Name: La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec lérythromycine complexe de lantibiotique A produite par E. coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Découvrez la biosynthèse hétérologue de l'érythromycine A dans E. coli. Cette méthode permet de transférer et d'exprimer le cluster génique biosynthétique pour produire cet antibiotique en grandes quantités et tester son activité.

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Les auteurs remercient le NIH (AI074224 et GM085323) et la NSF (0.712.019 0.924.699 et) de financement pour soutenir des projets dédiés à la biosynthèse hétérologue.

Le texte ci-dessous est spécifique de l&#39;antibiotique érythromycine A, mais les étapes sont généralement conçus pour être applicable à d&#39;autres produits naturels comme candidats pour la biosynthèse hétérologue. 1. Érythromycine A Transfert génétique Cluster <ol><li> Conception des amorces de PCR pour amplifier l&#39;ensemble des gènes associés à l&#39;érythromycine Un cluster dans le S. chromosome erythraea. Cette étape est spécifique à ces produits candidats naturels dont le patrimoine génétique des séquences ont été déterminées. Alternativement, les gènes nécessaires peuvent être synthétisés (par le biais de plusieurs options de fournisseur commercial) avec l&#39;avantage que les gènes nouvellement synthétisées seraient conçues pour une utilisation optimale dans le codon E. nouvelle coli hôte. Si la synthèse d&#39;ADN est poursuivi, un défi actuel est la génération gènes megasynthase qui peuvent dépasser 10 kb de longueur. Techniquement, la synthèse peut être accompli, mais il est difficile et coûteux. Il est prévu que improvem continueents dans la technologie de synthèse de gène abordera inconvénients actuels et valider davantage cette approche pour fournir du matériel génétique hétérologue. </li><li> Effectuer PCR en utilisant fraîchement préparée S. erythraea ADN génomique comme matrice. L&#39;ADN chromosomique peut être préparé à partir de cultures de S. erythraea ou de stocks congelés de la bactérie (figure 3) 25. Les réactions de PCR peuvent bénéficier de l&#39;ajout de DMSO (4 pi sur 50 pi de réactions) pour tenir compte de haute teneur en G+ C dans la cible S. gènes erythraea. Chaque gène amplifié doivent être séquencés pour confirmer que le gène complet a été récupéré et qu&#39;aucune mutation ont été introduites au cours du processus PCR. </li><li> Grâce digestion de restriction et de ligature, insérez chacune des gènes isolés dans des vecteurs d&#39;expression conçus pour E. coli (figure 3). Ce processus est amorcé par la conception de sites de restriction dans les amorces de PCR afin de permettre la digestion et ligation dans l&#39;ex appropriévecteurs Pression (un exemple a été inclus dans la figure 3). Nous avons utilisé à la fois pET21 et pET28 vecteurs. Le vecteur pET28 permet l&#39;inclusion d&#39;une séquence leader 5 &#39;qui a facilité l&#39;expression des gènes dans le cas érythromycine A. Confirmer l&#39;expression des gènes individuels par le biais de RT-PCR, analyse SDS-PAGE (avec fractions protéiques solubles) ou pratiques tests phénotypiques (figure 4). </li><li> Construire opérons sur la base de gènes exprimés avec succès à partir des plasmides d&#39;expression individuels (Figure 3). Nous avons toujours utilisé des combinaisons d&#39;enzymes de restriction compatibles cohésifs (comme Xba I et Spe I) 24 à convertir séquentiellement gènes des opérons, mais les sites de restriction choisis pour la construction opéron ne doit pas résider dans (ou doit être retiré de) l&#39;isolement séquences de gènes (un problème qui peut être évité si