Isolement des lymphocytes de souris muqueuses génitales Tract

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les lymphocytes de l’appareil reproducteur de la souris. Pour ce faire, il suffit d’abord d’enlever l’ensemble de l’appareil génital et de découper le tissu en petits morceaux pour libérer les lymphocytes du tissu. Le tissu finement haché est digéré avec de la collagénase huit et une agitation vigoureuse du tissu à 37 degrés Celsius.

Avec une agitation magnétique, les lymphocytes sont ensuite isolés par gradient par appel. En fin de compte, les lymphocytes peuvent être caractérisés par cytométrie en flux L’implication de cette technique s’est étendue au diagnostic et au traitement des maladies de la reproduction. Comme cette méthode nous permet de comprendre le comportement des lymphocytes tissulaires, qui sont souvent différents du lymphocyte isolé du système circulant.

Bien que cette méthode donne un aperçu du système de la muqueuse reproductrice, elle peut également s’appliquer à d’autres systèmes tels que les muqueuses intestinales et respiratoires. Après avoir euthanasié une souris femelle, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision médiane basse, puis ouvrez la peau. Écartez doucement les intestins, identifiez le SCU, puis isolez et retirez tout le tractus génital du SCU à l’ouverture vaginale.

Placez l’appareil génital dans une boîte de Pétri. Utilisez une paire de ciseaux pour ouvrir tout le tractus longitudinalement. Transférez ensuite le tissu dans une boîte de Pétri avec un support RPMI 10 complet.

Coupez maintenant l’appareil génital en petits morceaux, puis transférez-les dans un flacon contenant du RPMI 10 complet et de l’EDTA. Placez le flacon sur un agitateur magnétique et remuez le tissu deux fois pendant 15 minutes à température ambiante à chaque fois pour éliminer les cellules épithéliales après la dernière période d’agitation, jetez le surnageant, puis versez les morceaux de tissu à travers une passoire à cellules de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez les résidus d’EDTA avec un média complet.

Transférez maintenant les morceaux de tissu filtrés dans un nouveau flacon avec du RPMI 10 frais et de la collagénase et digérez les morceaux à 37 degrés Celsius sur le dispositif d’agitation magnétique pour remuer vigoureusement le tissu après une heure, versez le surnageant à travers une passoire à cellules de 100 micromètres dans un tube conique frais de 50 millilitres et maintenez la suspension cellulaire filtrée sur de la glace. Ajoutez du RPMI 10 frais avec de la collagénase dans la fiole d’origine et remuez le mouchoir deux fois de plus avec du RPMI 10 complet frais et de la collagénase à chaque fois. Après la troisième digestion, aucun morceau de tissu visible ne doit être présent dans la solution.

Maintenant, regroupez les surnageants des trois digestions ensemble. Faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 410 G et quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Commencez par suspendre la pastille cellulaire dans une solution fraîche à 40 % par appel.

Ajoutez la suspension cellulaire avec 40 % par appel dans un tube dégradé, puis sous-couche soigneusement et un volume égal de fraîchement préparé. 70 % par appel. Centrifugez maintenant les échantillons de gradient pendant 20 minutes à température ambiante avec la pause.

Après centrifugation, prélevez soigneusement les lymphocytes à l’interface entre les gradients de perol. Ensuite, lavez les cellules récupérées avec du RPMI un à trois pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, après avoir jeté le supnatant, mettre en suspension les lymphocytes dans la solution appropriée selon le procédé expérimental souhaité.

Ce diagramme à points est un exemple d’une population de lymphocytes qui a été isolée de l’appareil génital d’une souris infectée par voie intravaginale à chlamydia uréderme. Sept jours après l’infection, la suspension de cellule unique a été contrôlée sur des lymphocytes positifs pour le CD 3, puis analysée pour les cellules exprimant le CD 4 et le CD 8 après son développement. Cette technique a ouvert la voie au chercheur pour explorer la fonction des lymphocytes reproducteurs et les caractéristiques cellulaires dans un modèle de maladie virale murine qui imite les maladies humaines.