Name: Neo-Islet formation dans le foie des souris diabétiques par Helper-dépendante Transfert de gènes à médiation adénovirale Vecteur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Découvrez la formation de néo-îlots dans le foie de souris diabétiques par transfert de gènes à l'aide de vecteurs adénoviraux helper-dépendants. Cette méthode permet d'inverser l'hyperglycémie et de normaliser l'insulinémie.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R03: DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), le diabète et d&#39;endocrinologie Centre de recherche-(DERC - P30DK079638) au Baylor College of Medicine, une subvention de pilote et de faisabilité de l&#39;DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: Prix FRDJ # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
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<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
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<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

HDAds ont été développées pour surmonter la faiblesse des annonces de première génération et à exploiter pour l&#39;application de thérapie génique. Toutefois, des problèmes techniques subsistent. Par exemple, HDAd nécessite HT pour l&#39;emballage HDAd et d&#39;amplification vecteur n&#39;est pas aussi efficace que les premières générations annonces. HV est une annonce de première génération et toute contamination de compromis HV l&#39;efficacité de HDAd. Par conséquent, la transfection très efficace et des conditions optimales pour chaque passage en série sont essentiels. Un autre paramètre essentiel pour la production de vecteurs qui est de passage (P1 à P4) doit être utilisé pour le passage ultérieur 5 qui est directement utilisé comme inoculum pour les cellules en suspension. Pour notre expérience, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant le passage par lequel proportion vecteur HDAd est augmenté de façon spectaculaire dans le passage suivant (P3 de la figure 2). Le rendement des vecteurs HDAd dépend de cassettes transgène. Au cours de la production de vecteurs, les deux transgènes sont exprimés parce que les deux gènes sont souspromoteur ubiquitaire. Ngn3 est un facteur de transcription et de la CTB est un facteur de croissance, ce qui suggère que le facteur de transcription HDAd vecteur exprimant ce qui peut influer sur la lignée cellulaire inhibe l&#39;amplification vecteur tandis que l&#39;hormone de croissance contribue à exprimer la replication du vecteur et de l&#39;emballage. Avec le diabète prend des proportions épidémiques, de nouvelles approches pour restaurer la masse des cellules b sont nécessaires. Dans ce rapport, nous décrivons les méthodes pour exploiter les avantages de vecteurs HDAd pour effectuer le transfert de gènes de l&#39;îlot lignée de définir le facteur de transcription, Ngn3 avec le facteur de croissance des îlots, bêtacelluline pour induire néogenèse des îlots dans les régions périportaux du foie. Pour évaluer l&#39;efficacité de ce fait, il est important de choisir des souris présentant une hyperglycémie stable et s&#39;assurer que les contrôles appropriés sont toujours inclus. Pour ces expériences de transfert de gènes, le vecteur vide ont traité des souris diabétiques doivent toujours être utilisés. En outre, en utilisant HDAd-Ngn3 et HDAd-Btc traitées individuellement diabétique kmCE sert à tester la contribution individuelle de ces deux gènes dans des îlots néogenèse. Comme nos données démontrent que Ngn3 seule est suffisante pour induire îlot néogenèse, mais l&#39;ajout du facteur de croissance, la CTB, sert à augmenter la réponse conduisant à l&#39;induction robuste de l&#39;îlot néogenèse. Il est également important de vérifier que le vecteur d&#39;expression est en effet réalisé dans le tissu cible, le foie et aussi de démontrer que l&#39;insuline dosée dans le plasma des souris traitées ne vient pas des îlots résiduels dans le pancréas, en démontrant l&#39;absence de pancréas îlots chez les souris diabétiques. En résumé, l&#39;avantage du système HDAd-vecteur de transfert de gènes réside dans sa capacité de clonage élevée, une transduction efficace et à long terme l&#39;expression des gènes durable dans le foie avec une toxicité chronique minimale ainsi que la nature de la non-intégration du génome vecteur dans l&#39;hôte chromosome. Les principales limites sont les étapes complexes qui interviennent dans sa production et saapplication in vivo est principalement limité au foie avec le sérotype le plus populaire Ad 5. Islet néogenèse peut être amené à restaurer entièrement l&#39;insulinémie et la tolérance au glucose chez les souris diabétiques en induisant néogenèse des îlots dans le foie par transfert de gène du facteur de transcription îlot lignée définissant, Ngn3 avec le facteur de croissance des îlots, bêtacelluline. Dans ce rapport, nous montrons le protocole optimal pour produire de haute qualité HDAd-Ngn3 et HDAd-Btc, et la démonstration de techniques pour inciter et d&#39;évaluer néogenèse des îlots dans le foie des souris diabétiques pour inverser l&#39;hyperglycémie. Note: Les vecteurs viraux et les lignées cellulaires décrites ici sont disponibles dans le Laboratoire de base Vecteur de production, recherche sur le diabète Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Certains kits commerciaux sont également disponibles pour générer des virus (par exemple HDAd Microbix biosystems Inc.)

