Name: Présentatrice dantigène artificielle dactivation à médiation cellulaire (AAPC) et lexpansion des cellules T tueuses naturelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Découvrez l'expansion des cellules NKT à partir de sang périphérique humain en utilisant des cellules présentatrices d'antigène artificielles basées sur CD1d. Cette méthode standardisée offre une approche reproductible pour la recherche en immunothérapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier Priyanka Subrahmanyam pour des discussions utiles. Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt financier. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;American Cancer Society, le NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, et P30 immunologie tumorale et programme d&#39;immunothérapie à TJ Webb. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.

1. Génération de aAPC <ol><li> Avant d&#39;ajouter des protéines à des billes, préparer tous les réactifs et tampons: tampon borate 0,1 M, D-1X PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +); (azoture de PBS 1X +5% de sérum AB humain + sodium à 0,02%) de tampon de lavage perle , milieu complet (milieu RPMI 100 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de solution de vitamines non essentiels, 100 mM MEM vitamine solution, 1% de 2-mercaptoéthanol, 10 uM ciprofloxacine, 5% de sérum AB humain); tampon MACS (1 L de PBS gratuit de Ca 2 + et Mg 2 +, 5 g de BSA, et EDTA 2 mmol). </li><li> Rincez 1 ml perles Dynabeads Epoxy M-450 avec 3 ml tampon 0,1 M stérile Borate (acide borique et de l&#39;eau, pH 7,0-7,4) dans un flacon en verre de 5 ml borosilicate clair filetée. </li><li> Dans une autre tube de 1,5 ml, ajouter 100 mg hCD1d-Ig dimère et 20 pg molécules co-stimulatrices (par exemple: anti-CD28mAb) à 1 ml de PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Lieu perle flacon en verre contenant l&#39;aimant et un tampon de borate aspiration à partir de perles. Ajouter le mélange de protéines à partir de l&#39;étape 1.2 de flacon en verre et remettre le capuchon. Mélanger immédiatement en retournant le flacon, le bouchon de couvrir avec du parafilm et placer sur un agitateur et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, flacon en verre lieu sur l&#39;aimant et retirer mélange de protéines, tout en évitant soigneusement perles. Laver les billes en ajoutant 3 ml de tampon de lavage perle (PBS avec 5% de sérum AB azoture de sodium +0,02%), et l&#39;incubation à 4 ° C sur un agitateur pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Billes peuvent être stockées dans ce mélange de lavage bourrelet. Pour faire aAPC fonctionnelle, retirer une petite aliquote et compter les perles à l&#39;aide d&#39;un hématimètre. Vérifiez que les protéines sont chargées de façon stable sur les billes par coloration avec des anticorps (ex. PE-conjugué anti-IgG1 de souris) et de réaliser des analyses de cytométrie en flux. </li><li> Pour charger des perles avec l&#39;antigène, retirez 5 x 10 7 perles, et les ajouter à un petit flacon en verre 1,5 ml, rincer perles avec 1 ml de PBS stérile. Resuspend lavé perles avec 1 ml de PBS stérile et ajouter antigène; exemple: Chargez α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Remarque: Bien, nous n&#39;avons pas détecté de problèmes avec liposolubilité ou formation de micelles, les lipides doivent être manipulés conformément aux recommandations du fabricant. Plus précisément, KRN7000 a été reconstitué dans du DMSO (1mg/ml) pour ces études. KRN7000 et d&#39;autres antigènes glycolipides peuvent également être dissous dans 0,2 mg / ml de PBS contenant 0,5% de Tween-20 (soniquer 2 h. À 37 ° C). IMPORTANT-La aAPC besoin d&#39;être chargé pendant au moins 48-72 heures avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. Isolement du CD161 + cellules CD3 + <ol><li> Recueillir les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Pour une densité Ficoll gradient de séparation centrifugation de lymphocytes d&#39;un buffy coat ou pack leucophérèse, d&#39;abord diluer le sang hépariné avec un volume égal de PBS 1X à température ambiante. </li><li> Ajouter 15 ml de Ficoll (réchauffé à température ambiante) pour tubes de 50 ml coniques. Lentement superposition25 