La micro-injection d'insuline de l'hippocampe et

L'objectif général de cette procédure est de mesurer le métabolisme hippocampique pendant des tests comportementaux. Cela est réalisé en préparant chirurgicalement un animal habitué à la manipulation, équipé d'une canule guide pour microdialyse. Le jour du test, une sonde de microdialyse est insérée dans la canule et le débit du système PERFUSE eight est vérifié.

Ensuite, on laisse la sonde s'équilibrer pendant que l'animal est placé dans une chambre de contrôle. En fin de compte, des méthodes analytiques appropriées, par exemple une réaction de glucose oxydase, NADP, N-A-D-P-H et une analyse fluorimétrique, si la mesure du glucose est utilisée pour indiquer le niveau de métabolisme et/ou de libération neurochimique tout au long de la période d'essai. L'un des aspects les plus délicats de cette technique est le soin nécessaire lors de la manipulation du tube de microdialyse, les animaux ayant souvent tendance à le mâchonner ou à emmêler les lignes si l'on n'y prend pas garde.

Ainsi, la première fois que j'ai utilisé la microdialyse hippocampique pendant des tests comportementaux remonte à mes travaux de thèse, et nous souhaitions vérifier si les modèles existants concernant l'apport de glucose étaient effectivement compatibles avec les données psychologiques connues sur l'amélioration de la mémoire par le glucose. Cette méthodologie nous a permis de démontrer qu'en réalité, les modèles existants du glucose appliqués au cerveau étaient totalement erronés.

Suivant les procédures chirurgicales standard, préparez l'animal, exposez le crâne et percez des trous pour la mise en place de la canule. Insérez une canule aux coordonnées prédéterminées, puis abaissez-la lentement jusqu'à la profondeur cible. Une fois correctement positionnée, fixez la canule en place à l'aide de ciment dentaire.

Utilisez un fil de suture chirurgical stérile pour fermer la plaie si nécessaire. Enfin, utilisez un stylet pour maintenir la perméabilité de la canule. Ensuite, préparez le PERFUSE huit à utiliser pour la microdialyse.

Il convient de noter que la composition précise du fluide est essentielle pour obtenir des résultats optimaux. Le jour des tests, l'albumine sérique bovine (BSA) doit être ajoutée et entièrement dissoute. Après préparation, le PERFUSE huit doit être filtré à l'aide d'un filtre de 0,2 micron.

Ensuite, préparez le traitement qui sera administré au cerveau, le cas échéant, en utilisant un aliquot du LEC A préparé. Ici, l'insuline est préparée pour être délivrée dans l'hippocampe. Une sonde de microdialyse et une ligne fraîches doivent être préparées la veille de l'essai.

Créez deux lignes distinctes pour l'entrée et la sortie. Utilisez un tube PE 50 pour relier deux morceaux de tube FEP d'un mètre de long et veillez à ce qu'il y ait un espace mort minimal entre les lignes. Les tubes doivent être coupés comme indiqué afin de former des extrémités inclinées, facilitant ainsi leur insertion dans les raccords PE 50.

Connectez le tube d'entrée à une seringue Hamilton d'un millilitre remplie d'eau déionisée stérile filtrée et fixez la sonde à l'autre extrémité afin de permettre à l'animal de se déplacer librement pendant la prise de mesures. Connectez les lignes d'entrée et de sortie à un rotatif à deux canaux. Ensuite, reliez le tube de sortie à la pompe et faites-la fonctionner à 1,5 microlitre par minute jusqu'à ce que vous observiez de l'eau déionisée sortir par le tube de sortie de la sonde.

Éteignez la pompe et reliez l'autre ligne entre le tube de sortie et un tube de collecte d'échantillon. Faites circuler cinq millilitres à travers le tube et placez la sonde dans un flacon contenant de l'eau déionisée stérile pendant la nuit, en veillant à ce que la pointe de la sonde reste toujours humide. 24 heures avant le test, conditionnez le sujet d'essai en retirant le stylet factice et en insérant une sonde de microdialyse utilisée uniquement à cet effet.

Pendant 10 minutes ensuite, remplacez le stylet factice et remettez le rat dans sa cage. Sinon, utilisez une sonde neuve à cette étape et laissez-la en place sans la retirer jusqu'au moment des mesures. Le jour suivant.

Le jour du microdialyse, remplir la seringue Hamilton et le flacon de scintillation avec du LEC filtré et laisser la pompe s'équilibrer pendant une heure. Si nécessaire, remplir une deuxième seringue Hamilton avec le traitement préparé et la placer dans la pompe à seringue. La clé du succès de cette procédure consiste à rester calme et à manipuler l'animal de manière très minutieuse.

