Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent In situ Hybridation

Cette approche expérimentale combine l’incorporation de BRDU avec la fluorescence dans l’hybridation C deux. Analyser quantitativement le moment de la réplication des chromosomes de mammifères. Tout d’abord, incorporez BRDU dans des cellules vivantes et récoltez les chromosomes en métaphase.

Ensuite, effectuez une coloration séquentielle de l’ADN de poisson avec des anticorps BRDU pour identifier les chromosomes réplicatifs individuels. Ensuite, utilisez la photomicroscopie pour capturer des images des signaux des poissons et de l’incorporation des BRDU dans des figures mitotiques individuelles. À l’aide d’un logiciel de vision thermique, calculez la surface et l’intensité des pixels représentés par les signaux BRDU ou DPI sur chaque chromosome isolé.

Les résultats permettent de quantifier et de comparer l’incorporation de BRDU dans des chromosomes individuels réarrangés et leurs holos. Parce que la méthode décrite ici évalue des cellules individuelles, elle a la capacité de détecter les changements dans la réplication, le timing des réarrangements chromosomiques qui ne sont présents que dans une fraction des cellules d’une population par rapport aux protocoles de séquençage de l’ADN et des microréseaux à haut débit récemment développés. Cette méthode permet une comparaison directe des chromosomes homologues résidant dans la même cellule.

Il a également la capacité d’identifier sans ambiguïté les réarrangements chromosomiques qui affectent la réplication des chromosomes. Le chronométrage des chromosomes entiers démontrant la procédure sera Leslie Smith. Un associé de recherche de mon laboratoire ensemence les cellules à environ 70 % de confluence dans une boîte de culture tissulaire de 150 millimètres et les place dans un incubateur cellulaire pendant 24 heures au moment approprié.

Points avant la récolte. Réapprovisionnez le milieu avec un milieu complet frais contenant 10 microgrammes par millilitre. BRDU. La durée de culture des cellules dans des milieux avec BRDU varie selon le type de cellule et l’espèce.

En règle générale, G deux phases dure entre deux et cinq heures. Retirez le milieu de culture de la plaque en économisant 10 millilitres dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Rincez les cellules avec 10 millilitres de sine et retirez le sine restant par aspiration sous vide.

Ajoutez ensuite cinq millilitres de trypsine à 0,25 % et incubez à température ambiante jusqu’à ce que les cellules se détachent de la plaque. Récoltez les cellules et transférez la suspension dans les 10 millilitres de milieu réservé. Granulez les cellules par centrifugation, aspirez tout le média sauf 0,5 millilitre.

Maintenant, suspendez complètement les cellules à l’aide d’un passage de pipette pour gonfler osmotiquement les cellules, ajoutez trois gouttes de chlorure de potassium de 75 millimolaires réchauffés à 37 degrés Celsius et mélangez la suspension cellulaire avec un passage de pipette. Incorporez ensuite 0,5 millilitres supplémentaires de solution hypotonique. Portez maintenant le volume total de la solution hypotonique à cinq millilitres et mélangez par pipetage.

Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 20 à 45 minutes selon le type de cellule. Incuber les tubes en biais pour maintenir les cellules en suspension. Puis centrifuger à 400 fois G pendant 10 minutes.

Aspirez tout le surnageant sauf 0,5 millimètre et utilisez une pipette à agitation passée pour ressusciter doucement la palette cellulaire. Les cellules osmotiquement gonflées seront fragiles à ce stade, il faut donc veiller à ne pas perturber les membranes cytoplasmiques. Ensuite, ajoutez trois gouttes de bruit de voiture, fixateur et mélangez doucement.

Après avoir incorporé 0,5 millilitre supplémentaire de fixateur, portez le volume du fixateur à cinq millilitres et pipetez jusqu’à obtenir une suspension cellulaire homogène. Ces cellules fixes peuvent être stockées dans l’obscurité à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs mois. Récoltez les cellules fixes par centrifugation, aspirez le fixateur et remettez la pastille en suspension dans 10 volumes de fixateur tenant un microscope humide et glacé.