ml de sang dilué le mélange au-dessus de la Ficoll. Centrifuger à 2000 rpm pendant 30 min à température ambiante avec le frein hors tension. </li><li> Retirez délicatement l&#39;interface lymphocytaire (anneau blanc entre les médias et le Ficoll) avec une pipette Pasteur et transférer dans un nouveau tube de 50 ml conique. </li><li> Laver les cellules en remplissant le tube de 50 ml avec du PBS et centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min. Jeter le surnageant et combiner les tubes d&#39;un seul individu à un seul tube et laver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à nouveau avec 20 ml de PBS. Comptez ensuite les PBMC et remettre en suspension à une concentration de 5 x 10 7 cellules / ml dans un tampon MACS (1 L de PBS sans Ca 2 + et Mg 2 +, 5 mmol g de BSA et 2 EDTA). </li><li> Afin d&#39;isoler la fraction de cellules T, commencez avec 2 ml de PBMC (10 8 cellules) et ajouter 100 ul de Pan T solution d&#39;enrichissement de cellules à partir du Kit EasySep Human T enrichissement de cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li&gt; <li> Ajouter 100 ul de particules magnétiques à la solution et incuber à température ambiante pendant 10 min. Amener le volume final de 2,5 ml de solvant à et placer le tube dans l&#39;aimant violet pendant 5 min. Verser rapidement au large de la fraction CD3 + dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 5 ml de tampon MACS froid, comptez le nombre de cellules viables, et enlever une partie aliquote pour la coloration FACS. </li><li> Pour sélectionner les cellules CD161 +, d&#39;abord remettre les lymphocytes T enrichis en 980 ul de tampon MACS glace froide, ajouter 10 mg de lutte contre CD161 anticorps monoclonal, et incuber au réfrigérateur pendant 10 min. </li><li> Centrifuger les cellules à 1500 rpm à 4 ° C pendant 5 min. Puis reconstituer le culot de cellules dans 800 ul de tampon MACS. Ajouter 200 ul d&#39;anti-souris IgG1 microbilles et incuber la solution pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Au cours de cette étape d&#39;incubation, à équilibrer une colonne LS en ajoutant 3 ml de tampon MACS. </li><li> Ensuite, laver les cellules par centrifugation 1500 rpm à 4 ° C pendant 5 min. Resupasser les cellules dans 3 ml de tampon MACS. Puis ajouter les cellules dans la colonne de séparation LS MACS. Assurez-vous d&#39;éviter de générer des bulles par pipetage lentement. Rincer la colonne en ajoutant 3 ml de tampon MACS. Répéter deux fois. </li><li> Ajouter 3 ml de tampon MACS frais et retirez la colonne de l&#39;aimant. Lieu colonne dans un tube conique de 15 ml. Insérez plongeur et pousser sur le contenu pour obtenir purifiés CD161 + CD3 + cellules. Le comte de cellule NKT fraction enrichie. Vous devriez avoir 2-4 millions de cellules. </li></ol> 3. aAPC médiée par l&#39;expansion des cellules NKT <ol><li> Mettre en place une co-culture en ajoutant 10 6 enrichis CD161 + CD3 + cellules T et 10 6 AAPC dans 16 ml de milieu complet (milieu complet + IL-2, 100 U / ml). Plaque de ce mélange en ajoutant 160 ul / puits volume final de 96 puits de culture tissulaire en polystyrène traitées, U-fond de la plaque avec une faible évaporation couvercle. Effectuer échange de milieu tous les jours 7 ème en ajoutant 80 pl de milieu frais. </li><li> Récoltecellules, compter, et effectuer une coloration FACS le jour 12-14. </li><li> Les cellules NKT peuvent être élargis réétalées comme décrit ci-dessus à l&#39;étape 3.1, en ​​particulier remettre en suspension les cellules T 10 6 10 6 élargis et VAMP dans 16 ml de milieu complet. Plaque de ce mélange en ajoutant 160 ul / puits de 96 puits à fond en U plaque. Continuer à rafraîchir milieu de coculture tous les jours 7 ème en ajoutant 80 pl de milieu frais. </li><li> Il est préférable de congeler les cellules NKT supplémentaires après le second tour de l&#39;expansion (1 x 10 6 / cryovial dans 1 ml-5% de DMSO / 95% de FBS.) </li></ol> 4. Test fonctionnel: aAPC médiée par la stimulation des cellules NKT <ol><li> Mettre en place 5x10 4 cellules NKT / bien avec 5x10 5 aAPC dans 200 ul volume final (milieu complet) dans 96 puits à fond en U plaque. </li><li> Surnageant de culture cellulaire pour la récolte ELISA après 24-48 heures. </li></ol>

