Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules épithéliales alvéolaires de type deux neuronales primaires pures et viables en vue d'analyses fonctionnelles et moléculaires ultérieures. Premièrement, le poumon et la trachée d'une souris sacrifiée sont perfusés avec une solution de DYS displays, puis avec de l'agarose. Le poumon est ensuite prélevé après que le dispa ait digéré le tissu pulmonaire.

Le tissu est désagrégé manuellement. La suspension obtenue est filtrée à travers une série de mailles de taille de pore décroissante. Ensuite, les cellules épithéliales alvéolaires de type deux sont isolées par sélection négative en cytométrie en flux après coloration.

En fin de compte, les cellules épithéliales alvéolaires de type deux isolées peuvent être utilisées pour réaliser des tests fonctionnels et moléculaires afin d'étudier leur rôle dans les infections respiratoires et les maladies auto-immunes pulmonaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions immunitaires pulmonaires, notamment dans le contexte des maladies pulmonaires auto-immunes et des infections virales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation de l'organe et de la suspension cellulaire est difficile à apprendre.

Le succès global de ce protocole dépend de plusieurs détails importants au cours de ces étapes. Pour chaque souris de l'expérience, préchauffer un tube de 15 millilitres contenant quatre millilitres de DYS bays dans un bain-marie à 37 degrés Celsius ; placer de petits aliquots d'agarose à 1 % faible fusion dans l'eau sur un bloc chauffant à 95 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient liquéfiés. Puis les refroidir à 45 degrés Celsius et les maintenir à cette température jusqu'à leur utilisation ultérieure.

Pour préparer le poumon de souris, pulvériser une souris qui a été sacrifiée par asphyxie au CO2. Avec de l'éthanol. Effectuer une longue incision le long de la ligne médiane ventrale du corps.

Ensuite, tirez la peau ventrale distante et coupez soigneusement puis retirez le péritoine. Après avoir exsanguiné la souris, percez soigneusement et retirez le diaphragme, puis découpez les côtes. Pour exposer le cœur et les poumons, prenez bien soin de ne pas blesser les poumons avec une canule de calibre 26 et une seringue de 10 millilitres remplie de liquide froid.

Perfuser le cœur en perforant le ventricule droit avec du PBS, puis perfuser les poumons avec du PBS jusqu'à ce qu'ils soient débarrassés du sang. Sectionner et retirer les glandes salivaires afin d'exposer la trachée. Couper également soigneusement les muscles entourant la trachée.

Ensuite, insérez une canule intraveineuse de calibre 22 dans la trachée. Retirez l'aiguille et poussez le cathéter en plastique vers le poumon. Fixez le cathéter en place en nouant un petit morceau de fil autour de la trachée et du cathéter.

Si désiré, préparez un échantillon de liquide de lavage bronchoalvéolaire en rinçant les poumons à l'aide du cathéter inséré dans la trachée avec du PBS ou du milieu. Conservez le liquide de lavage sur de la glace jusqu'à une analyse ultérieure. L'aspect le plus difficile de cette procédure est la digestion et la désintégration tissulaire.

Pour assurer la réussite de ce protocole, vous devez veiller à ce que le dispase complet soit bien réparti dans tous les lobes pulmonaires après la digestion du tissu. Vous devez désagréger soigneusement le tissu à l’aide d’une seringue de deux millilitres, en injectant au maximum deux millilitres du dispase préparé précédemment dans le poumon par le cathéter, de sorte que tous les lobes soient complètement dilatés. Remplacez ensuite la seringue par une seringue d’un millilitre contenant 0,5 millilitre du matériau aros liquéfié et instillez son contenu dans le poumon.

Laissez la seringue sur le cathéter pour éviter le reflux de l'aérosol et recouvrez immédiatement le poumon avec du papier absorbant de laboratoire et de la glace. Laissez le gel aérosol se former pendant quelques minutes. Retirez le papier absorbant, la glace, la seringue et le cathéter.

