Etude de l'ADN à l'aide de Checkpoint dommages

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le point de contrôle de l'ADN endommagé en utilisant des extraits d'œufs de xip comme système modèle. Préparez d'abord un extrait à faible vitesse à partir d'œufs de xip. Ensuite, préparez de la chromatine de spermatozoïdes endommagée à l'aide d'approches induisant des lésions de l'ADN, telles que le MMS et la lumière UV.

Préparez également la structure imitant les lésions de l'ADN. Un a T 70 permet de déclencher le point de contrôle des lésions de l'ADN dans un LSE à l'aide de la chromatine spermatique endommagée ou d'un a T 70. En fin de compte, les résultats obtenus par immunotransfert peuvent fournir des informations sur le point de contrôle des lésions de l'ADN médié par un a TR dans l'extrait d'ovocyte de Xenopus.

Bonjour à tous. Je suis CH Y du département de biologie de l'UNC Charlotte. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment l'extrait de pus est utilisé comme système modèle pour étudier la signalisation des points de contrôle des dommages.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'instabilité dynamique, comme la manière dont le point de contrôle des dommages à l'ADN est activé. Ce protocole concerne la préparation de l'extrait d'œufs opus ainsi que des réactifs induisant le point de contrôle des dommages à l'ADN, et l'analyse du point de contrôle des dommages à l'ADN et de xap. Ces techniques sont adaptables à diverses approches induisant des dommages à l'ADN, notamment la 4-NQO et l'étoposide.

Pour étudier le point de contrôle de l'ADN, commençons. Pour préparer les femelles de xap lay de ces grenouilles par injection sous-cutanée, injecter 100 unités de PMSG dans les sacs lymphatiques dorsaux. Après avoir attendu au moins deux jours suivant la préparation, induire la ponte en injectant à chaque grenouille préparée 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine par voie sous-cutanée dans le sac lymphatique dorsal. Incuber les grenouilles injectées pendant 14 à 20 heures dans des seaux séparés contenant deux litres de solution de Ringer modifiée de Marx.

Retirez les grenouilles des seaux et versez la solution MMR jusqu'à ce qu'il en reste environ 100 millilitres. Transférez ensuite les œufs des seaux dans un bécher de 250 millilitres. Désenrobez les œufs en ajoutant environ toutes les 30 secondes 100 millilitres de cystéine à 2 %, pH 7,8. Agitez doucement les œufs à l'aide d'une pipette Pasteur en verre inversée de 0,7 centimètre de diamètre, puis videz et remplacez deux fois par de la cystéine fraîche.

Le processus de décapage sera terminé dans environ cinq à quinze minutes. Lorsque les œufs forment une couche plus condensée au fond du bécher, après avoir éliminé la solution de cystéine, rincez les œufs trois fois avec une solution 0,25 XMMR. Agitez les œufs à l’aide d’une pipette en verre et examinez-les pour repérer les œufs blancs gonflés défectueux, qui ont tendance à s’accumuler au centre du bécher.

Retirez les mauvais œufs à l’aide d’une pipette Pasteur. Ensuite, lavez les œufs trois fois avec du tampon de lyse pour œufs. Éliminez tous les œufs défectueux supplémentaires, puis versez les œufs dans un tube Falcon de 14 millilitres.

Compacter les œufs par centrifugation pendant 55 secondes à 188 fois G. À l’aide d’une centrifugeuse clinique de table équipée d’un rotor à godets oscillants, éliminer l’excès de liquide au-dessus de la couche d’œufs. Ensuite, pour chaque millilitre d’œufs compactés, ajouter 0,5 microlitre d’aprotinine, de leptine ou d’AL à 10 milligrammes par millilitre, ainsi que 0,5 microlitre de cytokine B ou cyto B à 5 milligrammes par millilitre, puis centrifuger les œufs à 16 500 fois G pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. À l’aide de la centrifugeuse ultrarapide Sarva RC six plus munie d’un rotor HB six à godets oscillants, après centrifugation, les échantillons se fractionnent en trois couches dans le tube : l’extrait lipidique et le pigment de jaune d’œuf, de haut en bas respectivement. Perforer le côté du tube Falcon dans la partie inférieure de la couche intermédiaire d’extrait à l’aide d’une aiguille de calibre 21.

Retirer soigneusement l'aiguille car l'aiguille de ponction pourrait être obstruée par du plastique. Insérer une nouvelle aiguille de calibre 21 fixée à une seringue d'un millilitre dans le site de ponction. Pour recueillir l'extrait.

Aspirez lentement l'extrait en évitant les bulles d'air et la contamination par les couches lipidique et de pigments de jaune. Transférez les extraits dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre refroidi. Pour chaque millilitre d'extrait d'œuf, ajoutez 10 microlitres de 10 milligrammes par millilitre.