<ol><li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+T-cell+receptor+%CE%B1%CE%B2-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V%CE%B2+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel population of T-cell receptor αβ-bearing thymocytes which predominantly expresses a single Vβ gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li>
<li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li>
<li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+%CE%B1%CE%B2+T+cells+expressing+invariant+TCR+%CE%B1-chains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Close phenotypic and functional similarities between human and murine αβ T cells expressing invariant TCR α-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li>
<li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V%CE%B124%2B+CD4-CD8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Requirements for CD1d recognition by human invariant Vα24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li>
<li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+expression+of+a+distinctive+V14%2B+T-cell+antigen+receptor+%CE%B1+chain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor α chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li>
<li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invariant+V%CE%B124-J%CE%B1Q%2FV%CE%B211+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">An invariant Vα24-JαQ/Vβ11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li>
<li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+System%3A+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24%2B+NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li>
<li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li>
<li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li>
<li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li>
<li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li>
<li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li>
<li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li>
<li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I%2Fpeptide+antigen+complexes+on+microspheres+%28large+multivalent+immunogen%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li>
<li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li>
<li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells%3A+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8%2B+T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM%2FTSP+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li>
<li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li>
<li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li>
<li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

aAPC peut être utilisée pour étudier les exigences de base pour l&#39;activation des cellules NKT et il a le potentiel de valeur clinique de l&#39;expansion ex vivo des cellules T NK pour l&#39;immunothérapie adoptive. Mescher et al. Décrit l&#39;un des systèmes à base de talon première, où biotinylé classe I du CMH murin-peptide seul assemblage de chaîne ont été combinées avec des molécules co-stimulatrices B7.1 et B7.2 biotinylés par la streptavidine à la surface de microsphères de latex 14, 15. Cette approche a été utilisée avec succès pour stimuler spécifiques de l&#39;antigène des cellules T provenant de souris transgéniques. En outre, étant donné que cette approche utilise une seule chaîne complexe CMH-peptide à assurer un chargement homogène des molécules du CMH, chaque antigène peptidique objectif, il faudrait une nouvelle transfection d&#39;expression de la chaîne désirée CMH-peptide complexe unique, ce qui limite la portée de ce approche. Surtout, le groupe du Dr Schneck pionnier de la perle base-aAPC, en développant un autre non-cellulaire aAPC perle base, Par couplage HLA-Ig, le signal 1, et anti-CD28, signal 2, sur des billes magnétiques. HLA-Ig, une forme unique multimérique de HLA fusionnée à une immunoglobuline échafaudage moléculaire 16, 17 a été élaboré par son groupe. Par la suite, ils ont développé MHC-Ig base aAPC, qui ont montré sa capacité à élargir le CMV et MART-1 CTL spécifiques 18. Ici, nous avons démontré que CD1d-Ig aAPC base peut être utilisée pour étendre fonctionnelles des cellules NKT. Une étude a utilisé un système similaire pour examiner l&#39;interaction physique avec des cellules NK CD1 19. Notamment, nous avons conçu une cellule présentatrice d&#39;antigène artificielle qui s&#39;adapte à toutes les exigences que nous trouvons nécessaire pour la prolifération des cellules NKT optimale. La méthode d&#39;expansion aAPC fournit une méthode simple et fiable pour élargir et d&#39;enrichir les cellules NKT. Notre aAPC peuvent être modifiés pour évaluer systématiquement le rôle d&#39;un panel de molécules de co-stimulation potentiels et d&#39;évaluer leur rôle dans la NKT prolifération cellulairetion et de la fonction. Ainsi, aAPC représentent une technologie robuste polyvalent utiles pour induire et l&#39;expansion des cellules NKT. La génération de VAMP prend moins d&#39;une semaine, et est adapté à la production de grandes quantités de perles. Cependant, une étape cruciale dans la génération de la aAPC est de confirmer que CD1d-Ig est stable immobilisé sur la surface des billes et d&#39;évaluer leur fonctionnalité pour assurer la cohérence de lot à lot. Une limite potentielle de ce système est qu&#39;il n&#39;y a pas de mécanisme en place pour éteindre la stimulation, autre que l&#39;enlèvement mécanique des billes. Plus précisément, l&#39;engagement du récepteur des cellules T (TCR) avec l&#39;antigène: complexe CD1d/MHC génèrent habituellement la synapse immunologique de concert avec accessoires / molécules d&#39;adhésion, ce qui peut entraîner l&#39;induction de facteurs inhibiteurs ou de suppression à la fois sur la cellule T et Cellule présentatrice d&#39;antigène. Dans le système aAPC, ces facteurs peuvent être régulée à la hausse par la cellule T, mais le talon ne serait pas exprimer les ligands apparentéspour ces récepteurs. En outre, les cellules NKT CD4 + ont été montré pour supprimer les réponses anti-tumorales chez la souris et chez l&#39;homme, il est donc possible que l&#39;activation non sélective de toutes les cellules NKT (c.-à-stimulation globale avec α-GalCer) ou l&#39;activation du sous-ensemble erronée pourrait entraîner immunologique indésirable résultats. Par conséquent, il faut phénotypiquement et fonctionnellement caractériser la population aAPC expansé cellules NKT. Comme le montre la figure 4, nous avons constaté que la stimulation avec α-GalCer chargé aAPC exprimant anti-CD28 peut entraîner cellules NKT produisent Th1, Th2, Th17 et des cytokines de type. Des études ont rapporté que les souris défi avec de l&#39;IL-33, une cytokine récemment identifiée, a entraîné une augmentation des niveaux de circulation cytokines inflammatoires telles que l&#39;IL-5 et IL-13. Le traitement des cellules NKT avec de l&#39;IL-33 amélioré leur production de cytokines 20. IL-33 est un ligand spécifique pour ST2 et il a été montré que ST2 soluble can blocs IL-33 de signalisation. Ainsi, à titre d&#39;exemple d&#39;une application future, ST2 aAPC exprimer pourraient être générés et utilisés pour déterminer si l&#39;on pouvait inhiber sélectivement la production de cytokines Th2, tout en induisant la sécrétion de cytokines Th1 par les cellules NKT. Il a également été rapporté que l&#39;injection intraveineuse de Ko exprimant aAPC en C57BL / 6 a entraîné dans les métastases du poumon a diminué de 21 tumeur. Fait important, ces données démontrent que le trafic aAPC dans les poumons et sont capables d&#39;activer des lymphocytes T effecteurs sous-ensembles. Par conséquent, on peut générer plusieurs types de aAPC et d&#39;examiner l&#39;interaction entre les sous-ensembles spécifiques de l&#39;antigène des cellules T. En résumé, ces études démontrent que CD1d-Ig aAPC base peut être utilisé pour remplacer normale APC cellulaire, et ont le potentiel d&#39;améliorer les approches actuelles cliniques de cellules NKT base-immunothérapie adoptive.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Sciences de la Vie </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human T Kit enrichissement de cellules </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanine CD161 humain mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris IgG1 Microbilles </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimère soluble recombinant XI souris CD1d dimère: protéine de fusion IG </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 monoclonal </td><td> BioLegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 perles époxy </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylcéramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Solution vitamine </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La ciprofloxacine </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380 à 288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> BioLegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> BioLegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti IgG1 de souris </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-IgG2a de souris </td><td> BioLegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, pas de calcium, de magnésium ne </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum Albumine Bovine </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum humain AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube Labquake </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 à 687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml en polystyrène à fond rond tubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Flacons en verre Wheaton exemples avec Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Petit (03-343-6A) Large (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (aapc) et l&#39;expansion des cellules t tueuses naturelles

