Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent

Cette approche expérimentale combine l'incorporation de BRDU avec l'hybridation in situ fluorescente. Pour analyser quantitativement le moment de réplication des chromosomes de mammifères. Premièrement, incorporez du BRDU dans des cellules vivantes et récoltez les chromosomes en métaphase.

Ensuite, réalisez un caryotype ADN combiné à une coloration immunohistochimique séquentielle par anticorps anti-BRDU afin d'identifier les chromosomes en cours de réplication individuels. Puis, utilisez la microscopie photographique pour capturer des images des signaux de hybridation et de l'incorporation de BRDU dans des figures mitotiques individuelles. À l'aide du logiciel CytoVision, calculez la surface et l'intensité des pixels représentés par les signaux BRDU ou DAPI sur chaque chromosome isolé.

Les résultats permettent de quantifier et de comparer l'incorporation de BrdU dans les chromosomes réarrangés individuels et leurs homologues. Étant donné que la méthode décrite ici évalue les cellules individuelles, elle est capable de détecter des modifications dans la réplication et le moment de celle-ci sur les réarrangements chromosomiques présents seulement dans une fraction des cellules d'une population, par rapport aux protocoles récemment développés à haut débit utilisant les micromatrices et le séquençage de l'ADN. Cette méthode permet une comparaison directe des chromosomes homologues présents dans la même cellule.

Il possède également la capacité d'identifier de façon inéquivoque les réarrangements chromosomiques qui affectent la réplication chromosomique. La chronologie de l'ensemble des chromosomes illustrant la procédure sera assurée par Leslie Smith. Un chercheur associé dans mon laboratoire, semez les cellules à environ 70 % de confluence dans une boîte de culture tissulaire de 150 millimètres et placez-les dans une incubateur à cellules pendant 24 heures au moment approprié.

Points antérieurs à la récolte. Renouveler le milieu avec un milieu complet frais contenant 10 microgrammes par millilitre de BRDU. La durée d'incubation des cellules dans le milieu contenant du BRDU varie selon le type cellulaire et l'espèce.

Typiquement, la phase G2 dure entre deux et cinq heures. Retirer le milieu de culture de la plaque en conservant 10 millilitres dans un tube conique de centrifugation de 15 millilitres. Rincer les cellules avec 10 millilitres de PBS et éliminer le reste du PBS par aspiration sous vide.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de trypsine à 0,25 % et incubez à température ambiante jusqu'à ce que les cellules se détachent de la plaque. Récupérez les cellules et transférez la suspension dans les 10 millilitres de milieu réservé. Pelletez les cellules par centrifugation, puis aspirez tout le milieu sauf 0,5 millilitre.

Resuspendez maintenant les cellules soigneusement à l’aide de pipetage pour provoquer une gonflement osmotique des cellules ; ajoutez trois gouttes de chlorure de potassium à 75 millimolaire préchauffé à 37 degrés Celsius, et mélangez la suspension cellulaire par pipetage. Incorporez ensuite 0,5 millilitre supplémentaire de solution hypotonique. Amenez maintenant le volume total de la solution hypotonique à cinq millilitres et mélangez par pipetage.

Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 20 à 45 minutes selon le type cellulaire. Incuber les tubes en position inclinée afin de maintenir les cellules en suspension. Puis centrifuger à 400 ×g pendant 10 minutes.

Aspirez tout sauf 0,5 millimètre du surnageant et utilisez une pipette Pasteur pour resuspendre délicatement le culot cellulaire. Les cellules gonflées osmotiquement seront fragiles à ce stade, il faut donc prendre soin de ne pas endommager les membranes cytoplasmiques. Ensuite, ajoutez trois gouttes de carnoy, fixateur, et mélangez doucement.

Après avoir ajouté 0,5 millilitre supplémentaire de fixateur, amener le volume de fixateur à cinq millilitres et pipeter pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Ces cellules fixées peuvent être conservées à l’abri de la lumière à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs mois. Récolter les cellules fixées par centrifugation, aspirer le fixateur et resuspendre le culot dans 10 volumes de fixateur en maintenant le tout sur de la glace fondante.