la synthèse de gène est utilisé). Cette étape renforce l&#39;érythromycine, 20 A gènes avant E. coli transformation. Actuellement, nous avons utilisé cette méthode pour inclure jusqu&#39;à 20 kb d&#39;ADN étranger dans un vecteur pET standard (deux gènes de ~ 10 ko chacune). En outre, nous avons utilisé cette approche pour générer opérons contenant neuf gènes. On ne sait pas exactement combien d&#39;ADN ou combien de gènes peuvent être intégrés dans pET plasmides de type, mais les mesures citées ci-dessus fournissent une référence pour les systèmes complexes comme la voie de biosynthèse érythromycine. Enfin, la norme aux étapes de ligature in vitro et des étapes ultérieures de transformation réussie de plus en plus difficile, car opéron et augmentation de la taille du plasmide. Température de ligature (12-22 ° C) et le temps (3-24 h) sont variés et électro-transformation est utilisé pour aider le processus de production finales constructions plasmidiques. </li><li> Transformer les plasmides biosynthétiques nouvellement conçus dans E. coli souche BAP1 utilisant l&#39;électro-transformation (figure 5). La procédure peut être tentée avec des plasmides introduits de façon séquentielle ou en collaborationmbination. Lors de la transformation de taille mesure ou de nombreux plasmides, nous avons utilisé traditionnellement électro-transformation (par opposition à la transformation chimique). Une fois transformé, plaque les cellules sur milieu solide LB contenant de la tetracycline (5 mg / l), la carbénicilline (100 mg / l), à la kanamycine (50 mg / l), la streptomycine (50 mg / l), et apramycine (50 mg / l ) pour sélectionner une opération de maintenance plasmide. Il est très inhabituel pour utiliser six choix différent des antibiotiques après la transformation d&#39;un E. cellule coli, mais cela reflète simplement le nombre total de plasmides nécessaires pour permettre à l&#39;érythromycine finale A biosynthèse. Bien que possible, l&#39;approche va limiter les capacités de production du composé fois la culture a commencé (s&#39;il vous plaît voir ci-dessous). </li></ol> 2. E. Reconstitution biosynthétique coli <ol><li> BAP1 souche a été conçu pour fournir les substrats nécessaires pour la biosynthèse et de post-traductionnelle modifier le megasynthase B désoxyérythronolide. Les gènes individuels du erythromycin Une voie ont été testés pour l&#39;expression des gènes et consolidée à compter opérons dans des plasmides d&#39;expression. Cette section est consacrée aux conditions de culture pour tester l&#39;activité concertée de l&#39;érythromycine A pleine voie. </li><li> Prendre 3 colonies séparées de la BAP1 fraîchement transformé et inoculer 1,5 ml des cultures LB contenant les antibiotiques nécessaires sélection plasmidiques (aux mêmes concentrations indiquées ci-dessus pour sélectionner les transformants sur milieu solide), isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 100 uM ) et de l&#39;arabinose (2 mg / ml) pour induire l&#39;expression des gènes, et le propionate de sodium 20 mM à soutenir la formation intracellulaire précurseur biosynthétique. Une fois que la production a été confirmée, les grandes cultures peuvent être menées dans le but d&#39;intensifier et d&#39;optimiser titres pour ce produit. </li><li> Culture des cellules à 22 ° C et 250 rpm pendant 24-48 heures. Dans ce cas, le choix des antibiotiques en sorte que les plasmides requis sont maintenus dans les premiers stades de la culture cellulaire. Cependant, un plasmides peut être facilement perdu dans des niveaux de sélection antibiotique changer au cours de la période de culture. Cela peut conduire à une instabilité plasmidique (c.