Name: Leffet synergique de la lumière visible et sur Gentamycin Pseudomona aeruginosa Microorganismes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Découvrez comment la lumière visible améliore l'efficacité de la gentamicine contre Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode photothérapeutique réduit la viabilité bactérienne de huit ordres de grandeur, offrant une nouvelle stratégie contre les infections résistantes aux antibiotiques.

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1. Culture bactérienne <ol><li> P. Gram négatif aeruginosa souche PAO1 ont été cultivées dans du bouillon de Luria (LB) à 37 ° C pendant 18 heures. </li><li> La culture de cellules est ensuite centrifugé à 7500 rpm (tours par minute) pendant 5 min et le surnageant a été retiré. </li><li> Les bactéries ont été remises en suspension dans 10% LB et re-pousser pendant 2 heures pour permettre à la culture pénètre de nouveau dans la phase stationnaire. </li><li> La suspension de bactéries est alors divisé en deux groupes: dans le premier groupe (2 tubes) ont été ajoutés aucun antibiotique, dans le deuxième groupe, nous avons ajouté l&#39;antibiotique gentamicine (50 pg / ml). </li></ol> 2. Détermination des unités formant colonie (UFC) <ol><li> Pour déterminer la viabilité cellulaire de 20 échantillons ont été prélevés ul de l&#39;expérience environ toutes les 2 heures dans le délai de 24 heures. Dilution en série des échantillons ont été faites et sur des plaques d&#39;agar LB et incubé pendant une nuit à 37 ° C. </li><li> Pour chaque traitement, les CFU par plate a été déterminée et une comparaison a été faite entre les périodes et les différents traitements. La réduction logarithmique UFC a été calculée comme décrit dans l&#39;équation. (1): Connexion réduction = Logu-LogC [CFU / ml] Où U est la formation de colonies valeur d&#39;unités à chaque point de temps; UFC est une unité formant des colonies, tandis que les unités de CFU / ml égale à: CFU / ml = (nombre de colonies x facteur de dilution) / (volume inoculé) Et c est la CFU trouvé dans l&#39;échantillon de contrôle au moment du départ. Notez que U désigne la formation de colonies facteur à l&#39;instant de mesure. </li><li> Le facteur de dilution est le nombre de dilutions tandis que dans chacun d&#39;eux la concentration des bactéries est réduite par un facteur de 10. Le volume inoculé était toujours 200 micro litres et elle est liée à la taille de notre tube à essai. </li></ol> Donc pour résumer le point de vue de la concentration, l&#39;antibiotique gentamicine était à une concentration de 50 ng / ml. En ce qui concerne les bactéries, jusqu&#39;à la fin dele processus, nous avons eu ensemble 8 dilutions. Chaque dilution a été par un facteur de 10 et cela a été fait dans des tubes de 200 pi. Le point de départ était de 20 ul d&#39;échantillons ajoutés dans le tube de 200 pi (et donc la concentration initiale était 20/200C 0 = 0.1C0 avec C 0 étant la concentration initiale en 20 pi d&#39;échantillons) et la concentration finale a été réduit de 8 ordres de grandeur à cause des dilutions 8. 3. Illumination <ol><li> CW Nd: YAG (longueur d&#39;onde de 532 nm et une puissance optique moyenne de 200 mW) a été scindé en deux chemins optiques utilisant optique 50% / 50% diviseur de faisceau. Le diamètre du faisceau est d&#39;environ 10 mm. La durée d&#39;exposition était de 24 heures. </li><li> Q-switché à impulsions Nd: YAG (longueur d&#39;onde de 532 nm, une puissance moyenne de 300 mW et une puissance de crête optique de 2,5 MW) est également divisé en deux chemins optiques à l&#39;aide de 50% / 50% diviseur de faisceau. Le diamètre du spot était de 6 mm. La largeur d&#39;impulsion du laser déclenché a été de 6 ns et la fréquence de répétition est 15Hz. Lela densité de puissance moyenne est de 106 mW / cm 2 et la densité de puissance de crête est 8,83 kW / mm 2. La durée d&#39;exposition était de 24 heures. </li></ol> Notez que la suspension bactérienne agité pendant l&#39;irradiation et il a été maintenu dans des conditions de culture appropriées pour la croissance bactérienne (dans tous les tubes y avait moyen Luria Broth pour permettre aux bactéries de se développer).

