argile à modeler pour fixer le fil de suture au bord de la boîte, suspendant ainsi la masse buccale par son extrémité antérieure. Un manipulateur tient une électrode extracellulaire en verre de sorte que la pointe de l'électrode soit proche du ganglion buccal. Pour localiser et identifier un neurone, abaissez délicatement la pointe de l'électrode extracellulaire sur la gaine.

Au-dessus du corps cellulaire du neurone. Appliquer un courant stimulateur, puis commuter le canal utilisé pour exciter le soma en mode enregistrement afin d'enregistrer l'activité sur l'électrode extracellulaire et l'activité correspondante sur les nerfs pour induire le rejet. Comme les programmes moteurs stimulent le nerf buccal deux A avec une longue série d'impulsions de deux hertz, d'une milliseconde, pour générer des patrons EES.

Les motifs se poursuivent pendant toute la durée de la stimulation et peuvent continuer jusqu'à peu de temps après la fin de celle-ci. Pour induire des programmes moteurs semblables à la morsure, placez quelques cristaux de caracol solide directement sur le ganglion cérébral.

Les motifs répétitifs commencent généralement dans les cinq minutes et durent environ 10 à 15 minutes avant de s'affaiblir progressivement pour induire la déglutition. Comme pour les programmes moteurs, appliquez caracol et attendez que la masse buccale produise des morsures vigoureuses. Puis, durant une morsure, placez une bande d'algue dans la bouche de l'animal afin qu'il saisisse l'algue.

Voici la stimulation et l'enregistrement du motoneurone identifié B9, ainsi que l'enregistrement réalisé sur ce même neurone, sur le muscle I2 et sur plusieurs nerfs au cours de programmes moteurs liés à l'alimentation. Voici les images vidéo issues de cette même série de programmes moteurs. Les motifs de déglutition ont été induits par l'application de carbamylcholine au ganglion cérébral, suivie de la mise en place d'une bande d'algue dans le préhenseur pendant les épisodes de morsure provoqués par la carbamylcholine.

Dans cette image, la radula est protractée pour saisir l'algue, et dans cette autre image, la radula s'est rétractée en tirant l'algue vers l'intérieur de la bouche. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place la préparation du massif buccal suspendu et d'obtenir des enregistrements des programmes moteurs de l'alimentation in vitro.