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Kit de transfection de mammifères ProFectionR </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood Kit et de tissus (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM poudre </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> La streptomycine Pénicilline </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, grade II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocine </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Verre spinner flacons </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Verre spinner flacons </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Faites glisser une casset-lyseur </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube OptiSeal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Chlorure de césium 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultracentrifugeuse </td></tr><tr><td> Filtrer </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> Centrifuger le tube à 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree scientifique, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> L&#39;insuline, Souris ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> Microvette cb300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Souris C-peptide ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> Guinée porc anticorps anti-insuline </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> de chèvre anti-anticorps Pdx1 </td><td> don du Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> souris anti Ngn3 anticorps </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. de Pennsylvanie </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> souris anti Nkx6.1 anticorps </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> bêtacelluline anticorps anti- </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) SET Couleur réactif. </td><td> Diagnostics Teco </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), jeu de réactifs Couleur Endpoint </td><td> Diagnostics Teco </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.

neo-islet formation dans le foie des souris diabétiques par helper-dépendante transfert de gènes à médiation adénovirale vecteur

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Diabète de type 1 est causé par des lymphocytes T destruction auto-immune des cellules productrices d&#39;insuline dans le pancréas. Jusqu&#39;à présent remplacement de l&#39;insuline est encore le traitement majeur, car la transplantation d&#39;îlots a été limitée par la disponibilité des bailleurs de fonds et par la nécessité d&#39;immunosuppression à long terme. Induite îlot néogenèse par transfert de gène de Neuogenin3 (Ngn3), l&#39;îlot lignée définir facteur de transcription spécifique et bêtacelluline (BTC), un facteur de croissance îlot a le potentiel de guérir diabète de type 1. Les vecteurs adénoviraux (Ads) sont très efficaces vecteur de transfert de gène, mais Annonces de première génération présentent plusieurs inconvénients pour une utilisation in vivo. Helper-dépendants Annonces (HDAds) sont les annonces les plus avancées qui ont été développées pour améliorer le profil de sécurité de première génération de pub et de prolonger l&#39;expression du transgène 1. Ils manquent de toxicité chronique parce qu&#39;ils n&#39;ont pas les séquences codantes virales 2-5 et ne conserver que l&#39;annonce cis elNTS nécessaires à la replication du vecteur et de l&#39;emballage. Cela permet le clonage des gènes jusqu&#39;à 36 ko. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de production HDAd-Ngn3 et HDAd-Btc et de livrer ces vecteurs dans des souris diabétiques STZ-induits. Nos résultats montrent que la co-injection de HDAd-Ngn3 et «îlots» néo-HDAd Btc induit dans le foie et renverse l&#39;hyperglycémie chez des souris diabétiques.

Nous décrivons hépatique néo-îlots formation en STZ (streptozotocine)-induite des souris diabétiques par transfert de gène de Neurogenin3 (Ngn3) et bêtacelluline (Btc) à l&#39;aide d&#39;aide en fonction de vecteur adénoviral (HDAd) et la reprise de l&#39;hyperglycémie. Notre méthode prend avantages de helper-vecteurs adénoviraux dépendants de leur très efficace dans la transduction in vivo et l&#39;expression du gène de longue durée.

Neo-Islet formation dans le foie des souris diabétiques par Helper-dépendante Transfert de gènes à médiation adénovirale Vecteur