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural Killer T (NKT), les cellules sont un sous-ensemble unique de cellules T qui affichent des marqueurs caractéristiques des deux tueuses naturelles (cellules NK) et les cellules T 1. Contrairement aux cellules T classiques, les cellules NKT reconnaissent l&#39;antigène lipide dans le contexte de molécules CD1 2. Les cellules NKT expriment un réarrangement de la chaîne invariante TCRα: Vα14Jα18 chez la souris et chez l&#39;homme Vα24Jα18, qui est associée avec des chaînes Vß de faible diversité 3-6, et sont appelés canoniques ou invariant NKT (i NKT) des cellules. Semblables à des cellules T conventionnelles, les cellules NKT se développer à partir CD4-CD8-thymiques des cellules T précurseurs à la suite de la signalisation appropriée par CD1d 7. La possibilité d&#39;utiliser des cellules NKT à des fins thérapeutiques a considérablement augmenté la capacité de stimuler et d&#39;accroître l&#39;homme cellules NKT avec α-galactosylcéramide (α-GalCer) et une variété de cytokines 8. Fait important, ces cellules ont conservé leur origine phenotype, des cytokines sécrétées, et affichée fonction cytotoxique contre des lignées cellulaires tumorales. Ainsi, ex vivo des cellules NKT étendues restent fonctionnels et peuvent être utilisés pour une immunothérapie adoptive. Cependant, à base de cellules NKT-immunothérapie a été limitée par l&#39;utilisation de cellules autologues présentant l&#39;antigène et de la quantité et de la qualité de ces cellules stimulatrices peuvent varier considérablement. DC dérivées de monocytes de patients atteints de cancer ont été signalés à exprimer des niveaux réduits de molécules de co-stimulation et produisent des cytokines inflammatoires moins 9,10. En fait, DC murines plutôt que d&#39;APC autologues ont été utilisés pour tester la fonction des cellules NKT de patients atteints de LMC 11. Cependant, ce système ne peut être utilisé pour des tests in vitro depuis les cellules NKT ne peut pas être étendu par murin DC, puis utilisés pour une immunothérapie adoptive. Ainsi, un système normalisé qui s&#39;appuie sur les cellules présentatrice d&#39;antigène artificielle (VAMP) pourrait produire des effets stimulants de DC en évitant les pièges d&#39;allo-ou xénogénique CElls 12, 13. Nous décrivons ici une méthode pour générer CD1d basée aAPC. Depuis l&#39;engagement du récepteur des cellules T (TCR) par CD1d complexes antigène-est une exigence fondamentale de l&#39;activation des cellules NKT, l&#39;antigène: CD1d-Ig complexes de fournir une méthode fiable d&#39;isoler, d&#39;activer et de développer des populations de cellules effectrices NKT.

