Présentatrice d'antigène artificielle d'activation à médiation cellulaire (AAPC) et l'expansion des cellules T tueuses naturelles

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules présentatrices d'antigènes artificielles CD1D, ou A APC, pour l'expansion des cellules NKT. Cela est réalisé en ajoutant d'abord des protéines afin de fonctionnaliser les billes magnétiques. Dans la deuxième étape, la population initiale de cellules NKT provenant du sang périphérique est enrichie.

Ensuite, les lymphocytes T enrichis sont cultivés en co-culture avec les CPA AA. Dans la dernière étape, le phénotype et la fonction de la population cellulaire CPA AA sont évalués. Enfin, la pureté des sous-populations de lymphocytes T amplifiés peut être déterminée par analyse cytométrique en flux. Le principal avantage des CPA par rapport aux méthodes actuelles utilisant les cellules dendritiques est qu’il peut exister une forte variabilité entre donneurs avec les cellules dendritiques.

Les CPA fournissent une méthode reproductible, prête à l'emploi et standardisée pour l'expansion des cellules T NK. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque je travaillais avec le Dr Schneck et Oaky à l'université Johns Hopkins. Ils ont été des pionniers dans le domaine de l'utilisation de complexes artificiels de présentation de l'antigène pour l'expansion de sous-populations classiques de cellules T CD8.

Le Dr James East, chercheur postdoctoral, et le fils du Dr Wendy, chercheur associé de mon laboratoire, démontreront la procédure. Commencez par transférer un millilitre de billes époxy Dyna Bead M-450 dans un flacon en verre borosilicaté transparent fileté de cinq millilitres. Rincez ensuite les billes avec trois millilitres de tampon Bore 8 stérile dans un tube microcentrifuge séparé de 1,5 millilitre.

Ajoutez 100 microgrammes du dimère Ig de CD1D humain et 20 microgrammes des molécules co-stimulatrices souhaitées à un millilitre de PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, placez le flacon en verre contenant les billes sur un aimant et aspirez le tampon borate. Puis ajoutez le mélange protéique au flacon en verre et remettez le bouchon.

Mélangez immédiatement la solution en retournant le flacon, puis recouvrez le bouchon de parafilm et placez-le sur un rotateur pendant toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, placez à nouveau le flacon en verre sur l'aimant et retirez soigneusement le mélange protéique en évitant les billes. Lavez les billes trois fois en ajoutant trois millilitres de tampon de lavage des billes et en les incubant sur le rotateur à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour confirmer que les protéines sont stablement fixées sur les billes, colorer un aliquot de billes avec des anticorps et les analyser par cytométrie en flux. Transférer maintenant cinq fois 10 à la puissance sept billes dans un petit flacon en verre de 1,5 millilitre et rincer les billes avec un millilitre de PBS stérile. Puis 48 à 72 heures avant utilisation.

Chargez les billes lavées avec l'antigène dans un millilitre de PBS stérile pendant que les billes sont en cours de chargement avec l'antigène. Récupérez les PBMC en diluant d'abord le sang de donneur hépariné avec un volume égal de PBS à température ambiante. Ajoutez ensuite 15 millilitres de PHI à température ambiante dans des tubes coniques de 50 millilitres, puis recouvrez lentement 25 millilitres du mélange sanguin dilué au-dessus du PHI.

Appeler ensuite après avoir centrifugé les échantillons pendant 30 minutes à 700 ×g et à température ambiante avec frein activé. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer soigneusement l'interface des lymphocytes dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, laver les lymphocytes avec 50 millilitres de PBS, jeter le surnageant et regrouper les tubes provenant d'un même donneur dans un seul tube.

Après avoir lavé à nouveau les PBMC avec 20 millilitres de PBS, comptez les cellules, puis resuspendez-les à une concentration de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre dans du tampon max. Pour isoler la fraction de lymphocytes T, incubez 100 microlitres de solution d'enrichissement PAN pour lymphocytes T du kit d'enrichissement de lymphocytes T humains EP avec deux millilitres de PBMC pendant 10 minutes à température ambiante. Incubez ensuite la solution avec 100 microlitres de billes magnétiques pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante.

Amener le volume final du solvant à 2,5 millilitres, puis placer le tube dans l'aimant. Après cinq minutes, verser rapidement la fraction positive pour CD3 dans un tube conique de 15 millilitres. Laver ensuite les cellules avec 5 millilitres de tampon Max froid et dénombrer les cellules viables.

Prélvez un aliquot pour la coloration des facteurs afin de sélectionner d'abord les cellules positives pour le CD161. Resuspendez les lymphocytes T enrichis dans 980 microlitres de tampon Max glacé, puis incubez les cellules avec 10 microgrammes d'anticorps monoclonal anti-CD161 pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Après lavage des cellules, reconstituez le culot dans 800 microlitres de tampon Max et 200 microlitres de microbilles anti-IgG US.