Restez donc calme, déplacez-vous lentement et avec précision, et surtout, entraînez-vous. Une fois l'équilibrage terminé, retirez le stylet factice et insérez délicatement la sonde de microdialyse équilibrée dans le cerveau du rat par l'intermédiaire de la canule. Placez le rat dans une boîte en plastique transparente contenant un peu de la litière de son logement habituel.

Veillez à équilibrer le tube. Fixez un tube microcentrifuge de 1,6 millilitre rempli d'eau au tube situé à l'extérieur de la cage de manière à ce que la gravité maintienne les lignes de microdialyse sans pli mais sans tension. Laissez la sonde et le rat s'équilibrer pendant deux heures.

Au début de cette période, vérifiez que le flux de Perfuse huit n'est pas obstrué. Pour ce faire, recueillez l'effluent de PERFUSE huit pendant une durée définie et pesez l'échantillon afin de confirmer que le volume attendu sort bien du système avant de prélever des échantillons. Assurez-vous que la corrélation entre la dialyse de l'échantillon et son prélèvement est correctement calculée.

Ici, nous avons un volume de 30 microlitres entre la sonde et le point de collecte, à un débit de 1,5 microlitre par minute. Un délai de 20 minutes existe entre le moment où l'échantillon quitte le cerveau et celui où il est collecté. Après la période d'équilibration, recueillir au moins trois échantillons pendant que le rat est au repos dans sa chambre d'habitation.

Pour établir une ligne de base stable de mesures avant les tests comportementaux, planifiez soigneusement le moment de l'administration de votre traitement au cerveau. Ainsi, dans ce dispositif où nous avons un volume de 30 microlitres entre l'extrémité de la seringue et la sonde introduite dans le cerveau de l'animal, nous changeons la seringue de traitement pour la remplacer par la solution de traitement perfusée huit minutes auparavant. Nous voulons que le traitement parvienne à l'hippocampe pour changer les seringues.

Débranchez simplement la ligne d'entrée de la seringue de perfusion de contrôle PERFUSE huit et raccordez-la rapidement à la seringue de perfusion du traitement PERFUSE huit. Cette opération ne doit pas prendre plus de cinq secondes afin d'éviter toute interruption du flux PERFUSE huit. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air, qui pourraient réduire l'efficacité au moment approprié.

Après l'administration du traitement, déplacez délicatement le rat vers l'appareil choisi pour les tests comportementaux. Ici, l'alternance spontanée est mesurée sur un labyrinthe en forme de croix. Laissez l'animal explorer librement le labyrinthe pendant 20 minutes.

Enregistrez la séquence et le chronométrage des bras du bélier soit à l’aide d’un enregistrement vidéo, soit manuellement pour prélever des échantillons. Pendant cette période, déplacez le tube de sortie vers un nouveau tube de collecte. Toutes les cinq minutes, maintenez le tube de manière à ce qu’il puisse se déplacer librement.

Il ne doit pas entraver le déplacement du rat ni se déplacer devant l'animal, et doit rester immobile afin que ses mouvements n'affectent pas le comportement du rat. Après le test, retirer délicatement le rat du labyrinthe et le ramener dans la chambre de contrôle. Poursuivre la collecte des échantillons de microdialyse pendant au moins quatre prélèvements afin de couvrir la période de récupération suivant l'exécution de la tâche.

Après avoir prélevé les échantillons souhaités, retirez délicatement la sonde de la tête de l'animal et placez-la dans un flacon de stockage. Ramenez l'animal dans sa cage d'origine et observez attentivement tout changement post-expérimental de santé ou de comportement. Enfin, rincez le tube en passant à une seringue contenant une solution de catho afin d'empêcher la croissance de micro-organismes.

Cet exemple montre une diminution de glucose dans le liquide céphalorachidien hippocampique associée à une tâche. La zone grise représente la période pendant laquelle l'animal a passé dans le labyrinthe. La ligne violette montre le glucose hippocampique chez des animaux sans test de labyrinthe, tandis que la ligne rouge représente des animaux effectuant la tâche d'alternance spontanée de l'avant-bras.

La ligne orange montre les mesures effectuées chez des animaux réalisant la version plus facile de cette tâche à trois bras. Les variations du glucose hippocampique et du lactate après l'administration d'insuline sont observées ici. Remarquez que ces variations sont observées sans aucun test comportemental, et reflètent donc l'effet de l'insuline seule dans des conditions de base.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est très important de rester calme. Les rats peuvent percevoir le stress de l'expérimentateur et devenir agités, ce qui peut à la fois rendre la manipulation beaucoup plus difficile et probablement fausser vos résultats. Cette combinaison de techniques a permis une investigation neurochimique précise des processus comportementaux.

Des techniques similaires sont désormais également utilisées chez les patients humains. Par exemple, des patients épileptiques porteurs d'électrodes implantées afin de localiser le foyer de leurs crises peuvent également avoir une canule de microdialyse implantée pour permettre des mesures métaboliques.