Ici, nous décrivons une méthode pour générer CD1d-Ig base aAPC, faite par couplage covalent de CD1d-Ig et anti-CD28 mAb à des billes magnétiques pour stimuler les cellules NKT comme une méthode normalisée pour la propagation des cellules NKT (figure 1). Tout d&#39;abord, il faut démontrer que les protéines de fusion CD1d-Ig sont stablement immobilisé sur la surface des billes magnétiques. Comme le montre la Figure 2A, CD1d-Ig et d&#39;anticorps anti-CD28 ont été tous les deux exprimés à la surface des billes magnétiques. Pour examiner la capacité de stimulation de l&#39;AAPC, nous co-cultivées hybridomes de cellules NKT avec VAMP nuit, les surnageants de la culture récoltés et mesurés de production d&#39;IL-2 par ELISA. Nous avons constaté que CD1d-Ig base aAPC étaient capables de stimuler les cellules NKT hybridomes à des niveaux égaux ou supérieurs à leurs homologues cellulaires (figure 3, les données non présentées). Fait intéressant, nous avons constaté que nos cellules NKT hybridomes de souris sont stimulés par CD1d humaine basée sur aAPC (Figure 2B), qui fournit une méthode simple pour tester chaque lot de aAPC. Ensuite, nous avons cherché à démontrer le potentiel de propagation de aAPC, donc des cellules T ont été isolés à partir du sang périphérique. D&#39;abord le CD161 + CD3 + fraction des lymphocytes T a été enrichi par séparation bille magnétique. Ensuite, les cellules T ont été stimulés bimensuel avec α-GalCer chargé aAPC. Surtout, nous avons constaté que même avec une population relativement faible de cellules NKT initial (0,03%), nous avons été en mesure d&#39;étendre les cellules à environ 67% Vα24 + Vβ11 + (figure 3). Nous avons élargi les cellules NKT de l&#39;PBMC de nombreux volontaires sains et des patients atteints de cancer et ont constaté que les α-GalCer chargé aAPC ont pu développer des cellules NKT la population dans les deux groupes. Notamment, le taux d&#39;expansion a été très dépendante des bailleurs de fonds. Comme prévu, le plus élevé de la population initiale de cellules Vα24 +, plus le pourcentage d&#39;expansion. En outre,lors de l&#39;utilisation d&#39;une population de départ de 2 millions de cellules CD161 + cellules T CD3 +, on peut obtenir&gt; 10 7 cellules après deux tours de l&#39;expansion (tableau 1). Environ 80-90% des cellules NKT sont élargis CD4 +, ~ 5% CD8 +, et les autres sont sans doute CD4-CD8-doubles négatifs cellules NKT. Ces cellules NKT étendues peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles comme le montre la Figure 4A-C. Nous avons trouvé que notre expansion ex vivo des cellules NKT continuent de répondre aux α-GalCer stimulation et sont de puissants producteurs d&#39;IL-17A, le TNF-α, l&#39;IFN-γ et. Il est à noter que si la population initiale T cellule d&#39;enrichissement est faible et l&#39;on est incapable d&#39;effectuer la deuxième étape d&#39;enrichissement CD161, l&#39;expansion aAPC médiation peut ne pas donner les résultats escomptés (voir la figure 4D, Donateur 1). Toutefois, si le pourcentage de cellules NKT circulants est supérieure à 0,1%, il faut toujours être en mesure d&#39;obtenir une expansion significativedes cellules NKT i. Collectivement, ces données démontrent que CD1d base-aAPC peut être utilisé efficacement pour développer et stimuler les primaires des cellules NKT. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de CD1d: Ig à base de VAMP parties extracellulaires de la molécule CD1d sont fusionnés à la région constante d&#39;une chaîne lourde d&#39;immunoglobuline protéine séparés par un lieur acide aminé court. Ces molécules peuvent être facilement chargé avec des antigènes lipidiques, tels que α-GalCer, simplement en les incubant avec un excès de lipide d&#39;intérêt. aAPC ont été faites par couplage CD1d-Ig et anti-CD Abs à des billes magnétiques. Dans ce système, CD1d-Ig est utilisé pour fournir le spécifique d&#39;un antigène apparenté de signal à travers le TCR et anti-CD28 monoclonal fournit le signal de co-stimulation. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. . Coloration FACS des protéines de surface sur VAMP VAMP A) ont été testés pour la présence de CD1d: IgG dimère (par coloration avec PE-conjugué anti-IgG1 de souris) ainsi que anticorps anti-CD28 (en utilisant conjugué au FITC anti-souris IgG2a) histogrammes. ouverts indiquent contrôle isotypique; histogrammes pleins représentent les anticorps indiqués. CD1d-Ig Exprimant aAPC peut stimuler la production d&#39;IL-2 par les cellules NKT. B) Le Vα14 + souris NKT cellulaire d&#39;hybridome, DN32.D3, a été co-cultivées avec un milieu, d&#39;un antigène soluble (α-GalCer), déchargé aAPC ou α-GalCer chargé aAPC. Les surnageants de culture ont été récoltés et sandwich ELISA standard a été utilisé pour mesurer la production d&#39;IL-2. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figure 3. Expansion des cellules NKT par CD1d-Ig cellules couvertes d&#39;antigène artificielles présentant. (A) primaire CD3 + CD161 + cellules doublement positives ont été isolées à partir des PBMC en utilisant la séparation magnétique. Les cellules triées ont été stimulées avec α-GalCer chargé, CD1d-Ig aAPC couché pendant 14 jours. Les cellules ont été colorées pour Vα24 et Vβ11 stimulation aAPC suivante. (B) des cellules humaines primaires NKT lyse d&#39;une lignée de lymphome des cellules B. C1R-CD1d cellules incubées avec des cellules NKT dans les proportions indiquées, en présence ou en l&#39;absence d&#39;antigène, une GalCer-(100 ng / ml) en 96-puits à fond en U des plaques de 20-24 h. Cellules NKT la lyse cellulaire a été évaluée par la norme par 51Cr-release dosage. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figure 4. Profils de cytokine de cellules NKT-aAPC élargis. </strong&gt; Après stimulation avec α GalCer aAPC chargé pendant deux semaines, les cellules NKT élargies (1 × 10 5 / puits) ont été co-cultivées avec α-GalCer soluble, PMA / ionomycine, anti-CD3/28 microbilles, ou α-GalCer chargé aAPC (2 x 10 5 / puits) pendant 48 heures. (A) l&#39;IL-17A, (B) le TNF-α, et (C) l&#39;IFN-γ a été mesuré par production de cytokine ELISA standard. Les données présentées sont la production de cytokines net après déduction des contrôles négatifs (les médias et les perles vides). (D) les cellules T primaires ont été isolées à partir des PBMC en utilisant magnétique de séparation du talon. Les cellules triées ont été stimulées pendant deux semaines avec l&#39;indication a-GalCer chargé-aAPC. Les cellules ont été colorées en utilisant Abs spécifiques pour Vα24 + et + Vβ11 et analysées par cytométrie en flux.

Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;activation et l&#39;expansion des cellules NKT de gros populations de cellules T en utilisant des cellules présentant l&#39;antigène artificielles (VAMP). L&#39;utilisation de CD1d basée aAPC offre une méthode normalisée pour générer des nombres élevés de cellules NKT fonctionnelles.

Présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (AAPC) et l&#39;expansion des cellules T tueuses naturelles

Les cellules T natural killer (NKT) constituent un sous-ensemble unique de lymphocytes T qui présentent des marqueurs caractéristiques à la fois des cellules natural killer (NK) et des lymphocytes T1. Contrairement à...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules présentatrices d'antigènes artificielles CD1D, ou AAPC, pour l'expansion des cellules NKT. Cela est réalisé en ajoutant d'abord des protéines afin de fonctionnaliser les billes magnétiques. Dans la deuxième étape, la population initiale de cellules NKT provenant du sang périphérique est enrichie.Ensuite, les lymphocytes T enrichis sont mis en co-culture avec les A A PC. Dans la dernière étape, le phénotype et la fonction de la population cellulaire A A PC sont évalués. Enfin, la pureté des sous-populations de lymphocytes T amplifiés peut être déterminée par analyse cytométrique en flux. Le principal avantage des A APC par rapport aux méthodes actuelles utilisant des cellules dendritiques est qu’il peut exister une forte variabilité entre donneurs avec les cellules dendritiques.Les CPA fournissent une méthode reproductible, prête à l'emploi et standardisée pour l'expansion des cellules T NK. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque je travaillais avec le Dr Schneck et Oaky à l'université Johns Hopkins. Ils ont été des pionniers dans le domaine de l'utilisation de complexes artificiels de présentation de l'antigène pour l'expansion de sous-populations classiques de cellules T CD8.Le Dr James East, chercheur postdoctoral, et le fils du Dr Wendy, chercheur associé de mon laboratoire, vont démontrer la procédure. Commencez par transférer un millilitre de billes Dyna Bead M-270 epoxy dans un flacon transparent en verre borosilicaté fileté de cinq millilitres. Rincez ensuite les billes avec trois millilitres de tampon Bore 8 stérile dans un tube microcentrifuge séparé de 1,5 millilitre.Ajouter 100 microgrammes de dimère humain CD1D-Ig et 20 microgrammes des molécules co-stimulatrices souhaitées dans un millilitre de PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, placer le flacon en verre contenant les billes sur un aimant et aspirer le tampon borate. Puis ajouter le mélange protéique au flacon en verre et replacer le bouchon.Mélangez immédiatement la solution en retournant le flacon, puis recouvrez le bouchon de paraforme et placez-le sur un rotateur pendant toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Placez à nouveau le flacon en verre sur l'aimant et retirez délicatement le mélange protéique en évitant soigneusement les billes. Lavez les billes trois fois en ajoutant trois millilitres de tampon de lavage des billes et en les incubant sur le rotateur à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Pour confirmer que les protéines sont correctement fixées sur les billes, colorer un aliquot de billes avec des anticorps et les analyser par cytométrie en flux. Transférer maintenant cinq fois 10 à la puissance sept billes dans un petit flacon en verre de 1,5 millilitre et rincer les billes avec un millilitre de PBS stérile. Puis 48 à 72 heures avant utilisation.Chargez les billes lavées avec l'antigène dans un millilitre de PBS stérile pendant que les billes sont en cours de chargement avec l'antigène. Récupérez les PBMC en diluant d'abord le sang de donneur hépariné avec un volume égal de PBS à température ambiante. Ajoutez ensuite 15 millilitres de PHI à température ambiante, répartissez dans des tubes coniques de 50 millilitres, puis recouvrez lentement 25 millilitres du mélange sanguin dilué au-dessus du PHI.Appeler ensuite après avoir centrifugé les échantillons pendant 30 minutes à 700 × g et à température ambiante avec frein activé. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer soigneusement l'interface des lymphocytes dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, laver les lymphocytes avec 50 millilitres de PBS, jeter le surnageant et regrouper les tubes provenant d'un même donneur dans un seul tube.Après avoir lavé à nouveau les PBMC avec 20 millilitres de PBS, comptez les cellules, puis resuspendez-les à une concentration de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre dans du tampon max. Pour isoler la fraction de lymphocytes T, incubez 100 microlitres de solution d'enrichissement PAN pour lymphocytes T du kit d'enrichissement de lymphocytes T humains EP avec deux millilitres de PBMC pendant 10 minutes à température ambiante. Incubez ensuite la solution avec 100 microlitres de billes magnétiques pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante.Amener le volume final du solvant à 2,5 millilitres, puis placer le tube dans l'aimant. Après cinq minutes, verser rapidement la fraction CD3 positive dans un tube conique de 15 millilitres. Laver maintenant les cellules avec 5 millilitres de tampon Max froid et dénombrer les cellules viables.Prélevez un aliquot pour la coloration des facteurs afin de sélectionner d'abord les cellules positives pour le CD161. Resuspendez les