Incuber cette solution à quatre degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Pendant que les cellules s'incubent avec les microbilles, ajouter trois millilitres de tampon max pour équilibrer une colonne LS. Après avoir lavé cette fraction cellulaire, pipeter lentement les cellules dans trois millilitres de tampon max dans la colonne.

Effectuez maintenant un rinçage de la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon Max frais. Ajoutez ensuite trois millilitres supplémentaires de tampon Max frais sur la colonne et transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres. Éluerez les cellules positives pour CD161 et positives pour CD3 purifiées, puis comptez la fraction enrichie en cellules NKT.

Commencez cette étape par une co-culture de 10 puissance 6 cellules T enrichies CD161-positives CD3-positives et de 10 puissance 6 APC dans 16 millilitres de milieu complet. Répartissez 160 microlitres par puits de la co-culture dans une plaque en polystyrène traitée pour culture tissulaire, à fond rond et 96 puits, munie d’un couvercle à faible évaporation. Entre le jour 12 et 14, récoltez et comptez les cellules. Analysez les populations par cytométrie en flux, puis repiquez et reprenez la co-culture.

Les cellules NKT étendues comme vient de le montrer, congèle les cellules NKT supplémentaires après le deuxième cycle d'expansion. Pour tester la fonctionnalité des cellules A A PC lors de la première co-culture, mélangez cinq fois 10 à la puissance 4 cellules NKT par puits avec cinq fois 10 à la puissance 5 cellules A A PC dans un volume final de 200 microlitres de milieu complet, dans une plaque 96 puits à fond rond. Après 24 à 48 heures, récoltez le surnageant de la culture cellulaire pour analyse par Eliza. Cette première figure démontre que les protéines CD 1D IG sont immobilisées de manière stable à la surface des billes magnétiques, comme indiqué ici.

Les anticorps anti-CD1D IG et anti-CD28 sont tous deux exprimés à la surface des billes magnétiques, comme le montre ce graphique. L'hybridome de cellules T NK du souris V alpha 14 positif DN 30 2D trois a été mis en co-culture avec soit un antigène alpha-galactosylcéramide soluble dans le milieu et des cellules présentatrices d'antigène A A PC non chargées, soit des cellules A A PC chargées en alpha-gal. Les surnageants de culture ont ensuite été recueillis, et la production d'IL-2 a été mesurée par ELISA, offrant ainsi une méthode simple pour tester chaque lot de cellules présentatrices d'antigène. Dans cette expérience, les cellules T périphériques humaines CD161 positives et CD3 positives ont été enrichies par séparation à l'aide de billes magnétiques.

Les cellules ont ensuite été stimulées une fois par semaine pendant 14 jours avec des CPA chargées en alpha-galéra et analysées pour l'expression de V alpha 24 et de V beta 11. Il est important de noter qu'avec une population initiale relativement faible de cellules NKT de 0,03 %, les cellules ont pu être amplifiées jusqu'à atteindre environ 67 % de la population double positive V alpha 24 et V beta 11. Ici, les cellules C1R-CD1D ont été incubées avec les cellules NKT selon les rapports indiqués en présence ou en absence de l'antigène Alpha Gal CER, dans des plaques de 96 puits en forme de U, pendant 20 à 24 heures.

La lyse cellulaire médiée par les cellules NKT de la lignée de lymphome B a ensuite été évaluée par un test de libération de chrome. Des cellules NKT amplifiées par APC ont pu lyser cette lignée de cellules lymphomateuses. En présence ou en absence d'alpha-galactosylcéramide, des cellules NKT ont été amplifiées à partir des PBMC de donneurs sains et de patients atteints de cancer, et chargées avec l'alpha-galactosylcéramide.

Une PC a permis d'élargir les populations de cellules NKT à partir des deux groupes. En partant d'une population initiale de 2 millions de cellules T positives pour CD161 et CD3, plus de 10⁷ cellules peuvent être obtenues après deux cycles d'expansion. Les cellules NKT peuvent être utilisées pour des études fonctionnelles, comme le montre cet exemple.

Les cellules NKT étendues ex vivo restent sensibles à la stimulation par l'Alpha GAL et continuent de produire efficacement de l'IL-17A, du TNF-alpha et de l'interféron gamma. Il convient de noter que si la population initiale de lymphocytes T enrichie est faible et que la deuxième étape d'enrichissement par le CD161 ne peut être réalisée, l'expansion médiée par les CPAA pourrait ne pas donner les résultats escomptés. Toutefois, si le pourcentage de cellules NKT circulantes est supérieur à 0,1 %, une expansion significative des cellules NKT invariantes devrait tout de même pouvoir être obtenue.

Collectivement, ces données démontrent que la PCA basée sur CD1D peut être utilisée pour amplifier et stimuler efficacement les lymphocytes T NK humains primaires selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que la PCR quantitative, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple quelles sont les cinétiques d'activation des lymphocytes T NK après leur développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hépatologie pour explorer le rôle des cellules T NK dans les maladies du foie gras.