Faites glisser la lame à un angle d'environ 45 degrés. Ajoutez la suspension cellulaire goutte à goutte pour étaler la suspension. Inondez la lame avec le fixateur et éliminez l'excès.

Ensuite, placez la lame à plat sur du papier absorbant pour la faire sécher à l'air. Évaluez les échantillons en recherchant la présence de préparations mitotiques à l’aide d’un microscope inversé. Ajoutez deux microlitres de 10 microgrammes par millilitre d’ARNase A dans deux fois SSC sur chaque lame et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Effectuez trois lavages de trois minutes chacun avec deux XSSC à pH 7,0 à température ambiante. Ensuite, déshydratez les échantillons à l'aide d'une série d'éthanol à température ambiante pendant trois minutes. Puis faites sécher à l'air chaque échantillon à température ambiante vers un tube microfuge refroidi.

Ajoutez quatre microgrammes de substrat d'ADN marqué au nucléotide, du tampon de traduction NIC 10 X, un mélange de dNTP et de l'enzyme de traduction NIC. Incubez la réaction à 16 degrés Celsius toute la nuit, puis chauffez à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Ensuite, refroidissez sur de la glace pendant cinq minutes.

Maintenant, pour précipiter l'ADN à l'éthanol, ajoutez 48 microlitres d'acétate de sodium à 3 M, 160 microlitres d'ADNc 1D à 0,25 microgramme par microlitre et 1,2 millilitre d'éthanol à 100 %. Conservez l'échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes à toute la nuit afin de précipiter l'ADN par centrifugation, puis lavez le culot avec de l'éthanol à 70 %. Resuspendez la sonde d'ADN séchée à l'air dans 40 microlitres d'eau doublement distillée pour obtenir une concentration finale de 100 nanogrammes par microlitre d'ADN marqué pour l'hybridation simultanée back SEP. Préparez deux mélanges de sondes distincts contenant du cot ADNc 1D comme détaillé dans le manuscrit accompagnant.

Dénaturez les mélanges de sondes à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes afin d'ajouter l'ADN cot 1D aux séquences répétitives. Mélangez maintenant la sonde de blocage avec la sonde S selon un rapport de trois à deux, soit 25 microlitres par échantillon.

Faites glisser à côté pour dénaturer les échantillons. Plongez les lames dans du formamide 70 % et du deux XSSC à 72 degrés Celsius et incubez pendant trois minutes. Désaiguisez immédiatement les échantillons à l'aide d'une série d'éthanol à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Faites sécher à l'air chaque échantillon à température ambiante pendant environ 10 minutes avant de terminer la préparation de la sonde. Équilibrez les lames sur un réchauffeur de lames à 45 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 25 microlitres du mélange de sonde back S.

Positionner délicatement une lame couvre-objet sur chaque lame et sceller tous les bords avec du ciment en caoutchouc pour l'étape d'hybridation. Incuber les échantillons toute la nuit à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Effectuer trois lavages post-hybridation de trois minutes chacun dans 50 % IDE deux XSSC pH 7,0 à une température de 38 à 40 degrés Celsius.

La température optimale des lavages dépend de la sonde. En cas d'hybridation de fond élevée, augmentez la température des lavages. Inversement, si le signal de la sonde est faible et qu'il n'y a pas de fond, réduisez la température des lavages.

Réalisez un lavage dans le tampon PN à température ambiante pendant trois minutes. Pour la détection de la BRDU, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage PNM sur chaque lame. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, puis faites égoutter les lames sur du papier absorbant.

Ensuite, ajouter 100 microlitres d'anticorps conjugué anti-B-R-D-U-F-E à 50 microgrammes par millilitre et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Effectuer trois lavages de trois minutes dans le tampon PN à température ambiante. Retirer l'excès de tampon PN de chaque lame.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de solution de montage dappy Antifa. Recouvrez la lame d'une serviette en papier et appuyez sur le couvre-objet afin d'expulser les bulles d'air et l'excès de solution de montage. Capturez les images à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD.