<ol><li>Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxic+Effect+of+Visible+Light+on+Porphyromonas+gingivalis+and+Fusobacterium+nucleatum%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study.</a> Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).</li>
<li>Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+470-nm+light+kills+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro.</a> Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).</li>
<li>Guffey, J. S., Wilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bactericidal+effects+of+405-nm+and+470-nm%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm.</a> Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Staphylococcus+aureus+strains+to+broadband+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light.</a> Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+Mechanism+for+visible+light+induced+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A possible Mechanism for visible light induced wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-induced+killing+of+bacteria+as+a+function+of+wavelength%3A+Implication+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).</li>
<li>Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Visible+Light+Phototoxicity+on+Porphyromonas+gingiwalis+and+Fusobacferium+nucleaturn%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn.</a> Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).</li>
<li>Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+630-%2C+660-%2C+810-%2C+and+905-nm+laser+irradiation+delivering+radiant+exposure+of+1-50+J%2Fcm2+on+three+species+of+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Laser+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro.</a> J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).</li>
<li>Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Photoresponses+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+to+514%2C+532%2C+and+633+nm+Low+Level+Lasers+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro.</a> Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406, 952-964 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R., Demidova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+low+level+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of low level light therapy.</a> Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).</li>
<li>Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+disruption+of+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser disruption of biofilm.</a> Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).</li>
<li>Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+light+enhancement+of+susceptibility+of+bacteria+to+gentamycin+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic.</a> Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La photothérapie a été un domaine de recherche multidisciplinaire de pointe au cours des dernières années émergents comme une approche prometteuse pour le traitement de nombreuses maladies. Dans ce contexte, l&#39;utilisation de la lumière dans le domaine visible a été largement étudiée. Par exemple, il a été constaté que les plaies infectées peuvent être guéries plus efficacement en les exposant à la lumière visible intense à des fins de stérilisation. Le mécanisme d&#39;action de cette approche a été prouvé que par l&...

<table><tbody><tr><td>Bouillon Lauria</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>Difco</td><td>231710</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;effet synergique de la lumière visible et sur gentamycin<em&gt; pseudomona aeruginosa</em&gt; microorganismes

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Récemment, il ya eu plusieurs publications sur l&#39;effet bactéricide de la lumière visible, la plupart d&#39;entre eux affirmant que partie bleue du spectre (400 nm-500 nm) est responsable du meurtre de divers agents pathogènes 1-5. L&#39;effet phototoxique de la lumière bleue a été suggéré d&#39;être le résultat d&#39;espèces induites par la lumière réactives de l&#39;oxygène (ROS) formation par photosensibilisants bactériennes endogènes qui absorbent la lumière principalement dans la région bleu 4,6,7. Il existe également des rapports d&#39;effet biocide de rouge et le proche infra-rouge 8 ainsi que la lumière verte 9. Dans la présente étude, nous avons développé une méthode qui nous a permis de caractériser l&#39;effet d&#39;une forte vert de puissance (longueur d&#39;onde de 532 nm) d&#39;une lumière continue (CW) et pulsé Q-switched (QS) sur Pseudomonas aeruginosa. En utilisant cette méthode, nous avons également étudié l&#39;effet de la lumière verte combiné avec un traitement antibiotique (gentamicine) sur la viabilité des bactéries. P. aeruginosa est acommon noscomial pathogène opportuniste causant diverses maladies. La souche est assez résistant à divers antibiotiques et contient beaucoup prédisaient AcrB / Mex polychimiothérapie de type RND systèmes d&#39;efflux 10. La méthode utilisée phase de bactéries Gram-négatives fixes libres (souche de P. aeruginosa PAO1), cultivés dans du bouillon de Luria (LB) exposés à Q-switched et / ou CW lasers avec et sans l&#39;ajout de la gentamicine antibiotique. La viabilité cellulaire a été déterminée à différents points dans le temps. Les résultats obtenus ont montré que le traitement au laser seul ne réduit pas la viabilité cellulaire par rapport au témoin non traité et que le traitement de gentamicine seul seulement abouti à une réduction de 0,5 log dans le compte viable pour P. aeruginosa. Le laser combiné et le traitement de gentamicine, cependant, ont abouti à un effet de synergie et la viabilité de P. aeruginosa a été réduit de 8 journal de. La méthode proposée peut en outre être mise enœuvre par le développement de cathéter comme dispositif capable d&#39;injecter une solution antibiotique dans l&#39;organe infecté tout en éclairant simultanément la zone de lumière.

La configuration basée sur le laser est présentée schématiquement à la figure 1. La première condition expérimentale a utilisé un laser CW Nd: YAG de longueur d&#39;onde de 532 nm (le second harmonique de Nd: YAG) et de la puissance optique moyenne de 200 mW. Cette poutre a été divisée en deux chemins optiques à l&#39;aide de 50% / 50% diviseur de faisceau optique de telle sorte que chaque faisceau divisé eu puissance de 100 mW. Le diamètre du faisceau est d&#39;environ 10 mm, et donc la densité de puis...

Nous montrons qu&#39;un dispositif biomédical développé impliquant un traitement par laser visible continu ou pulsé qui est combiné avec un traitement antibiotique (gentamicine), se traduit par un effet synergique statistiquement significative conduisant à une réduction de la viabilité de<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; PAO1, de 8 journal âge, comparativement à un traitement antibiotique seul.

L&#39;effet synergique de la lumière visible et sur Gentamycin<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismes

Récemment, plusieurs publications ont paru sur l'effet bactéricide de la lumière visible, la plupart d'entre elles affirmant que la partie bleue du spectre (400 nm-500...