lymphocytes T enrichis dans 980 microlitres de tampon Max glacé, puis incubez les cellules avec 10 microgrammes d'anticorps monoclonal anti-CD161 pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après lavage des cellules, reconstituez le culot dans 800 microlitres de tampon Max et 200 microlitres de microbilles anti-IgG US.Incubez cette solution à quatre degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Pendant que les cellules s'incubent avec les microbilles, ajoutez trois millilitres de tampon max pour équilibrer une colonne LS. Après avoir lavé cette fraction cellulaire, pipetez lentement les cellules dans trois millilitres de tampon max dans la colonne.Effectuez maintenant un rinçage de la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon max frais. Ajoutez ensuite trois millilitres supplémentaires de tampon max frais sur la colonne et transférez la colonne dans un tube conique de 15 millilitres. Éluerez les cellules CD161 positif CD3 positif purifiées, puis comptez la fraction enrichie en cellules NKT.Commencez cette étape par une co-culture de 10 puissance 6 cellules T enrichies CD161 positives CD3 positives et de 10 puissance 6 cellules A APC dans 16 millilitres de milieu complet par plaque. Répartissez 160 microlitres par puits de la co-culture dans une plaque en polystyrène traitée pour culture tissulaire, à fond rond et 96 puits, munie d'un couvercle à faible évaporation. Entre le jour 12 et 14, récoltez et comptez les cellules. Analysez les populations par cytométrie en flux, puis repiquez et reprenez la co-culture.Les cellules T NKT étendues comme indiqué ci-dessus congèlent les cellules T NKT supplémentaires après le deuxième cycle d'expansion. Pour tester la fonctionnalité des cellules APC A A, réalisez d'abord une co-culture de cinq fois 10 à la puissance quatre cellules T NKT par puits avec cinq fois 10 à la puissance cinq APC A A dans un volume final de 200 microlitres de milieu complet, dans une plaque à fond plat de 96 puits. Après 24 à 48 heures, récoltez le surnageant de la culture cellulaire pour analyse par Eliza. Ce premier graphique démontre que les protéines CD 1D IG sont solidement fixées à la surface des billes magnétiques, comme illustré ici.Les anticorps anti-CD1D IG et anti-CD28 sont tous deux exprimés à la surface des billes magnétiques, comme le montre ce graphique. L'hybridome de cellules T NK de souris V alpha 14 positif DN30.D2.3 a été mis en co-culture avec soit des CPA A.A. non chargées d'antigène alpha-galactosylcéramide soluble dans le milieu, soit des CPA A.A. chargées d'alpha-gal. Les surnageants de culture ont ensuite été récupérés et la production d'IL-2 a été mesurée par ELISA, offrant ainsi une méthode simple pour tester chaque lot de cellules présentatrices d'antigène. Dans cette expérience, les cellules T du sang périphérique humaines CD161 positives et CD3 positives ont été enrichies par séparation à l'aide de billes magnétiques.Les cellules ont ensuite été stimulées une fois par semaine pendant 14 jours avec des CPA chargées en alpha-galéra A A et analysées pour l'expression de V alpha 24 et de V beta 11. Il est important de noter qu'avec une population initiale relativement faible de cellules NKT de 0,03 %, les cellules ont pu être amplifiées jusqu'à atteindre environ 67 % de la population double positive V alpha 24 et V beta 11. Ici, les cellules C un R CD 1D ont été incubées avec les cellules NKT selon les rapports indiqués en présence ou en absence de l'antigène Alpha Gal SER, dans des plaques de 96 puits en forme de U, pendant 20 à 24 heures.La lyse cellulaire médiée par les cellules NKT de la lignée de lymphome B a ensuite été évaluée par un test de libération de chrome. Des cellules NKT amplifiées par APC ont pu lyser cette lignée de cellules lymphomateuses. En présence ou en absence d'alpha-galactosylcéramide, les cellules NKT ont été amplifiées à partir des PBMC de donneurs sains et de patients atteints de cancer, et chargées avec l'alpha-galactosylcéramide.Une PC a permis d'élargir les populations de cellules NKT à partir des deux groupes. En partant d'une population initiale de 2 millions de cellules T positives pour CD161 et positives pour CD3, plus de 10⁷ cellules peuvent être obtenues après deux cycles d'expansion. Les cellules NKT peuvent être utilisées pour des études fonctionnelles, comme le montre ici.Les cellules NKT étendues ex vivo restent sensibles à la stimulation par l'Alpha GAL et sont de puissants producteurs de l'IL-17A, du TNF alpha et de l'interféron gamma. Il convient de noter que si la population initiale enrichie en lymphocytes T est faible et que la deuxième étape d'enrichissement en CD161 ne peut être réalisée, l'expansion médiée par les CPAA pourrait ne pas donner les résultats attendus. Toutefois, si le pourcentage de cellules NKT circulantes est supérieur à 0,1 %, une expansion significative des cellules NKT invariantes devrait néanmoins pouvoir être obtenue.Collectivement, ces données démontrent que l'APC à base de CD1D peut être utilisée pour amplifier et stimuler efficacement les lymphocytes T NK humains primaires selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que la PCR quantitative, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple quelle est la cinétique de l'activation des lymphocytes T NK après leur développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hépatologie pour explorer le rôle des cellules T NK dans les maladies du foie gras.

