Analyse en Imagerie du Neuron à l'interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Ce protocole met en place une nouvelle plateforme de co-culture d'axones neuronaux et d'astroglies afin d'analyser les interactions entre neurones et glie à l'aide d'une imagerie à haute résolution. Premièrement, assemblez la chambre de culture microfluidique, préparez les cultures neuronales et induisez les axones neuronaux à pénétrer dans l'autre côté du MCP. Ensuite, ajoutez des astrocytes en culture pour établir un système de co-culture compartimenté ; les résultats, notamment l'imagerie en temps réel combinée à la microscopie confocale d'immunofluorescence, peuvent aider à comprendre les interactions entre les axones, les astroglies et les axones neuronaux.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en tentant de séparer l'effet du processus neuronal de celui de la sécrétion neuronale sur la régulation du GT. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à induire l'axone dans une autre partie du compartiment cellulaire. Cela nécessite une forte densité de neurones sains ensemencés du côté neuronal, les neurones étant placés près des canaux centraux.

Les chambres ouvertes MCP sont conçues pour des cultures compartimentées de différents types de cellules ; des revêtements de polyuréthane et de laminine sont nécessaires pour la mise en culture de neurones et d'astrocytes en co-culture. Appliquez d'abord une solution de polyuréthane à un milligramme par millilitre sur des boîtes à fond en verre stériles et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Lavez les boîtes à fond en verre revêtues trois fois avec de l'eau doublement distillée, puis placez-les sous une hotte stérile pour les faire sécher.

Ensuite, recouvrir la boîte avec un milligramme par millilitre de laminine et sécher sous lumière UV pendant une heure. L'assemblage du MCP dans la boîte à fond en verre doit être préparé frais avant utilisation. Placer la plateforme de culture microfluidique avec les canaux de connexion centraux sur sa face inférieure et former un joint étanche avec le verre recouvert.

Plaques inférieures. Ajouter du milieu de culture standard pour neurones ou pour astrocytes des deux côtés du MCP assemblé. Incuber la chambre pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius et vérifier l'absence de fuite entre le MCP et le verre.

Plaque inférieure. Des cultures de cellules neuronales corticales sont préparées fraîchement à partir de cerveaux de souris âgés de 14 à 16 jours embryonnaires. Après la dissection du cerveau de souris, retirer les méninges du cortex sous le microscope stéréoscopique.

Utilisez une lame de rasoir pour hacher le tissu en petits fragments et placez les fragments de tissu dans un tube après centrifugation. Éliminez le milieu situé au-dessus du culot et ajoutez 0,05 % de Try pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Dissociez les cellules par agitation douce à l’aide d’une pipette Pasteur à embout poli.

Faites passer l'échantillon à travers un tamis de 70 microns afin d'obtenir une suspension cellulaire neuronale claire en utilisant la mise en place neuronale. Milieu complété avec 5 % de SBF pour la mise en culture. 150 microlitres de neurones sur le côté droit de la plaque MCP assemblée.

Une forte densité de neurones, car seuls les neurones qui s'attachent dans la zone de rétention cellulaire sont capables de faire pousser des axones à travers les canaux centraux vers l'autre côté du MCP assemblé. Le jour suivant, aspirez soigneusement le milieu de la zone d'ensemencement cellulaire de la chambre et remplacez le milieu d'ensemencement neuronal par un milieu de culture neuronal standard.

Milieu, ajoutez 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales ou GDNF du côté des astrocytes de la chambre. Cela crée un gradient chimique qui aidera à induire la sortie des axones depuis le côté neuronal à travers les canaux centraux du MCP assemblé. Deux jours plus tard, surveillez la présence d'axones entrant dans le canal central.

Une fois que les axones pénètrent dans le canal central, ils rejoignent généralement l'autre côté en moins d'un jour. Les axones restent normalement intacts pendant au moins une semaine après avoir atteint l'autre côté. J'ai dissocié le cerveau de souris P1 à P3 pour ensemencer des astrocytes dans des boîtes de 10 centimètres revêtues de polyuréthane.

En culture, les cellules reconstituent le milieu de culture des astrocytes quotidiennement pendant les deux jours suivants, puis tous les trois jours après sept jours, lorsque les astrocytes ont formé une monocouche confluente à 90 %. Récoltez les cellules à l’aide de trypsine. Environ cinq jours après la mise en place des neurones, aspirez le GDNF. Ensuite, ensemencez 150 microlitres des astrocytes resuspendus dans le côté gauche du MCP assemblé. Lorsque les axones sont sur le point d’entrer ou viennent juste d’entrer dans le côté gauche du MCP assemblé après la resemis des astrocytes, ils interagissent directement avec les astrocytes, soit par contact axonal direct, soit par libération de facteurs solubles.

Surveillez l'attachement des astrocytes à la zone de rétention cellulaire. Immunomarquez les cellules dans le système de co-culture compartimenté afin de visualiser des protéines spécifiques, comme celles impliquées dans l'interaction entre les axones et les astrocytes. Le système de co-culture de neurones et d'astrocytes compartimenté permet uniquement aux prolongements neuronaux, en particulier aux axones, d'interagir sélectivement avec les astrocytes.

Ici, nous décrivons l'activation transcriptionnelle induite par l'axone du transporteur de glutamate des astrocytes. Ces études utilisent des souris transgéniques, qui portent l'expression d'un rapporteur fluorescent EGF sous le contrôle du promoteur génomique GT un. Une forte densité de neurones est cultivée dans la zone de rétention cellulaire du MCPA assemblé ; la vue agrandie montre les axones traversant les canaux centraux et pénétrant dans l'autre côté, la coloration par la tubuline bêta trois révélant le cône de croissance de l'axone.

Le système MCP permet de surveiller les faisceaux d'axones pendant leur croissance à travers le canal central et leur entrée dans l'autre côté. La coloration immunohistochimique pour GT1 révèle les astrocytes présents du côté glial du système MCP. L'image montre ici un contact entre les axones et les astrocytes positifs pour GLT1.

L'expression du rapporteur EGFP corrèle avec l'activation du promoteur endogène de GT un, l'expression protéique et l'activité fonctionnelle. L'évaluation de l'activité du promoteur de GT un dans des astrocytes individuels en C deux montre une immunoréactivité GLT un significativement accrue dans un système de co-culture compartimenté. Importamment, le système MCP permet d'acquérir des images en lapse de temps afin de suivre les changements dynamiques.

Par exemple, ces données montrent une activation du promoteur GT un induite par l'axone avec des astrocytes GT un-EGFP et des neurones de type sauvage, un jour après la mise en culture des astrocytes. Très peu de fluorescence EGFP est observée. L'intensité EGFP augmente significativement 48 heures après le co-culture, lorsque les axones pénètrent bien dans la zone des astrocytes et entrent en contact direct avec ces derniers ici.

Le traitement par la quinine appliqué du côté neuronal du MCP assemblé a induit la mort cellulaire neuronale. Fait intéressant, il a également stimulé le retrait et la dégénérescence des axones ainsi que la diminution de la fluorescence EGFP axonale. Ces changements dynamiques de l'intensité de la fluorescence EGFP en réponse aux axones ont clairement démontré que l'activité du promoteur Astroglia GT1 est modulée par l'interaction avec les axones.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place le système de culture de base en utilisant la plateforme de culture microfluidique ; une fois maîtrisée, cette technique peut être correctement réalisée en quelques jours.