À l’aide de l’objectif 100 x, de la roue à filtres automatique et du logiciel Cyto Vision, capturer le BRDU en utilisant un filtre fitzy, les peintures chromosomiques et les sondes centromériques avec un filtre side three ou Texas red. Utiliser également un filtre dappy pour la coloration des noyaux. Identifier les chromosomes d’intérêt individuels à l’aide de sondes de type back EP ou de sondes spécifiques aux chromosomes dans le logiciel Cyto Vision.

Découpez chaque chromosome d'intérêt dans l'étalement métaphasique dans son intégralité. Copiez et collez les images des chromosomes DPI et FITZY dans une nouvelle fenêtre. Sélectionnez l'icône de graphique dans le menu d'outils, ce qui permet de générer un graphique représentant la surface et l'intensité des colorations Fitz et dappy le long de chaque chromosome individuel.

Cela se fait en traçant une ligne sur toute la longueur du chromosome, de l'extrémité du bras court à celle du bras long. Dans le menu de l'outil, sélectionnez l'icône de données et générez un tableau affichant la surface et l'intensité calculées pour la ZI et le dpi. Ensuite, sélectionnez les signaux ZI et DPI pour les chromosomes d'intérêt.

Ensuite, cliquez sur les boutons d'intensité et de surface de l'icône tableau. Le logiciel génère une mesure numérique de pixels par pouce carré pour chaque signal. Ensuite, l'intensité moyenne des pixels de chaque chromosome est multipliée par la surface occupée par ces pixels.

Pour obtenir le nombre total de pixels permettant la visualisation des régions chromosomiques les plus récemment répliquées, évaluer le motif de type « bandit » de l'incorporation de BRDU dans les régions chromosomiques en cours de réplication active. Ensuite, calculer les différences de chronologie de réplication entre paires de chromosomes en fonction des différences observées dans les profils de bandes de BRDU. Les chromosomes des cellules de mammifères se répliquent selon un programme temporel, la réplication précoce et tardive ayant lieu respectivement au début et à la fin de la phase S.

Une phase S typique dans les cellules de mammifères dure de huit à dix heures, et la phase G2 dure généralement de deux à cinq heures. Dans ce système expérimental, la BRDU est ajoutée pendant des durées croissantes afin de marquer les dernières portions des chromosomes qui se répliquent ; ces cellules contiennent une délétion du gène humain ASAR6 situé en 6q16.1. Après un traitement de cinq heures avec la BRDU, les cellules en mitose ont été récoltées et préparées pour la détection de l'incorporation de BRDU et l'hybridation in situ fluorescente, en utilisant une sonde de peinture du chromosome 6. Les deux chromosomes 6 présentent trois étiquettes fluorescentes.

La différence significative dans le profil de banding BRDU est compatible avec un retard dans le moment de réplication supérieur à deux heures pour l'un des deux chromosomes six. Le logiciel Cyto vision illustre les profils d'intensité du signal différentiel pour le DPI et le BRDU sur les deux chromosomes six, indiquant une réplication asynchrone. En outre, on observe une différence significative dans la quantité totale d'incorporation de BRDU par rapport à une analyse similaire de la coloration au DPI.

L'inclusion d'une sonde arrière contenant le gène humain AR six met en évidence le chromosome unique six portant une délétion sur son bras long dans cette cellule. Fait intéressant, on observe une incorporation plus intense de BRDU et un profil de bandes d'incorporation de BRDU plus étendu par rapport au chromosome six non-ED. Lorsque des préparations mitotiques provenant de sept cellules différentes ont été traitées afin de quantifier la différence de chronologie de réplication entre les chromosomes six.

Les niveaux de BRDU montrent une différence supérieure à deux fois entre les valeurs totales de pixels pour les chromosomes six supprimés et non supprimés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être correctement réalisée en trois jours. Nous espérons que vous avez maintenant une bonne compréhension de la manière de mesurer la réplication, le moment de la réplication des chromosomes homologues situés dans la même cellule, et d'identifier sans ambiguïté les réarrangements chromosomiques corrélés à des modifications de la réplication.

Chronologie de l'ensemble des chromosomes.