L'objectif général de la procédure suivante est de valider expérimentalement l'amélioration de l'efficacité de la gentamicine par la lumière visible sur Pseudomona aerogen en solution. Cela est réalisé en premier lieu par la culture du milieu bactérien expérimental. Dans la deuxième étape, les bactéries sont illuminées en présence ou en l'absence de traitement antibiotique.Enfin, les échantillons sont prélevés à partir de la culture pendant une période de 24 heures, puis les unités formant des colonies dans la culture cellulaire à chaque point temporel sont quantifiées. En définitive, l'effet de l'illumination sur la sensibilité bactérienne à l'élimination par un traitement antibiotique peut être évalué. Les implications de cette technique s'étendent vers la thérapie in vivo des infections, car l'illumination améliore l'efficacité du traitement antibiotique.La démonstration de la procédure sera effectuée par Anna Resnick, étudiante de master dans mon laboratoire. Commencez par cultiver la souche bactérienne d'intérêt dans le milieu de croissance approprié. Ici, la souche gram-négative P. aeruginosa PAO1 est cultivée dans du bouillon LB à 37 degrés Celsius pendant quatorze heures.Ensuite, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à environ 3 145 ×g et à température ambiante. Puis éliminer le surnageant et resuspendre les bactéries dans du bouillon Laria à 10 %. Faire repousser les cellules pendant deux heures supplémentaires dans du bouillon Lauria à 37 degrés Celsius afin de permettre à la culture de réentrer en phase stationnaire. Puis diviser la suspension bactérienne en deux groupes, en ajoutant de la gentamicine à l'un des groupes.Maintenant, placez chacune des cultures sur des agitateurs magnétiques et mettez-les en marche. Ensuite, divisez soit un laser à onde continue Nd:YAG, soit, de manière alternative, un laser pulsé Nd:YAG à commutation Q en deux trajets optiques afin d'illuminer les cultures dès le début de l'illumination. Commencez à prélever des échantillons de 20 microlitres à partir des groupes témoins et traités aux antibiotiques toutes les deux heures pendant 24 heures.Le lendemain, diluez en série les échantillons obtenus. Par exemple, dans cette expérience, les bactéries ont été diluées huit fois d’un facteur 10 dans des volumes d’inoculation de 200 microlitres. Ensuite, étalez la dilution sur des boîtes de gélose au bouillon nutritif (Luria broth) et incubez les échantillons toute la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain matin.Déterminez le nombre d'unités formant colonies ou UFC par plaque pour chaque traitement, puis calculez la réduction logarithmique des UFC comme illustré ici. Notez que vous désigne les valeurs d'unités formant colonies à chaque point temporel exactement au moment du prélèvement. UFC désigne l'unité formant colonies et C désigne les UFC présents dans l'échantillon témoin au moment initial.En outre, les unités d'UFC par millilitre équivalent au nombre de colonies multiplié par le facteur de dilution, divisé par le volume d'inoculation. Voici une représentation schématique du dispositif à base de laser, où un laser NDA à onde continue ou un laser à commutation Q est divisé en deux trajets à l'aide d'un séparateur de faisceau optique 50/50. Les deux échantillons sont positionnés sur un agitateur.Cette image montre le dispositif expérimental dans lequel le laser est divisé entre deux tubes afin d'éliminer les deux tubes dans des conditions identiques. Une culture est traitée avec des antibiotiques et l'autre, témoin, ne l'est pas. Les bactéries sont ensuite exposées aux lasers pendant 24 heures.Ce graphique montre l'illumination effective sur la croissance de p aerogen avec une lumière laser à onde continue ou un laser à commutation Q, respectivement en présence ou en absence d'un traitement antibiotique dans les échantillons témoins, sans exposition à la lumière. Aucune réduction de la viabilité cellulaire n'a été observée, que les cultures aient reçu des antibiotiques ou non, suggérant que les bactéries sont résistantes à la gentamicine ; de même, le traitement au laser seul n'a pas affecté la croissance cellulaire. Toutefois, dans les cultures traitées à la fois avec le laser et l'antibiotique, la viabilité bactérienne a été réduite de plusieurs ordres de grandeur.L'effet le plus marquant a été mesuré après 24 heures, durant lesquelles la combinaison d'un laser à onde continue ou d'un laser à commutation Q a réduit la viabilité des cellules bactériennes de huit ordres de grandeur par rapport aux groupes témoins traités uniquement à l'antibiotique ou uniquement à la lumière. Ces données suggèrent une solution pour le traitement des bactéries résistantes aux antibiotiques. Ainsi, les points sur cette figure représentent les points de diffusion de la lumière permettant une administration simultanée d'une illumination laser diffusée et d'un traitement antibiotique par l'intermédiaire d'un cathéter placé dans le tissu infecté par les bactéries.Cette figure finale du spectre d'absorption autour de 532 montre clairement que la souche bactérienne p aerogen et l'antibiotique gentamicine sont transparentes à cette longueur d'onde, ce qui rend cette longueur d'onde appropriée pour un traitement combiné. La technique présentée ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie et de la médecine pour explorer l'efficacité de cette méthode, notamment concernant les biofilms et les systèmes organiques. N'oubliez pas que le travail avec les microorganismes pseudomona orgen peut être extrêmement dangereux ; par conséquent, une technique stérile appropriée ainsi qu'un environnement et un équipement stérilisés doivent toujours être utilisés lors de la réalisation de cette procédure.

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