Faites glisser à un angle d’environ 45 degrés. Ajoutez la suspension cellulaire goutte à goutte pour étaler la suspension cellulaire. Inondez le toboggan avec un fixateur et égouttez l’excédent.

Ensuite, posez la diapositive à plat sur du papier absorbant pour la faire sécher à l’air libre. Évaluez les échantillons pour détecter la présence de propagations mitotiques à l’aide d’un microscope inversé. Ajoutez deux microlitres d’ARN A de 10 microgrammes par millilitre dans deux XSSC à chaque lame et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Effectuez trois lavages de trois minutes de deux XSSC pH 7,0 à température ambiante. Ensuite, déshydratez les échantillons à travers une série d’éthanol à température ambiante pendant trois minutes. Chaque air sèche les échantillons à température ambiante dans un tube de micro-fuge réfrigéré.

Ajoutez quatre microgrammes de nucléotide marqué au substrat d’ADN, 10 tampons de traduction NIC, un mélange DNTP et une enzyme de traduction NIC. Incuber la réaction à 16 degrés Celsius, chauffer toute la nuit à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Ensuite, réfrigérez sur de la glace pendant cinq minutes.

Maintenant, pour précipiter l’éthanol, l’ADN ajoute 48 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires, 160 microlitres de 0,25 microgramme par microlitre capturé 1D NA et 1,2 millilitres d’éthanol à 100 %. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour la nuit, précipitez l’ADN par centrifugation et lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %, remettez en suspension la sonde d’ADN séchée à l’air dans 40 microlitres d’eau double distillée pour une concentration finale de 100 nanogrammes par microlitre d’ADN marqué pour l’hybridation simultanée SEP arrière. Préparez deux lits séparés, 1D NA contenant des cocktails de sonde, comme détaillé dans le manuscrit ci-joint.

Dénaturez les cocktails de sonde à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce que le lit 1D NA soit des séquences répétitives. Combinez maintenant la sonde arrière avec la sonde S dans un rapport de trois à deux pour 25 microlitres par échantillon.

Faites glisser à côté pour dénaturer les échantillons. Immergez les lames dans 70 % d’amide deux XSSC à 72 degrés Celsius et incubez pendant trois minutes. Déshydratez immédiatement les échantillons à travers une série d’éthanol à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Chaque mesure fait sécher les échantillons à l’air libre à température ambiante environ 10 minutes avant la fin de la préparation de la sonde. Équilibrez les diapositives sur un chauffe-diapositives à 45 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 25 microlitres du mélange de sonde arrière S.

Pour chaque glissière, positionnez délicatement une lamelle de recouvrement et scellez-la sur tous les bords avec de la colle caoutchouc pour l’étape d’hybridation. Incuber les échantillons pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Effectuez trois lavages post-hybridation de trois minutes chacun à 50 % IDE deux XSSC pH 7,0 à 38 à 40 degrés Celsius.

La température optimale des lavages dépend de la sonde. S’il y a une hybridation de fond élevée, augmentez la température des lavages. À l’inverse, si le signal de la sonde est faible et qu’il n’y a pas de fond, diminuez la température des lavages.

Effectuez un lavage dans le tampon PN à température ambiante pendant trois minutes. Pour la détection BRDU, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage PNM à chaque lame. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité, égoutter les lames sur une serviette en papier.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de 50 microgrammes par millilitre d’anticorps conjugués anti B-R-D-U-F-E et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Effectuez trois lavages de trois minutes dans le tampon PN à température ambiante. Retirez l’excédent de mémoire tampon PN de chaque diapositive.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de solution de montage antifa dappy. Couvrez la diapositive avec une serviette en papier et appuyez sur la lamelle pour expulser les bulles d’air et l’excès de solution de montage. Capturez les images à l’aide d’un microscope à fluorescence relié à une caméra CCD.

