L'identification des composés volatils olfactifs chromatographie en phase gazeuse-à logements multiples enregistrements (GCMR) dans le lobe antennaire des insectes

L’objectif global de cette procédure est d’identifier des odorants biologiquement efficaces au sens complexe du terme grâce à des enregistrements dans le cerveau du bourdon. Pour ce faire, il faut d’abord collecter le sens de l’effet comportemental, puis préparer le chromatographe en phase gazeuse et les systèmes d’enregistrement multicanaux pour l’expérience. La troisième étape consiste à préparer et à disséquer le cerveau du bourdon pour les enregistrements neuronaux dans l’antenne du lobe d’usine.

L’expérience est ensuite menée en insérant les électrodes dans le lobe d’une antenne et en mesurant les réponses aux substances volatiles soufflées par l’analyse de l’activité neuronale en réponse à un sens complexe et à leurs constituants individuels. Les odorisants biologiquement actifs obtenus par chromatographie en phase gazeuse peuvent être identifiés. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres techniques comme G-C-E-A-G, est la sensibilité des neurones de charge d’antenne et la capacité de caractériser comment les neurones du cerveau réagissent à des substances volatiles florales spécifiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car une combinaison d’étapes analytiques électrophysiologiques et chimiques est difficile à apprendre en raison de la technique d’enregistrement de la préparation électrophysiologique et des étapes nécessaires à la collecte des substances volatiles de l’espace de tête. Bien que cette technique puisse fournir des informations sur le traitement olfactif des bourdons, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que des facteurs de maladie tels que les moustiques ou les punaises qui s’embrassent, ou les ravageurs des cultures comme les pucerons ou les papillons de nuit. Pour cette procédure, faites préparer une électrode de référence en fil de tungstène sur un micro manipulateur sur une seconde.

Les micro-manipulateurs ont une électrode multicanal, telle qu’un fil enroulé, un tede ou une électrode multicanal en silicium connectée à un préamplificateur ont un chromatographe en phase gazeuse avec une sortie sur une table BNC blindée. La sortie du détecteur GCs est interfacée avec l’amplificateur et le système d’acquisition de données de sorte que les signaux neuronaux et GC sont synchronisés. Dans cet exemple, le gaz vecteur du GC est l’hélium et se trouve dans une colonne DB cinq GC.

Le GC utilise une entrée à liste partagée avec la température réglée à 200 degrés Celsius et la température du détecteur à ionisation de flamme est réglée à 230 degrés Celsius. Une fois les échantillons chauffés dans le gc, l’effluent de la colonne est divisé un à un entre le détecteur à ionisation de flamme et l’antenne B à l’aide d’un connecteur en y en verre. Dans cet exemple, le GC est utilisé pour livrer des substances volatiles collectées par absorption dynamique à partir des fleurs oculaires de Mimus Lewis, une fleur sauvage alpine originaire de Californie.

Alternativement, au lieu d’utiliser le gc, des composés volatils simples ou des mélanges de composés peuvent être délivrés par des impulsions aériennes. Injecté à travers une seringue en verre séparée contenant un morceau de papier filtre sur lequel les composés ont été déposés. Les impulsions d’air sont détournées d’un flux d’air constant à l’aide d’une électrovanne activée et contrôlée par un ordinateur.

Commencez les préparations en coupant environ un centimètre de l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre. Placez un bourdon à la base de la pointe de la pipette et poussez-le doucement vers l’extrémité opposée de la pointe jusqu’à ce que seule la tête soit exposée. À l’aide de cire dentaire fondue, faites un moule autour de la tête exposée.

La cire doit adhérer aux yeux composés pour immobiliser complètement la tête, mais elle ne doit pas entrer en contact avec l’antenne si nécessaire. Utilisez de petites broches pour immobiliser les antennes. Ensuite, faites une incision carrée en forme de fenêtre dans la capsule de la tête à l’aide d’une lame tranchante telle qu’un micro-scalpel.

Commencez à couper directement derrière l’antenne et à côté de l’un des yeux composés. Coupez une ligne droite entre les yeux. Ensuite, coupez dorsalement jusqu’à ce que la capsule céphalique se courbe vers le thorax.

Continuez la coupe jusqu’à l’extrémité opposée de la capsule céphalique. Enfin, coupez au début pour compléter le carré. Utilisez une pince pour retirer la cuticule.