Cycloheximide : un microlitre de 10 milligrammes par millilitre. Une pronine leptine, un microlitre de cinq milligrammes par millilitre d'une cytokine B, un microlitre d'1 molaire de DTT et 0,33 microlitre de 10 milligrammes par millilitre. Le mélange est effectué en retournant délicatement l'extrait d'œuf au moins 10 fois. Toutefois, l'extrait à faible vitesse doit être utilisé dans les quatre heures, car la qualité de l'extrait d'œuf lyophilisé (LSE) est altérée.

Après quatre heures ou après un dégel complet, dissolvez les deux oligonucléotides synthétiques dans de l'eau à une concentration de deux microgrammes par microlitre. Ajoutez 100 microlitres de chaque oligonucléotide dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et incubez pendant cinq minutes dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius. Retirez le bloc chauffant contenant le tube avec une solution d'oligonucléotides, laissez refroidir à température ambiante, puis prélevez des aliquotes de 10 microlitres à stocker à moins 20 degrés Celsius.

L'échantillon d'AL est désormais un duplex A T 70 à une concentration finale de deux microgrammes par microlitre. Préparez de la chromatine de spermatozoïdes normale selon la méthode décrite par Tudor et Walter jusqu'à 0,5 millilitre de chromatine. Ajoutez 5,5 microlitres de MMS à 9,1 molaire.

Placer le tube d'échantillon sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 30 minutes en utilisant la centrifugeuse clinique IE CCL deux avec rotor à godets oscillants et adaptateurs de tubes. Centrifuger l'échantillon à 686 ×g pendant 10 minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant et laver le culot dans 0,5 millilitre de tampon X contenant de la B-S-A-D-T-T-A proine et de la leptine.

Répétez ce processus trois fois et resuspendez le culot dans 0,5 millilitre. Tampon x. Déterminez la concentration de chromatine spermatozoïdaire à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, diluez l'échantillon à 100 000 spermatozoïdes par microlitre et conservez des aliquotes de cinq microlitres à moins 80 degrés Celsius. Ajoutez la quantité souhaitée de chromatine de spermatozoïdes normale à la surface d'un morceau de parafilm et placez l'échantillon dans un appareil de réticulation UV. Réglez le paramètre d'énergie souhaité et commencez à endommager la chromatine des spermatozoïdes par lumière UV.

Utilisez immédiatement la chromatine de spermatozoïdes traitée aux UV pour induire un point de contrôle de l'endommagement de l'ADN dans l'extrait préparé à faible vitesse. Mélangez 50 microlitres d'extrait à faible vitesse (LSE), un microlitre de mélange énergétique et deux microlitres de chromatine de spermatozoïdes endommagée. Incubez la réaction à température ambiante pendant 90 minutes, en veillant à agiter doucement le tube toutes les 10 minutes, et ce, pendant au moins 30 minutes.

Incubation : déposer un microlitre de mélange réactionnel sur une lame de microscope et ajouter un microlitre de solution de désintégration nucléaire. Placer une lamelle et vérifier la formation des noyaux au microscope à fluorescence. Généralement, des noyaux sphériques se forment après 30 minutes d'incubation, indiquant que la réplication de l'ADN a commencé.

Évaluer également 10 microlitres du mélange réactionnel par immunotransfert en utilisant des anticorps anti-check one. Combiner 50 microlitres de LSE, un microlitre de mélange énergétique et 1,6 microlitre de stock de toto mycin dans un tube de microcentrifugeuse. Puis ajouter 1,25 microlitre soit de deux microgrammes par microlitre, d'un duplex ADN T 70, soit de l'eau pour le témoin négatif.

Incuber les réactions à température ambiante pendant 90 minutes et secouer délicatement les tubes à réaction toutes les 10 minutes. Ajouter ensuite 10 microlitres du mélange réactionnel dans 90 microlitres de tampon d'échantillonnage pour l'analyse western blot de la protéine TR check one. La chromatine des spermatozoïdes endommagée ou la structure imitant des lésions de l'ADN déclenchent efficacement un point de contrôle des dommages à l'ADN médié par TR check one dans le système d'extrait d'œuf xop, par comparaison avec le contrôle induit par le MMS.

Vérifiez une phosphorylation sur la sérine 344, qui est un indicateur de l'activation de la kinase TR. De même, une T 70, en tant que structure imitant un dommage de l'ADN, déclenche également la phosphorylation de la check one. Une fois la préparation de LSE maîtrisée, elle peut être réalisée en environ une heure.

Étant donné que la qualité de l'extrait diminue après environ quatre heures, la rapidité et l'efficacité sont essentielles. Ces méthodes peuvent être associées à d'autres approches afin de répondre à des questions cruciales concernant la signalisation du point de contrôle de la réponse aux dommages de l'ADN. Par exemple, un appauvrissement immunologique peut être réalisé pour tester si une protéine cible est nécessaire au point de contrôle de la réponse aux dommages de l'ADN.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier le point de contrôle de la lésion de l'ADN en utilisant un extrait de pus comme système modèle. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.