Ensuite, couper la trachée et exciser le poumon, le cœur et le thymus de la cage thoracique. Rincer les organes préparés dans une boîte avec du PBS. Puis séparer le cœur, le thymus et les restes de la trachée du poumon et les éliminer.

Placez le poumon dans le tube contenant les deux millilitres restants de milieux et incubez à température ambiante pendant 45 minutes. Ajustez l'incubation afin d'assurer un blocage efficace des récepteurs FC des cellules phagocytaires avant la procédure de marquage. Transférez le poumon du milieu vers une boîte contenant sept millilitres d'un microgramme par millilitre d'anticorps anti-CD1632 et 100 microlitres d'ADN dans du DMEM, puis désintégrez complètement le tissu pulmonaire à l'aide de deux paires de forceps en l'effilochant.

Incubez ensuite pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur réglé à 200 tr/min, si désiré. La suspension cellulaire peut alors être conservée à quatre degrés Celsius jusqu'à l'étape suivante. Passez la suspension cellulaire à travers une série de tamis en nylon.

Verser d'abord la suspension à travers un filtre de 100 microns placé au-dessus d'un tube de 50 millilitres. Si l'on regroupe des échantillons, faire passer les suspensions cellulaires provenant de souris du même groupe à travers le même filtre. Si le filtre se bouche, le remplacer par un filtre neuf.

Répétez ce processus avec un filtre tamis de 70 microns. Veillez à rincer soigneusement chaque tamis ainsi que les tubes et les boîtes avec du DMEM afin de minimiser la perte de cellules et d'optimiser le rendement. Ensuite, faites passer la suspension à travers un filtre tamis de 48 microns tendu sur un anneau en plastique ou en verre, comme illustré ici.

Recueillir l'écoulement dans une boîte de Pétri. Répéter ensuite ce processus avec un tamis de 30 microns. Selon le volume, transférer le filtrat dans un ou plusieurs tubes de 50 millilitres et centrifuger pendant 15 minutes à 160 ×g à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, retirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans deux millilitres de tampon de lyse des érythrocytes. Arrêtez ensuite rapidement la lyse par l'ajout de 13 millilitres de milieu DMEM. Transférez la solution dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant 12 minutes à 160 ×g et à 4 °C.

Incubez les cellules avec trois millilitres d’un cocktail d’anticorps primaires contenant des anticorps dirigés contre CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD1632 et CD45. Incubez les cellules pendant 10 minutes à l’obscurité à quatre degrés Celsius ou sur de la glace. Après l’incubation, lavez les cellules en remplissant le tube avec du DMEM et centrifugez pendant 12 minutes à 160 × g et à quatre degrés Celsius.

Resuspendre les cellules dans un millilitre de DMEM et préfiltrer à l’aide d’un filtre de 50 microns dans un tube destiné au tri cellulaire. Compter les cellules afin d’obtenir le nombre total de cellules dans la suspension pulmonaire. Utiliser une buse de 100 microns pour le tri cellulaire d’un EC2 juste avant le prélèvement.

Mélangez la suspension cellulaire par vortexage avec le fluide de gainage. La pression du fluide ainsi que les longueurs d'onde d'émission laser et de détection dépendent de l'instrument utilisé pour le tri cellulaire par cytométrie en flux, ainsi que des fluorochromes employés lors de la procédure de marquage par anticorps. Commencez par créer un graphique de la surface de diffusion latérale en fonction de la fluorescence, puis sélectionnez toutes les cellules présentant une forte surface de diffusion latérale et négatives pour les fluorochromes utilisés lors du marquage.