-à-la perte d&#39;un ou plusieurs plasmides lors de la culture), qui serait alors de limiter la capacité de production. Le problème est exacerbé lorsque les plasmides incompatibles sont utilisés pour mettre en place un groupe de gènes hétérologues complète. Tel est le cas pour l&#39;érythromycine A composé (Figure 5) et devrait être remédié à surproduire vraiment le composé de E. coli. Cependant, dans le but de démontrer la production initiale, ces défauts de conception sont tolérés pour des raisons de célérité établir la faisabilité de l&#39;approche hétérologue. </li><li> Clarifier les cultures par centrifugation à 10000 rpm dans une centrifugeuse Eppendorf. Enlever le surnageant et conserver à 4 ° C pour analyse. </li><li> Dans le cas de l&#39;érythromycine A, le manque de production composé a été adressée par l&#39;inclusion de la chaperonine GroES / EL (en utilisant pGro7spécifiquement pour traiter le manque d&#39;activité des enzymes de la post-expression) et l&#39;inclusion de copies de gènes supplémentaires (pour les gènes soupçonnés de faible expression / activité). Des stratégies similaires peuvent être nécessaires avec d&#39;autres hétérologues naturelles efforts de production des produits. </li></ol> 3. Analyse du produit <ol><li> Pour confirmer et de quantifier l&#39;érythromycine A la formation, injecter le surnageant de culture sur un système LC-MS (Figure 6). Érythromycine A disponible dans le commerce a été utilisée pour confirmer la production et en tant que norme lors de la quantification. Pour les cas sans normes disponibles dans le commerce, analyse LC-MS exigerait une caractérisation chimique supplémentaire par RMN et spectrométrie de masse haute résolution. </li><li> Comparer production entre les 3 colonies / cultures de la transformation BAP1. Choisissez le plus grand producteur et préparer un stock de glycérol à partir de la source de la colonie. Cette étape peut être effectuée en parallèle avec les cultures de production de la section Protocole2 à l&#39;aide d&#39;une petite partie des cultures de préparer des stocks de glycérol. Stocker le stock de glycérol dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Utilisation de la confirmation, le plus élevé des cellules productrices, commencer une culture de production séparée et extraire le surnageant final avec 2x volume d&#39;acétate d&#39;éthyle. Utilisez un système de vide par évaporation pour sécher l&#39;extrait et remettre en suspension dans 100 ul de méthanol. Transférer l&#39;extrait vers un disque de filtre stérile (diamètre ~ 1/4 pouce) et le disque de permettre de sécher. Par ailleurs, la culture B. subtillis à l&#39;état liquide LB pendant la nuit. Ajouter 20 ul de la B. subtilis culture de 20 ml de gélose LB liquide à 45 ° C. Plaque de l&#39;agar-agar et laisser se solidifier. Placez le disque filtre sur la plaque et incuber à 37 ° C (figure 7). En variante, l&#39;extrait peut être ajoutée à des cultures liquides dans une plaque 96-puits pour quantifier l&#39;activité en utilisant un lecteur de plaque (Figure 7). </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes critiques dans la biosynthèse hétérologue sont rencontrés à chacun des trois points de procédure dans le processus: 1) de transfert génétique, analyse des produits et 3), 2) la reconstitution de biosynthèse. Un problème à n&#39;importe quelle étape fera dérailler l&#39;objectif ultime d&#39;établir la biosynthèse hétérologue. Peut-être l&#39;aspect le plus difficile du processus est d&#39;établir la biosynthèse reconstitué, car cela est absolument nécessaire pour permettre une analyse réussie. Toutefois, la r...

