Un workflow d'imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d'expression

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier les partenaires d’interaction du clonage de l’expression de Grab Two par CD NA et de l’observation des changements dans la protéine fluorescente verte marquée Grab two. Ceci est réalisé en préparant d’abord une banque de CD NA à partir de lysats bactériens dans un deuxième temps. Les CDNA sont transfectés dans des cellules rénales embryonnaires humaines, ce qui entraînera l’expression de la construction rapporteure avec les gènes d’intérêt.

Ensuite, les plaques transfectées sont analysées au microscope opéra afin de visualiser les changements de localisation de la prise deux dans les cellules, des résultats sont obtenus qui montrent le recrutement médié par le récepteur du facteur de croissance épidermique de la GFP marquée. Prenez deux endosomes basés sur la microscopie à fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que ces deux hybrides est que les partenaires d’interaction de grab two peuvent être identifiés dans une situation physiologique qui prend en compte la distribution subcellulaire des partenaires d’interaction.

Eh bien, cette méthode peut être utilisée pour identifier la transduction du signal par Grab two. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que d’autres protéines d’intérêt. La banque d’ADNC est fournie sous forme de clones bactériens uniques dans les stocks de glycérol.

Dans un format à 96 puits à l’aide de la commande re ray dans le menu de sélection de la lampe de sélection Hudson Rapid. Choisissez des clones bactériens de la plaque source et inoculez-les dans une plaque à 96 puits profonds de 1,5 millilitre. Scellez tardivement les plaques du puits profond avec un joint perméable aux gaz et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur. Le lendemain, faites tourner les plaques du puits profond contenant les bactéries A à 2000 tr/min pendant 20 minutes.

À l’aide d’adaptateurs de plaque dans une centrifugeuse de table, aspirez le média des puits en laissant la pastille bactérienne intacte. Ensuite, configurez la platine de la station de travail Tecan Freedom Evo Automation comme indiqué ici. Répartissez les solutions pour la préparation des plasmides dans les auges un à cinq et placez une plaque à puits profond sur le pont.

Placez une auge à plusieurs puits avec une solution alucienne adjacente à la plaque de puits profond, chargez les pointes dans les supports de pointes. Assemblez le collecteur d’aspiration. La plaque de liaison plasmidique est placée à l’intérieur du collecteur et la plaque filtrante plasmidique est placée sur le collecteur de pastilles de suspension Resus avec 250 microlitres de première solution.

Le tampon de suspension Resus par pipetage de haut en bas. S’assurer que les granulés sont complètement remis en suspension est essentiel au succès de cette procédure. Un shaker peut être utilisé si une caresse de haut en bas ne remet pas complètement le granulé en suspension.

Une fois que les granulés sont complètement remis en suspension, les bactéries se trouvent en ajoutant 250 microlitres de solution au tampon de lyse. Scellez la plaque et retournez-la pour permettre un mélange complet. Réglez une minuterie sur deux minutes.

Ensuite, ajoutez 350 microlitres de la solution trois. Le tampon de neutralisation. Scellez la plaque et inversez trois lignes de temps.

Transférez les lysats bactériens dans les plaques filtrantes plasmidiques. Appliquez l’aspirateur pendant cinq minutes. Retirez la plaque filtrante et placez la plaque de liaison sur le collecteur.

Appliquez l’aspirateur pendant une minute. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage supplémentaire et appliquez l’aspirateur pendant deux minutes. Ajoutez 900 microlitres de solution tampon de lavage et appliquez le vide pendant deux minutes.

Après cela, ajoutez 900 microlitres de solution tampon de lavage quatre à nouveau et appliquez le vide pendant 15 minutes. Placez la plaque de collecte d’ADN à l’intérieur du collecteur. Ajoutez 100 microlitres de tampon Elucian dans la plaque de liaison et incubez pendant deux minutes.