Ensuite, générer des graphiques d'aire de diffusion latérale en fonction de l'aire de diffusion avant, de hauteur de diffusion avant en fonction de l'aire de diffusion avant, et de hauteur de diffusion latérale en fonction de l'aire de diffusion latérale, puis appliquer une sélection pour exclure les doubles ou agrégats cellulaires en dirigeant l'échantillon vers un tube contenant du DMEM. Lors de l'obtention de suspensions cellulaires pulmonaires isolées de souris saines, la population dans la porte EC2 représentera typiquement environ 42 ± 10 % de tous les événements. Afin de récupérer les cellules triées, centrifuger pendant 20 minutes à 280 ×g et à 4 degrés Celsius.

Resuspendez les cellules épithéliales alvéolaires de type deux ou les aEC2 en milieu de culture ou en tampon, selon les besoins pour les analyses ultérieures. Les cellules épithéliales alvéolaires de type deux primaires de souris ont été isolées par sélection négative en cytométrie en flux comme décrit dans cette vidéo ; l'analyse des cellules triées est représentée ici. Tel qu'indiqué.

La pureté des cellules isolées est d'environ 92 ± 5 %. Les cellules AEC2 triées ont été marquées pour la protéine du surfactant C. Une image en contraste de phase est présentée à gauche et une immunofluorescence à droite. Près de 100 % des cellules se sont révélées positives pour la protéine du surfactant C, confirmant ainsi l'isolement réussi d'une population pure. Afin d'évaluer les effets d'une infection in vivo par le virus de la grippe A, les AEC2 ont été isolées à partir de souris C57BL/6 ayant reçu soit du tampon salin phosphate soit le virus de la grippe A PR8 (A/34) par voie intranasale un, deux ou trois jours auparavant.

Ces graphiques montrent des suspensions de cellules pulmonaires provenant de souris mâles C57BL/6 non infectées ainsi que de souris infectées depuis trois jours, marquées pour le tri en raison du recrutement de cellules immunitaires vers le poumon infecté. La proportion de cellules négatives en fluorescence et présentant une surface de diffusion latérale élevée est nettement réduite dans la suspension cellulaire préparée à partir des souris infectées depuis trois jours par rapport aux souris non infectées. L'expression de la protéine nucléaire du virus de la grippe A a été analysée par coloration intracellulaire à l'aide d'un anticorps spécifique de la protéine nucléaire, puis triée selon un C deux.

L'histogramme montre qu'un C deux isolé de souris infectées in vivo produit un signal de fluorescence spécifique après coloration intracellulaire de la protéine nucléocapsidique du virus de la grippe A. Le tableau indique l'intensité moyenne de fluorescence de la coloration de la protéine nucléaire : l'intensité du signal généré par la coloration intracellulaire de la protéine nucléaire d'un EC2 isolé de souris infectées par le virus de la grippe A augmente avec la durée de l'infection virale, ce qui démontre la viabilité d'un EC2 isolé de souris saines et permet de tester leur sensibilité à l'infection par le virus de la grippe A.

L'expression de la protéine nucléaire du virus de la grippe a également été analysée dans des cellules isolées infectées ex vivo, comme illustré ici. Une proportion importante de cellules EC2 exprime la protéine nucléaire virale six heures après l'infection. Ces données sont résumées ici.

Le pourcentage de EC2 positifs pour la coloration intracellulaire de la protéine nucléaire virale dépend de la dose virale utilisée pour l'expérience d'infection ex vivo. Ces résultats montrent que le neurone primaire isolé, un EC2, est viable et sensible à l'infection et à la réplication virales, évaluées par l'expression de la protéine virale observée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est très important de se souvenir d'effectuer soigneusement toutes les étapes de digestion et de désagrégation des tissus.

En outre, il est très important de bien contrôler strictement la fluorescence négative et la région des cellules à forte granularité latérale. Lors du tri selon cette procédure, d'autres méthodes telles que des études moléculaires et fonctionnelles peuvent être réalisées afin d'éliminer le rôle du type cellulaire deux des tiers du poumon dans le contexte des infections virales et des maladies pulmonaires auto-immunes.