La cuticule adjacente à l’antenne doit être retirée, sinon elle gênera l’électrode dès que le cerveau sera exposé. Fusionnez immédiatement le tissu avec une solution saline pour insectes. Assurez-vous que les lobes de l’antenne sont bien exposés.

Ensuite, utilisez soigneusement une paire de pinces très fines pour retirer la gaine périneurale immédiatement au-dessus des lobes de l’antenne. Faites très attention à ne pas percer le cerveau de l’abeille avec la pince. La préparation des abeilles est maintenant prête pour l’enregistrement électrophysiologique.

Commencez par attacher l’abeille préparée à une pince fixée à une base magnétique. Gardez-le super fusionné avec une solution saline d’insecte fournie à partir d’un réservoir avec un contrôleur de débit. Insérez maintenant l’électrode de référence dans le tissu cérébral controlatéral.

Ensuite, insérez l’électrode multicanal dans les lobes d’antenne de l’abeille. Lorsque les électrodes sont en place. Attendez 30 à 60 minutes pour que les enregistrements se stabilisent.

Pendant ce temps, préparez-vous aux pics extracellulaires des neurones en effectuant également le seuillage. Un seuillage manuel peut être nécessaire pour certains canaux en raison d’un bruit dans les canaux d’enregistrement. Ensuite, vérifiez que la rampe de température de la course GC est correcte.

Dans cet exemple, la température commence à 50 degrés Celsius pendant quatre minutes, puis augmente de 10 degrés par minute jusqu’à une température finale de 220 degrés Celsius, ou elle est maintenue pendant six minutes. Lorsque les formes d’onde des unités dans les canaux d’enregistrement sont devenues cohérentes, les enregistrements neuronaux sont considérés comme stables. Une fois stabilisé, chargez la seringue avec l’odeur florale de l’espace de tête et injectez l’odeur dans l’orifice d’injection de la tête du gc.

Ensuite, commencez immédiatement l’enregistrement à partir des électrodes une fois le cycle GC terminé. Laissez reposer la préparation pendant cinq à 15 minutes. Ensuite, soit injecter un autre échantillon dans le GC, soit stimuler la préparation à l’aide de composés volatils simples ou de mélanges de composés.

Si, à un moment donné, l’activité spontanée s’arrête ou change soudainement, vérifiez l’écoulement salin et laissez reposer la préparation pendant 15 minutes. Ensuite, si l’activité ne retrouve pas son niveau précédent, jetez la préparation. Après l’expérience, fixez le cerveau avec les sondes encore dans le tissu, puis excisez le cerveau, éliminez le fixateur et déshydratez le cerveau.

Les emplacements des canaux d’enregistrement peuvent ensuite être identifiés par microscopie confocale à partir du parfum floral mimus Luci. Le nombre total de volatiles sont en train de piller. Le CG est généralement compris entre 60 et 70 composés.

Le parfum de Mimus Luci est principalement composé de mono terpénoïdes, dont la bêta-myosine et l’alpha-pinine. Le reste de l’odeur est composé de six volatils carbonés. Plusieurs préparations ont été stimulées avec trois microlitres d’extrait oculaire de Mimus Lewis.

Cet enregistrement de l’une des huit unités neuronales enregistrées par l’électrode multicanal montre à quel point un neurone est en compétition sélective avec des substances volatiles spécifiques. Dans cet exemple, dine est le composé indiqué. Voici les réponses de huit unités neuronales.

Environ la moitié de l’ensemble était inconsciente. C’est surprenant compte tenu de la diversité des composés volatils auxquels il est fait allusion à partir de l’espace de tête floral, mais cela est cohérent entre les préparations et est rapporté par d’autres études. La cadence de tir normalisée des unités réactives montre qu’il existe une forte sélectivité pour un groupe d’odorisants.

Les odorisants mis en évidence par les flèches ont suscité les réponses les plus robustes. Il s’agit de la déminèse et de la transbêta-osaïne. Donc, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer votre insecte pour l’expérience, puis de mener l’expérience en utilisant la chromatographie en phase gazeuse avec enregistrement multicanal.

L’objectif est alors d’identifier des odorants comportementaux efficaces dans un bouquet complexe. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est bien faite. D’autres méthodes, comme les tests comportementaux avec les odorants identifiés, peuvent être effectuées afin de déterminer pleinement l’efficacité des substances volatiles dans la médiation de la réponse comportementale de l’insecte.