Appétitive apprentissage olfactif associatif en Drosophila Les larves

L'objectif de cette procédure est d'analyser les fonctions cérébrales supérieures. Dans un modèle simple, la larve DFA est étudiée par le biais de l'appétit et de l'apprentissage olfactif associatif. Ceci est réalisé en commençant par récolter 30 larves en troisième stade larvaire en phase d'alimentation à partir d'un flacon de nourriture.

Ensuite, les larves sont entraînées pendant cinq minutes dans une boîte de Pétri avec du fructose comme récompense et un récipient à odeur de chaque côté contenant de l'octanol comme stimulus olfactif. Puis, une deuxième phase d'entraînement de cinq minutes est réalisée sur une boîte sans récompense de fructose et avec des récipients à odeur de chaque côté contenant de l'acétate d'amyle. Après trois répétitions des deux phases d'entraînement, les larves sont exposées à des récipients à odeur placés de part et d'autre pendant un test de cinq minutes sans récompense.

En fin de compte, la préférence olfactive relative d'un octal par rapport à l'acétate d'Amal indique que les larves de drosophile peuvent établir une association entre des stimuli olfactifs et une récompense sucrée, et cela peut être utilisé pour étudier l'apprentissage associatif dans un système génétiquement modulable. Cette méthode, combinée à une interférence génétique de la fonction neuronale, peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de l'apprentissage et de la mémoire, telles que : quels sont les neurones qui signalent la récompense, ou quels sont les neurones nécessaires ou suffisants pour l'acquisition ou la récupération d'une mémoire répétitive ? La procédure sera démontrée par anti un postop.

Un étudiant au doctorat de mon laboratoire commence par préparer des boîtes de Petri à 2,5 % d'aros sans fructose. Pour préparer les boîtes contenant du fructose, ajouter le fructose aux aros dissous, puis verser le mélange dans la boîte. Ensuite, étiqueter chacune de ces boîtes avec un symbole différent afin de rendre l'expérimentateur aveugle au traitement.

Le plat contenant le fructose constitue la récompense conditionnante, et le plat ordinaire constitue l'absence de récompense. Pour les stimuli conditionnés, préparez au total trois récipients d'odeur en téflon personnalisés avec 10 microlitres d'octanol pur. Les couvercles possèdent de petits trous permettant l'évaporation de l'odeur.

Deuxièmement, préparez trois autres récipients à odeur contenant 10 microlitres d'acétate d'amyle dilué au 1/50 dans de l'huile de paraffine. Cette dilution est aussi attractive que les 10 microlitres d'octanal pur ; commencez par rassembler 30 mouches, en les nourrissant, sans qu'elles errent. Troisièmement, préléez-les à partir d'un flacon de nourriture.

Ce protocole peut être réalisé à tout moment de la journée. Il est indépendant des rythmes circadiens. Transférez la lave dans une boîte de Pétri contenant quelques gouttes d'eau du robinet et déplacez-la doucement en avant et en arrière à l'aide d'un pinceau.

Transférez ensuite la lave dans une deuxième boîte de Pétri qui contient également quelques gouttes d’eau du robinet. Examinez les larves pour détecter la présence de pâte alimentaire sur leurs parois corporelles. Placez maintenant la boîte de Pétri dans le dispositif expérimental afin d’entraîner les larves à associer des odeurs à une source spécifique de sucre.

Placer un récipient à odeur sur le côté gauche et sur le côté droit de l'un des deux types de boîte utilisés pour les stimuli. Voici un exemple avec un récipient octogonal, mais le choix est arbitraire puisque l'expérimentateur est aveugle quant à la récompense. Ensuite, déposer le groupe de larves de thi au centre de la boîte.

Fermez le couvercle et attendez cinq minutes pendant que les animaux sont exposés aux stimuli. Assurez-vous que les larves peuvent surmonter la tension superficielle de la goutte d'eau afin qu'elles ne soient pas piégées et puissent explorer librement. Placez un nouveau récipient contenant de l'acétate d'Amal sur une boîte de Pétri propre.

Après cinq minutes, utilisez un pinceau humide pour transférer les larves vers le type de boîte opposé, avec les stimuli opposés situés sur ses côtés gauche et droit. Ici, l'odeur est l'acétate d'amyle. Une fois les larves transférées, fermez le couvercle et laissez les animaux explorer pendant cinq minutes.