Appliquez l’aspirateur pendant 10 minutes. Enfin, retirez la plaque collectrice et mesurez la concentration d’ADN à l’aide du NanoDrop 8 000. En règle générale, on peut s’attendre à un rendement d’environ 100 nanogrammes par microlitre avec cette méthode pour commencer cette procédure.

Après hec 2 9 3 cellules sont essayées, inisées et comptées. Utilisez un distributeur automatique pour distribuer deux fois 10 dans les quatre cellules dans chaque puits d’un Perkin Elmer. Voir la plaque d’incubation des cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour la transfection.

À l’aide du manipulateur de liquide automatisé, préparez le mélange suivant dans chaque puits d’un fond rond de 96, une plaque de puits de 100 nanogrammes de GFP. Prenez deux ADN plasmidiques avec 100 nanogrammes de CD NA dans 25 microlitres de milieu sans sérum. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de milieu sans sérum contenant 0,5 microlitre de transfecteur dans un mélange de puits et démarrez la minuterie pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, transférez 50 microlitres au transfet CDNA en mélange avec les cellules. Utilisation d’une méthode de distribution douce. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pour commencer l’acquisition d’images, démarrez le logiciel opera. Sélectionnez l’onglet de configuration et sélectionnez l’objectif 20 fois et le bon type de plaque. Assurez-vous que le collier est réglé sur la bonne valeur sur l’objectif pour permettre la mise au point avec différents types de plaques.

Ensuite, sélectionnez l’onglet microscope. Définissez l’exposition un comme laser fite 4 88 et l’exposition deux comme laser UV 365. Activez le filtre UV sur les deux expositions et attribuez l’exposition.

Un à l’appareil photo un et l’exposition. Deux à la caméra deux. Réglez les temps d’exposition sur 800 millisecondes pour l’exposition, un et 40 millisecondes pour l’exposition.

Deuxièmement, sélectionnez l’exposition, un réglez la hauteur de mise au point à zéro micron. Sélectionnez le focus une fois mis au point. Exposez la première caméra.

Ajustez la hauteur de mise au point pour optimiser le plan d’exposition et cliquez sur prendre la hauteur. Enregistrez les paramètres d’exposition, répétez l’opération pour l’exposition. Deuxièmement, sélectionnez l’onglet de définition de l’expérience, créez une mise en page et une sous-mise en page.

Faites glisser et déposez la mise en page, l’exposition, l’image de référence, l’inclinaison, le fichier de recadrage et la sous-mise en page appropriés. Enregistrez l’expérience. Sélectionnez l’onglet Expérience automatique et acquérez des images dans des conditions normales.

Le grab two est localisé dans toute la cellule. Lors de la stimulation d’un récepteur de facteur de croissance, il se déplace vers la membrane plasmique et est ensuite internalisé dans les endosomes. Dans cette figure, le panneau du haut montre les cellules de CO M six qui ont été transfectées transitoirement avec la GFP grab deux, et comme prévu, la fluorescence est distribuée dans toute la cellule.

Cependant, dans les cellules transfectées transitoirement avec la GFP, la prise deux plus le récepteur de surface cellulaire IT EGFR capture deux se déplace vers des structures semblables à des endosomes, comme le montre le panneau inférieur. Ainsi, lors de l’application d’une bibliothèque à l’échelle du génome, on peut s’attendre à ce que de nouvelles protéines de surface cellulaire de liaison puissent être identifiées. Cette méthode ne se limite pas à la détection des protéines de surface cellulaire.

Par exemple, le DYNAMIN deux du GPA, qui est impliqué dans l’endocytose médiée par le grab two, induit une translocation du grab two. Dans cette expérience, la deuxième prise GFP a été transfectée avec DNM deux dans des cellules T HEC 2 93. La relocalisation de la GFP grab two vers des structures semblables à des endosomes est illustrée par les cellules à l’intérieur des cercles rouges.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunoprécipitation ou les tests biochimiques peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions, par exemple si l’interaction est directe ou indirecte. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le clonage d’expression afin d’identifier les interactions entre les protéines subcellulaires.