Le diabète de type 1 est causé par la destruction auto-immune, médiée par les lymphocytes T, des cellules productrices d'insuline dans le pancréas. Jusqu'à présent, le remplacement de l'insuline reste le...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'induire des néo-îlots dans le foie de souris diabétiques par transfert génique médié par un vecteur adénoviral dépendant d'un agent d'aide. Ceci est réalisé en générant des vecteurs adénoviraux dépendants d'un agent d'aide portant le facteur de transcription des îlots neurogène 3 et le facteur de croissance des îlots bétaïne, afin d'induire la formation de néo-îlots périportaux dans le foie ; les vecteurs sont injectés dans des souris diabétiques. Les souris diabétiques traitées sont ensuite évaluées pour la normalisation de la glycémie, de l'insuline plasmatique et de la présence de cellules bêta productrices d'insuline dans le foie.Les résultats de ces tests montrent que l'hyperglycémie est inversée chez les souris traitées par le vecteur en raison de la formation d'une néo-paupière dans les régions périportales du foie. L'avantage du vecteur adénoviral dépendant de Herpa réside dans son large tropisme et sa forte capacité chronique. De plus, le vecteur adénoviral dépendant de Herpa ne contient aucune région codante pour Avir.C'est pourquoi il ne présente pas de toxicité chronique. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du diabète, car l'induction de nouveaux îlots constitue une alternative efficace à la transplantation d'îlots, qui est limitée par la pénurie de donneurs, l'échec de la greffe et l'immunité allogénique. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car le processus de transfection est délicat en raison de la grande taille du vecteur classmate.Et afin de minimiser la contamination par le virus du port, l'amplification et le processus de purification doivent être manipulés avec soin. La production de vecteurs d'adénovirus dépendants d'un virus auxiliaire implique plusieurs étapes qui doivent être soigneusement suivies pour obtenir des résultats optimaux. En préparation de la mise en culture pour la transfection, ensemencez 800&nbsp;001 cellules dans chacune de deux boîtes de six centimètres de diamètre.Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Après deux jours, les cellules seront confluentes à 70 à 80 % pour la transfection. Le jour de la transfection.Remplacez le milieu de croissance par cinq millilitres de milieu frais et incubez les cellules pendant trois heures. Ensuite, à l’aide du kit de transfection mammalienne Pro Perfection d’Promega Transfect, transfectez les cellules une 16 avec 10 microgrammes d’ADN codant pour le gène neurogène trois, désigné ci-après comme trois, ou une cellule bêta, désignée ci-après comme BTC. Le jour suivant, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de milieu de croissance à chaque fois.Ajouter le virus auxiliaire à raison de 500 particules vectorielles par cellule dans 0,1 millilitre de PBS contenant du calcium et du magnésium. Ensuite, placer les cellules dans l'incubateur toutes les 10 minutes. Agiter doucement les boîtes pour répartir uniformément le virus auxiliaire.Après 60 minutes, ajouter 1,5 millilitre de milieu de maintenance et remettre les boîtes dans l'incubateur pendant 24 heures. Le jour suivant, ajouter un autre millilitre de milieu de maintenance. Ensuite, à l’aide d’un microscope optique standard, examiner les cellules pour évaluer les effets cytopathiques.Les cellules infectées deviendront arrondies et se détacheront. Poursuivez l'incubation des cellules infectées jusqu'au deuxième jour. À ce stade, plus de 80 % des cellules devraient présenter des effets cytopathiques.Recueillir le lysat viral brut en aspirant et en rejetant à l’aide d’une pipette, puis le transférer dans un tube de cinq millilitres destiné au lysat viral brut. Ajouter un volume de 10 % de saccharose à 40 %. Étiqueter ce tube comme CVL pour passage zéro du lysat viral brut aux poux.Pour libérer les particules virales, effectuez trois cycles de congélation-dégélation du tube contenant le lysat viral brut en alternant les placements du tube dans un congélateur à moins 80 °C et dans un bain d'eau à 37 °C. Après le troisième cycle de congélation-dégélation, utilisez le milieu pour amplifier davantage le vecteur, comme décrit dans le texte accompagnant. Le processus d'amplification du vecteur produira un lysat viral brut issu du passage cinq ou P cinq du vecteur.Pour la production à grande échelle d'adénovirus dépendants d'un vecteur auxiliaire, commencez par effectuer trois cycles de congélation-dégélation du P5 provenant de la procédure d'amplification du vecteur, comme précédemment. Transférez une 16 cellules provenant d'un flacon agité de trois litres dans des bouteilles coniques de 500 millilitres et centrifugez-les à 1000 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirez tout le surnageant sauf 100 millilitres.Ensuite, resuspendre les cellules et les transférer