Lorsque ce délai est écoulé, le premier cycle d'entraînement est terminé. Effectuez deux cycles supplémentaires d'entraînement de la même manière que le premier. Transférez les animaux à l’aide d’un pinceau humide et exposez-les à chaque combinaison de stimulus et de récompense, trois fois au total.

Pour le lieu du test expérimental, placez des récipients frais contenant l'odeur, un pour chaque stimulus, sur des côtés opposés d'une boîte de Pétri en agrose non revêtue. Transférez les animaux entraînés au centre de la boîte. Fermez le couvercle et attendez cinq minutes.

Après cinq minutes, utilisez un gabarit placé sous la boîte qui définit clairement trois zones : gauche, droite et centrale ; comptez le nombre de larves dans chaque zone. La zone centrale correspond à un score de non-préférence et rend l'analyse plus restrictive et moins sujette aux biais. Enfin, pour terminer l'expérience, sélectionnez 30 nouvelles larves en troisième stade larvaire et répétez l'entraînement et le test avec la combinaison opposée de récompense et de stimuli.

Continuer à utiliser les mêmes récipients à odeur. Plusieurs tests contrôles sont nécessaires pour déterminer si les animaux transgéniques présentent un traitement normal des odorants pour les stimuli récompense. Le test de préférence olfactive naïve commence par la collecte et le lavage de 30 larves, comme effectué pour l'entraînement et le test.

Ensuite, déposez les larves sur une boîte de Pétri Agro Rose contenant un seul flacon de stimulus d'un côté. Fermez le couvercle et attendez cinq minutes. Ensuite, à l'aide du gabarit, comptez le nombre de larves du côté proche, au milieu et du côté éloigné de la boîte par rapport au stimulus.

Réalisez ce test pour chaque stimulus utilisé dans l'expérience afin d'évaluer la préférence naïve pour le sucre. Préparez des boîtes de Pétri coupées en deux en retirant la moitié de l'agar d'une boîte ronde et en remplissant l'espace vide avec de l'agar fondu de l'autre type. Veillez attentivement à ce que les deux moitiés aient le même volume et ne forment pas de bordure bien définie.

Cela peut nécessiter de la pratique avec la demi-pétri préparée et à température ambiante, placée 30 minutes, nettoyée après l'alimentation. Placer un troisième stade larvaire au centre de la boîte. Fermer le couvercle et attendre cinq minutes.

Ensuite, à l'aide du modèle, compter le nombre de larves de chaque côté et celles situées au centre. La procédure décrite a été utilisée pour entraîner et tester la lave trenchgénique. À l'aide des stimuli exemples, les données ont été compilées en fonction du nombre de larves présentes dans différentes régions des boîtes de Pétri.

Après cinq minutes hors de cette préférence de données, les indices ont été calculés et les indices de performance ont été dérivés des groupes entraînés de manière réciproque. Étant donné que les larves testées étaient transgéniques, un choix entre un récipient odorant rempli et de l'air a également été proposé, ainsi qu'un choix entre des arômes purs et des arômes additionnés de sucre. Un examen des indices calculés dans un diagramme en boîte a révélé que les animaux étaient capables d'apprendre à distinguer un octanol de l'acétate de méthyle en utilisant des arômes au fructose comme renforçateur appétitif.

Les animaux ont reconnu les deux stimuli comme attractants et ont montré une préférence innée pour les arômes de fructose par rapport à l'aéro. Ce paradigme expérimental a été utilisé avec succès avec une grande variété de stimuli olfactifs et visuels, ainsi qu'avec de nombreux stimuli récompensants et aversifs. Ce paradigme, combiné aux nombreuses manipulations génétiques puissantes disponibles chez Drosophila, est particulièrement utile pour analyser les réseaux neuronaux ; par exemple, en modifiant génétiquement des ensembles spécifiques de neurones définis par des patrons d'expression de Gal4, on peut évaluer les rôles fonctionnels de ces neurones dans l'apprentissage de l'appétit.

En suivant cette procédure, associée à une interférence génétique de la fonction neuronale, on peut analyser les réseaux neuronaux du cerveau larvaire impliqués dans l'apprentissage et la mémoire. En raison de la simplicité du cerveau larvaire, cela peut être réalisé jusqu'au niveau de la cellule unique.