L&#39;érythromycine est un antibiotique A polykétide produite par le Gram positif bactérie du sol Saccharopolyspora erythraea et la production actuelle a été progressivement améliorée à ~ 10 g / L pendant des décennies de mutagenèse traditionnelle et protocoles de dépistage et, plus récemment, grâce à des programmes d&#39;optimisation des processus 1-6. Stratégies de mutagenèse et de criblage sont courantes dans le développement de produits antibiotique naturel en raison des difficultés de culture et / ou manipuler génétiquement hôtes de production indigènes et en raison de l&#39;activité antibiotique ou facilement disponibles phénotypes de croissance améliorées pour faciliter la sélection. Dans le cas de l&#39;érythromycine A, S. erythraea est limitée par un profil de croissance lente et l&#39;absence de plus directs techniques de manipulation génétique (par rapport à des organismes comme E. coli), donc, ce qui entrave l&#39;amélioration rapide de la production et de la biosynthèse de nouveaux produits dérivés. Ayant reconnu les problèmes de production et déverrouillé diversificatisur les possibilités avec des composés tels que l&#39;érythromycine A, la communauté scientifique a commencé à poursuivre l&#39;idée de la biosynthèse hétérologue (Figure 1) 7. Ces efforts ont coïncidé avec des informations de séquence disponible pour l&#39;érythromycine Un cluster 8-11 gène. Il convient de souligner que le nombre de séquences complexes naturels groupes de gènes de produits s&#39;est considérablement élargie 12-16, fournissant l&#39;impulsion de poursuivre les efforts dans la biosynthèse hétérologue d&#39;accès codé potentiel médicinal. Pour ce faire, la reconstitution hétérologue exige que le nouvel hôte de répondre aux besoins de la voie de biosynthèse spécifique. E. coli offre une commodité technique, un ensemble large couvrant des techniques de biologie moléculaire, et des stratégies d&#39;ingénierie métabolique et le processus de développement de produits. Pourtant, lorsqu&#39;on les compare à des hôtes de production indigènes, E. coli ne présentent pas le même niveau de production produit complexe naturel. Il était donc ignore si E. coli pourrait servir comme une option viable pour la biosynthèse hétérologue produit naturel complexe. Cependant, il a été supposé que E. coli serait un organisme hôte idéal si biosynthèse hétérologue pourrait être accompli. Avec cet objectif à l&#39;esprit, les efforts initiaux ont commencé à produire de l&#39;aglycone polycétide 6-désoxyérythronolide B (6dEB) à E. coli. Cependant, natif E. coli métabolisme n&#39;a pas pu fournir des niveaux appréciables de la propionyl-CoA et de (2S)-méthylmalonyl-CoA précurseurs nécessaires pour soutenir la biosynthèse 6dEB ne pouvait le nouvel hôte post-traductionnelle modifier la synthase B désoxyérythronolide (DEBS) enzymes. Pour remédier à ces problèmes, une voie métabolique composé d&#39;enzymes natives et hétérologues a été construite dans E. coli telles que le propionate de manière exogène a été alimenté à une transformation intracellulaire propionyl-CoA et l&#39;acide (2S)-méthylmalonyl-CoA, au cours de l&#39;ingénierie pour effectuer cette voie, un gène sfp a été placé dans the chromosome de E. coli BL21 (DE3) pour produire une nouvelle souche appelée BAP1. L&#39;enzyme est une Sfp capable phosphopantéthéinyle transférase de fixation du cofacteur 4&#39;-phosphopantéthéine aux enzymes DEBS 17,18. Les trois gènes DEBS (chaque ~ 10 kb) ont ensuite été placés sur deux vecteurs d&#39;expression contenant sélectionnables séparément promoteurs inductibles T7. Après un ajustement de la clé après l&#39;induction de la température (de 22 ° C), les gènes DEBS été coordonnée au sein BAP1 exprimé dans un état ​​actif capable de générer 6dEB 19. La poursuite de l&#39;érythromycine A la biosynthèse complète puis a commencé à utiliser un cluster de gènes analogues de Micromonospora megalomicea ou une voie hybride composé de gènes de S. erythraea, S. fradiae et S. venezuelae qui a produit l&#39;érythromycine intermédiaires C et 6-désoxyérythromycine D, respectivement 20-22. Récemment, notre groupe a étendu ces efforts en produisant erythromycin A (la forme la plus cliniquement pertinente de l&#39;érythromycine) à E. coli. Contrairement aux travaux antérieurs, notre stratégie coordonnée exprimé le S. 20 d&#39;origine gènes erythraea nécessaire pour la biosynthèse des polykétides, deoxysugar biosynthèse et de fixation, couture supplémentaire, et l&#39;auto-résistance (figure 2). Au total, 26 (natif et hétérologues) gènes ont été conçus pour permettre E. coli pour produire de l&#39;érythromycine A à 4 mg / L 23,24. Ce résultat place la production complète d&#39;un produit complexe naturel polycétide utilisant E. coli et sert de base pour tirer parti de cette possibilité nouvelle production ou de poursuivre de nouvelles.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Machine à PCR </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personnelle </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Pêcheur </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporateur </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Pêcheur </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Propionate de sodium </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinose </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Agitateur réfrigéré </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Micro centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> Centrifugeuse 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Set escorte plasmide (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, PCDF Duo-1 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Acétate d&#39;éthyle </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Méthanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse à vide </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrateur 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Évaporateur rotatif </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

la logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique a produite par<em&gt; e. coli</em

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

La production hétérologue de produits naturels complexes est une approche visant à remédier aux limitations actuelles et les possibilités futures. Il est particulièrement utile pour les composés qui possèdent une valeur thérapeutique, mais peut-être pas suffisamment produites ou bénéficieraient d&#39;une forme améliorée de la production. Les procédures expérimentales impliquées peuvent être subdivisés en trois volets: 1) le transfert génétique; 2) la reconstitution hétérologue, et 3) l&#39;analyse du produit. Chaque composante expérimentale est en cours d&#39;optimisation continue pour relever les défis et anticiper les opportunités liées à cette nouvelle approche. Biosynthèse hétérologue commence par l&#39;identification d&#39;une séquence génétique responsable d&#39;un produit naturel précieux. Le transfert de cette séquence à un hôte hétérologue est compliquée par la complexité voie de biosynthèse responsable de la formation du produit. L&#39;antibiotique érythromycine A est un bon exemple. Vingt gènes (un total de&gt; 50 kb) sont nécessaires pour la biosynthèse éventuelle. En outre, trois de ces gènes codent megasynthases, multi-domaines enzymes chacun 300 ~ kDa dans la taille. Ce matériel génétique doit être conçu et transféré à E. coli pour la biosynthèse reconstitué. Le recours à l&#39;isolement PCR, la construction opéron, multi-cystronic plasmides et électro-transformation sera décrite dans le transfert de l&#39;érythromycine Un cluster génétique de E. coli. Une fois transféré, l&#39;E. coli cellule doit prendre en charge la biosynthèse éventuelle. Ce processus est également difficile étant donné les différences substantielles entre E. coli et la plupart des hôtes d&#39;origine responsables de la formation produit naturel complexe. La cellule doit fournir des substrats nécessaires pour soutenir la biosynthèse et coordonnée exprimer le cluster génétique transféré à produire des enzymes actives. Dans le cas de l&#39;érythromycine A, la E. coli cellule a dû être conçu pour fournir les deux précurseurs (RPopionyl-CoA et l&#39;acide (2S)-méthylmalonyl-CoA) nécessaire à la biosynthèse. En outre, des modifications de séquences de gènes, le nombre de copies du plasmide, chaperonine co-expression, de modification post-traductionnelle enzymatique, et la température de processus ont également été nécessaire pour permettre à l&#39;érythromycine finale A de formation. Enfin, la production doit être évaluée avec succès. Pour l&#39;érythromycine A cas, nous présentons deux méthodes. La première est la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) pour confirmer et quantifier la production. La bioactivité de l&#39;érythromycine A seront également confirmés par l&#39;utilisation d&#39;un test biologique dans lequel l&#39;activité antibiotique est testé contre Bacillus subtilis. Les tests d&#39;évaluation établissent la biosynthèse de l&#39;érythromycine A partir de E. coli et préparer le terrain pour les futurs efforts d&#39;ingénierie pour améliorer ou diversifier la production et à la production de nouveaux composés naturels complexes en utilisant cette approche.

Le résultat attendu de cette approche est la production d&#39;un produit entièrement naturel bioactif de l&#39;E. coli hétérologues hôte. Ceci est mieux représenté par les résultats de LC-MS utilisé pour confirmer et quantifier la production (figure 6) et le bio-essai antibactérien utilisé pour confirmer l&#39;activité finale (figure 7). Dans le régime général de la biosynthèse hétérologue, ce résultat définit le succès. Une fois accompli, les efforts de recherche alors se tour...

La biosynthèse hétérologue de l&#39;érythromycine A travers<em&gt; E. coli</em&gt; Comprend les étapes suivantes: 1) expérimentales de transfert génétique, 2) la reconstitution hétérologue, et l&#39;analyse du produit 3). Chaque étape sera expliquée dans le contexte de la motivation, le potentiel et les défis dans la production de produits thérapeutiques naturels à l&#39;aide<em&gt; E. coli</em&gt; Comme un hôte de substitution.

La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique A produite par<em&gt; E. coli</em

La production hétérologue de produits naturels complexes est une approche conçue pour répondre aux limitations actuelles et explorer les possibilités futures. Elle est...

La biosynthèse hétérologue est une méthode qui consiste à reproduire une voie biosynthétique provenant d'un organisme dans un autre organisme hôte grâce à l'expression coordonnée de gènes. Dans cette expérience, la voie biosynthétique de l'érythromycine A est transférée dans un système hôte Escherichia coli dans le but ultime de produire de grandes quantités de cet antibiotique. Tout d'abord, l'amas de gènes responsable de la formation de l'érythromycine est isolé à partir de l'hôte bactérien d'origine.Le matériel génétique étranger est ensuite redessiné selon un format opéronique afin d'assurer une expression coordonnée de l'ensemble du chemin enzymatique chez E. coli. Lorsque la souche d'E. coli portant le chemin métabolique hétérologue d'érythromycine se réplique en culture, le composé final d'érythromycine est produit. L'activité antibiotique du composé peut ensuite être évaluée à l'aide d'un test fonctionnel utilisant Bacillus subtilis, contrairement à la production de produits naturels complexes par leurs organismes d'origine.La biosynthèse hétérologue via E. coli offre des possibilités en termes de rapidité du procédé et de potentiel d'ingénierie. Cette idée a vu le jour il

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