dans un flacon agité de 250 millilitres contenant les cellules resuspendues. Ajouter tout le lysat viral brut P5. Puis ajouter le virus auxiliaire à raison de 200 particules virales par cellule et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius à 60 tr/min.Après l'incubation, transférez un millilitre de la suspension cellulaire dans un puits d'une plaque de 12 puits. Transférez le reste de la suspension cellulaire dans un nouveau flacon agité de trois litres et ajoutez deux litres de milieu de croissance en suspension. Incubez le flacon et la plaque pendant deux jours dans une incubateur à dioxyde de carbone à 60 tr/min. Au cours des deux prochains jours, surveillez les cellules dans la plaque pour détecter les effets cytopathiques.Si les cellules dans la plaque présentent des effets cytopathiques, les cellules dans le flacon agité présentent également des effets cytopathiques. Après l'incubation, recueillir les cellules par centrifugation et les resuspendre dans 15 millilitres de tris à 100 millimolaire. HCl dans un tube de 50 millilitres étiqueté P six.Conserver ce tube à moins 80 degrés Celsius jusqu'à la purification. Pour purifier le vecteur, ajouter un millilitre de dodécylsulfate de sodium à 5 % au tube décongelé contenant le lysat viral brut P6. Mélanger doucement et incuber 30 minutes à température ambiante.Ensuite, ajouter du chlorure de magnésium, les ARN A et les ADN un, et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, centrifuger le tube à 6 000 ×g pendant 10 minutes. Après la centrifugation, récupérer le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres vers un tube d'ultracentrifugation NVT 65 stérilisé. Ajouter 2,8 millilitres d'une solution de chlorure de césium de faible densité à 1,25 gramme par millilitre.Ensuite, à l’aide d’une pipette de deux millilitres, déposer 2,8 millilitres d’une solution de chlorure CM à haute densité de 1,41 gramme par millilitre sous la phase existante dans le tube en appuyant la pipette au fond du tube et en relâchant lentement la solution. Puis, à l’aide d’une pipette de deux millilitres, recouvrir cinq à six millilitres de surnageant. En touchant la paroi latérale du tube et en relâchant lentement la solution, remplir le tube jusqu’au col. Sinon, il pourrait s'effondrer lors de la centrifugation à grande vitesse. Utilisez du Tris HCl 100 millimolaire pour remplir le tube jusqu'au bout si nécessaire. Puis centrifugez à 10 degrés Celsius pendant 30 minutes à 237 000 ×g à 10 degrés Celsius.Après la centrifugation ultracentrifugeuse sur gradient de densité, une seule bande vectorielle opalescente est visible sous les débris cellulaires opaques. Parfois, une très faible bande d'aide peut être observée sous la bande vectorielle plus marquée. Essuyez le tube au niveau de la bande opalescente inférieure avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, à l’aide d’une seringue de trois millilitres équipée d’une aiguille de calibre 22, percer la paroi du tube à la base de la bande vectorielle et recueillir la bande inférieure opalescente. Transférer le matériel vectoriel recueilli dans de nouveaux tubes stérilisés pour ultracentrifugation, puis recouvrir d’une solution de chlorure de césium à une densité de 1,35 gramme par millilitre afin de remplir les tubes jusqu’au col.Effectuer une centrifugation à 10 degrés Celsius à 237 000 ×g pendant la nuit. Après le deuxième gradient de densité, récupérer la bande opalescente par ultracentrifugation comme précédemment. Transférer la bande dans une cassette de dialyse et dialyser contre trois litres de T tris stérile, HCl contenant du chlorure de magnésium et du saccharose, à quatre degrés Celsius pendant la nuit, le lendemain.Pour éliminer le vecteur adénoviral auxiliaire dépendant de la cassette de dialyse, utilisez une seringue de trois millilitres pour injecter deux millilitres d’air dans la cassette par le coin supérieur. Tournez la cassette afin que la seringue et l’aiguille se retrouvent au coin inférieur, puis, en maintenant la cassette en position verticale, aspirez la solution dans la seringue. Transférez la solution, qui contient désormais le virus purifié, dans des tubes cryogéniques étiquetés.Prélever 20 microlitres pour la titration physique et 50 microlitres pour la caractérisation de l'ADN dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre, puis congeler. Les tubes cryogéniques contiennent le virus purifié à –80 °C. Le virus purifié doit ensuite être évalué pour une pureté plus stricte et une efficacité in vitro.Comme décrit dans le document accompagnant, la streptozotocine est utilisée pour induire le diabète. Dans cette étude, comme indiqué dans le document accompagnant, surveiller les souris traitées avec de la streptozotocine chaque semaine pour détecter une hyperglycémie. Une fois que la glycémie se situe entre 250 et 500 milligrammes par décilitre pendant 48 heures, placer les souris dans un dispositif de contention de la queue pour une injection intraveineuse