À l’aide de l’objectif 100 x, de la roue à filtres automatique et du logiciel de vision cyto, capturez BRDU à l’aide d’un filtre ajusté et les peintures chromosomiques et les sondes de centromère à l’aide d’un filtre à trois côtés ou d’un filtre rouge Texas. Utilisez également un filtre dappy pour la coloration des noyaux. Identifiez les chromosomes individuels d’intérêt à l’aide de sondes de peinture arrière EP ou spécifiques aux chromosomes dans le logiciel de vision cyto.

Découpez chaque chromosome d’intérêt de la métaphase propagée dans son ensemble. Copiez et collez les images DPI et FITZY des chromosomes dans une nouvelle fenêtre. Sélectionnez l’icône du graphique dans le menu d’outils, ce qui permet de générer un graphique représentant la surface et l’intensité de la coloration de Fitz et de Dappy le long de chaque chromosome individuel.

Cela se fait en traçant une ligne sur toute la longueur du chromosome d’un bras court à un bras long. Dans le menu d’outils, sélectionnez l’icône de données et générez un tableau affichant la surface calculée et l’intensité pour ZI et dpi. Ensuite, sélectionnez les signaux ZI et DPI pour les chromosomes d’intérêt.

Cliquez ensuite sur les boutons d’intensité et de zone sur l’icône du tableau. Le logiciel génère une mesure numérique de pixels par pouce carré pour chaque signal. Ensuite, l’intensité moyenne des pixels de chaque chromosome est multipliée par la surface occupée par ces pixels.

Pour obtenir le nombre total de pixels pour la visualisation des dernières régions de réplication des chromosomes, évaluez le modèle de bandit de l’incorporation de BRDU pour les régions de réplication active des chromosomes. Calculez ensuite les différences de temps de réplication entre les paires de chromosomes en fonction des différences de bande BRDU. Les chromosomes des cellules de mammifères se répliquent selon un programme temporel, la réplication précoce et tardive se produisant respectivement au début et à la fin de la phase S.

Un sase typique dans les cellules de mammifères dure de huit à dix heures, et G deux dure généralement de deux à cinq heures. Dans ce système expérimental, BRDU est ajouté pendant des périodes de temps croissantes pour marquer les dernières parties des chromosomes qui répliquent ces cellules contiennent une délétion de l’humain comme un gène R six situé à six Q 16.1. Après un traitement de cinq heures avec BRDU, des cellules mitotiques ont été récoltées et traitées pour l’incorporation de BRDU et l’hybridation fluorescente en C deux à l’aide d’une sonde de peinture du chromosome six, les deux chromosomes six affichent trois marqueurs fluorescents.

La différence significative dans le modèle de bandes BRDU est compatible avec le retard de réplication de plus de deux heures pour l’un des six chromosomes. Le logiciel de vision Cyto décrit les différents profils d’intensité du signal pour DPI et BRDU sur les deux chromosomes six, ce qui indique une réplication asynchrone. De plus, il existe une différence significative dans la quantité totale d’incorporation de BRDU par rapport à une analyse similaire de la coloration DPI.

L’inclusion d’une sonde arrière contenant le gène humain comme AR six met en évidence le chromosome six unique contenant une délétion sur son bras long dans cette cellule. Il est intéressant de noter qu’il y a une incorporation BRDU plus intense et un modèle de bandes plus étendu que sur le chromosome six non-ED. Lorsque les propagations mitotiques de sept cellules différentes ont été traitées pour quantifier la différence de temps de réplication entre les chromosomes six.

Les niveaux BRDU montrent une différence plus de deux fois entre les valeurs totales des pixels pour les six chromosomes supprimés et non DE. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée correctement en trois jours. Nous espérons que vous avez maintenant une bonne compréhension de la façon de mesurer la réplication, le moment des chromosomes homologues résidant dans la même cellule et d’identifier sans ambiguïté les réarrangements chromosomiques en corrélation avec les altérations de la réplication.

Chronométrage des chromosomes entiers.