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cellules T tueuses naturelles (NKT) sont des déterminants essentiels de la réponse immunitaire au cancer, la réglementation des autioimmunity, la clairance de l'infection, et le développement des plaques artheriosclerotic. Dans cette interview, Mitch Kronenberg examine les efforts de son laboratoire pour comprendre le mécanisme par lequel les cellules NKT sont activées par des antigènes glycolipides.

Interview: présentation des antigènes glycolipides par CD1d et le potentiel thérapeutique de l&#39;activation des cellules NKT

Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d'évaluer leur fonction.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Une méthode nouvelle DC indépendante pour l'induction et l'expansion des cellules T spécifiques d'antigènes est décrite. HLA A2-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation (AAPC) sont chargés avec des peptides HLA-A2 restreint efficacement l'expansion des CTL spécificité antigénique divers. Cette technologie offre un grand potentiel pour CTL à base d'immunothérapie adoptive.

HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d&#39;Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

Cette vidéo décrit un protocole permettant d’isoler des lymphocytes T CD8+ spécifiques à des antigènes rares à l’aide de cellules présentatrices d’antigènes artificielles (aAPCs) à base de nanoparticules magnétiques fonctionnalisées avec des Ig-CMH chargées de peptides antigéniques et des anticorps anti-CD28. L’interaction des aAPCs avec les lymphocytes T CD8+ exprimant spécifiquement les récepteurs des lymphocytes T ciblant les peptides antigéniques, suivie de leur expansion in vitro, entraîne...

Enrichissement et expansion à base de nanoparticules de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène

Lymphocytes T exprimant un récepteur CD19 chimérique antigène spécifique (RCA) sont infusés comme traitement expérimental des cellules B malignes dans nos first-in-humains essais de thérapie génique. Nous décrivons la modification génétique des cellules T en utilisant...

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

Lignes directrices sont présentées pour la production de l'antigène artificiel de tueur des cellules présentatrices, KaAPC, un outil efficace pour la déplétion in vitro de lymphocytes T spécifiques de l'antigène humain et une solution alternative à l'immunothérapie cellulaire pour le traitement de T maladies auto-immunes à médiation cellulaire à un antigène de façon spécifique sans compromettre le système immunitaire reste.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d'utilisation efficace In Vitro L'épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l'antigène

Nous présentons ici un protocole pour générer rapidement et de façon reproductible des inspirée, biodégradable articifical cellules présentatrices (VAMP) avec taille ajustable, forme et présentation de la protéine de surface des lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo .

Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 +

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.

Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Ici, nous présentons une méthode pour développer le tueur naturel du sang périphérique (PBNK), les cellules NK des tissus hépatiques et les cellules du récepteur antigénique chimérique (CAR)-NK dérivées de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ou du sang de cordon (CB). Ce protocole démontre l’expansion des cellules NK et CAR-NK à l’aide de cellules nourricières 221-mIL-21 en plus de la pureté optimisée des cellules NK expansées.

TUEUR NATUREL (NK) ET PROCÉDÉ D’EXPANSION CELLULAIRE CAR-NK UTILISANT UNE LIGNÉE CELLULAIRE B MODIFIÉE PAR UNE LIGNÉE CELLULAIRE B LIÉE À LA MEMBRANE

Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

Progrès dans les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines induites

Découvrez l'expansion des cellules NKT à partir de sang périphérique humain en utilisant des cellules présentatrices d'antigène artificielles basées sur CD1d. Cette méthode standardisée offre une approche reproductible pour la recherche en immunothérapie.

Présentatrice d'antigène artificielle d'activation à médiation cellulaire (AAPC) et l'expansion des cellules T tueuses naturelles

Explorer plus de vidéos