dans la queue.Placer la queue dans un tube de 50 millilitres contenant de l'eau tiède afin de dilater les veines de la queue. Ensuite, passer un tampon imbibé d'éthanol à 70 % sur la queue. Remplir une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 30 et demi avec la concentration appropriée de vecteur et vérifier qu'il n'y a pas de bulles dans la seringue.Ensuite, avec le pouce et l'index, saisissez la queue sous le site d'injection et insérez l'aiguille dans la veine de la queue. Si l'aiguille est dans la veine, un reflux de sang peut être visible dans l'embase de l'aiguille. Injectez lentement le vecteur.Si l'aiguille est correctement positionnée, il n'y aura aucune résistance pendant l'injection. Retirer l'aiguille et maintenir le site d'injection avec de la gaze pour arrêter tout saignement avant de remettre la souris dans sa cage. Après le traitement par vecteur, surveiller hebdomadairement la glycémie à jeun de six heures et le poids corporel, et mesurer les niveaux d'insuline et d'enzymes hépatiques toutes les deux semaines.Réalisez un test de tolérance au glucose six semaines après le traitement afin de vérifier si la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose est restaurée in vivo aux trois et six semaines suivant le traitement. Prélèvez le foie et le pancréas des souris pour analyser le MNA tissulaire et effectuer une coloration immunohistochimique, afin d’évaluer si une néogenèse des ilots peut être induite dans le foie de souris diabétiques par transfert génique médié par un vecteur adénoviral. Les adénovirus dépendants de l’aide ou H-D-A-D-N-G-N trois et les vecteurs BTC ont été préparés et purifiés comme décrit dans cette vidéo ; les vecteurs ont été administrés à des souris diabétiques induites par la streptozotocine par injection intraveineuse dans la queue.Les vecteurs vides et les vecteurs H-D-A-D-B-T-C seuls ont servi de contrôles négatifs. La glycémie a ensuite été surveillée tous les deux jours pendant sept à 10 jours suivant l'injection. L'hyperglycémie a été inversée chez les souris injectées avec HDAD et GN trois et H-D-A-D-B-T-C, mais pas chez les souris témoins.La sécrétion d'insuline stimulée par le glucose a également été surveillée par un test de tolérance au glucose réalisé six semaines après le traitement, comme indiqué ici. La sécrétion d'insuline a été restaurée chez les souris injectées avec HDAD et GN trois et H-D-A-D-B-T-C afin d'évaluer si l'insuline était synthétisée dans le foie. La teneur en peptide C et en insuline a été dosée dans le foie.Les concentrations en peptide C et la teneur totale en insuline ont été mesurées à l’aide d’un kit ELIZA commercial. La présence de peptide C et d’insuline en rapports molaires confirme que l’insuline détectée dans le foie est effectivement synthétisée dans celui-ci. L’immunohistochimie a révélé la présence de cellules positives dans le foie de souris traitées avec HDAD, NGN trois et H-D-A-D-B-T-C, mais pas chez les souris traitées avec le vecteur contrôle. La coloration immunologique a également démontré qu’il n’y avait pas d’îlots résiduels dans le pancréas des souris traitées avec NGN trois BTC.L'expression du facteur de transcription spécifique à la lignée de la paupière a également été évaluée par immunomarquage du foie. Comme indiqué ici, NGN trois était exprimé dans le foie de souris traitées par NGN trois BTC, mais pas dans celui de souris traitées par le vecteur vide.De même, la BTC était exprimée à un niveau plus élevé dans le foie des souris traitées par NGN trois BTC par rapport à celui observé avec le traitement par vecteur vide, comme indiqué ici. La coloration immuno P DX un a révélé une localisation nucléaire dans les foies traités par NGN trois BTC, mais pas dans les foies de souris traités par vecteur vide. NK X 6.1 a également été détecté uniquement dans les foies de souris traités par NGN trois BTC prélevés.Ensemble, ces résultats suggèrent une induction réussie de la formation de paupières néoformées dans le foie de la souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer des vecteurs adénoviraux auxiliaires dépendants afin de transférer dans le foie des gènes déterminant la lignée des paupières pour induire la néogenèse oculaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois semaines si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le virus auxiliaire est un avir de première génération qui nous aide. La contamination doit être maintenue au minimum pour les applications in vivo.

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Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

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Neo-Islet formation dans le foie des souris diabétiques par Helper-dépendante Transfert de gènes à médiation adénovirale Vecteur (Vidéo) | JoVE Journal

Neo-Islet formation dans le foie des souris diabétiques par Helper-dépendante Transfert de gènes à médiation adénovirale Vecteur

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