Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

L’objectif général de l’expérience suivante est de délimiter les cellules de Schwan uniques à la jonction neuromusculaire à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole utilise des souris transgéniques qui expriment la GFP dans les cellules de Schwan terminales et axonales. La première étape consiste à disséquer un explan de muscle nerveux.

Ensuite, un blanchiment séquentiel de toutes les cellules de Schwan sauf une à une jonction neuromusculaire donnée est effectué, révélant la morphologie d’une seule cellule. Enfin, une carte à faible consommation d’énergie est créée. Le tissu est fixé et utilisé pour l’immunohistochimie afin de visualiser n’importe quel marqueur souhaité par rapport à la cellule de Schwan non blanchie restante.

Les résultats montrent la morphologie d’une cellule unique et, si nécessaire, une microscopie à intervalle de temps ou une analyse de colocalisation immunohistochimique dans un tissu fixe basée sur l’imagerie confocale. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la morphologie et du territoire des cellules de cygne uniques à la jonction neuromusculaire. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les lignées cellulaires, les tranches de cerveau vivant ou même d’autres espèces comme le poisson-zèbre.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il faut une certaine expérience pour identifier une jonction neuromusculaire suffisamment superficielle et ne pas perdre de temps sur des structures qui n’en valent tout simplement pas la peine Avant de commencer la chirurgie, oxygénez et refroidissez la solution de sonnerie pendant au moins 15 minutes. Placez une boîte de culture tissulaire de 15 centimètres avec de la glace sous un microscope. Couvrez-le d’une plaque métallique.

Placez la boîte de culture tissulaire de 10 centimètres remplie de solution de ringer sur la plaque métallique. Placez la pierre d’oxygénation dans la solution. L’étape suivante consiste à sélectionner une souris dont les cellules de cygne et les axones sont étiquetés de différentes couleurs.

Une fois que la souris a été euthanasiée, vaporisez-la d’éthanol Pour éviter la contamination de la fourrure, utilisez de grands ciseaux pour faire une incision médiane sur le sternum et deux incisions parallèles au bord inférieur de la cage thoracique. Retirez la peau, ouvrez l’abdomen et disséquez les muscles pectoraux avec des incisions près de l’insertion musculaire au niveau du sternum. Utilisez une pince pour tenir le cartilage xiphoïde et coupez le diaphragme juste en dessous du cartilage xiphoïde.

Disséquez le diaphragme le long de ses insertions costales. Mouillez de temps en temps le tissu avec une solution de ringer pour éviter le dessèchement à l’aide de pinces pour maintenir la cage thoracique par le processus xiphoïde. Commencez à couper les côtes de la colonne vertébrale le plus près possible de leurs insertions.

Les coupes gauche et droite doivent converger au-dessus du cœur vers l’œil de poupe du manubrium. Essayez d’éviter de couper les principaux vaisseaux sanguins, en particulier les veines sous-clavières. Pour une meilleure visibilité.

Soulevez doucement la préparation tout en maintenant le processus xiphoïde avec une pince. Faites maintenant une coupe transversale juste en dessous de l’œil de poupe du manubrium pour retirer le thorax et transférez l’explan X dans le plat de 10 centimètres avec la solution de sonnerie préparée. Placez le plat sur la plaque métallique et le plat rempli de glace sous le microscope sous le microscope.

À l’aide de petits ciseaux à ressort, retirez les restes du thymus, de la plèvre, du diaphragme et des muscles pectoraux. À l’aide de petits ciseaux à ressort, disséquez toutes les côtes qui ne s’insèrent pas au niveau du sternum. Coupez le tissu entre les côtes.

Cela permet à l’explan X de s’adapter à un plat revêtu d’une protection SIL de 3,5 centimètres. Maintenant, à l’aide de huit à dix épingles minucin raccourcies, épinglez l’explication X, en évitant le muscle triangulaire de l’œil de poupe indiqué ici. Deux broches doivent traverser les parties cartilagineuses du sternum, et deux broches doivent traverser les parties cartilagineuses plus molles entre les côtes.

Évitez de percer les côtes sous ou près du muscle triangulaire. Continuez à épingler jusqu’à ce que les côtes soient un peu écartées. Fixation du muscle dans une position légèrement étirée.

Transférez la parabole de 3,5 centimètres recouverte d’un rebord dans un microscope confocal équipé d’un laser Argonne et d’objectifs d’immersion dans l’eau. Pour une microscopie time-lapse, insérez le plat revêtu d’un pare-couche de 3,5 centimètres dans l’anneau chauffant. Installez un système de superfusion et installez une sonde de température.

Assurez-vous que rien ne touche l’explan, le bord du plat ou l’enrobage du cigare. Pour la microscopie time-lapse, chauffez l’explan X, mais pour le blanchiment des cellules de Schwan, la température ambiante est meilleure. Maintenant, avec un objectif aérien Forex, observez le motif d’innervation du muscle triangulaire de l’œil de poupe et trouvez la bande d’extrémité de l’œil de poupe triangulaire.

Passez à l’objectif du cône de trempage 20 x et commencez à rechercher des régions superficielles dans les zones de la bande nplate. Les côtes sus-jacentes et proches des nerfs intercostaux sont de bonnes régions candidates. Passez à l’objectif à cône de trempage 100 x ou 60 x pour vérifier les individus et les mjs.

Idéalement, localiser une NMJ recouverte de plusieurs cellules de Schwan qui est localisée très superficiellement est de trouver leur jonction neuromusculaire superficielle et plate. Étant donné que la jonction neuromusculaire est constituée de fibres musculaires cylindriques innovantes, elle a tendance à être enroulée autour de la fibre et les mains n’ont souvent pas l’angle parfait pour l’imagerie. Sélectionnez uniquement les jonctions neuromusculaires superficielles, plates et à la surface, maintenant à l’aide d’un objectif à ouverture numérique 100 x 1,0.

Avec un zoom de 2,5, obtenez une image confocale de la JNM. Ces paramètres fournissent une taille de pixel d’environ 0,1 micromètre, assurant un échantillonnage spatial correct selon le critère de Nyquist. Maintenant, photoblanchissez la cellule de Schwan en plaçant le faisceau laser de 488 nanomètres au centre du noyau en utilisant la puissance maximale pendant cinq secondes.

Ensuite, recentrez sur la cellule et jugez du résultat de la décoloration. Si nécessaire, répétez l’étape de blanchiment jusqu’à ce que les niveaux de GFP soient réduits à des niveaux proches de ceux de l’arrière-plan, puis acquérez une autre image. Il est essentiel de s’assurer que la région blanchie est en dehors de tout chevauchement entre deux cellules.

S’il y a chevauchement, le blanchiment dans une deuxième cellule sera évident. Lorsqu’elle est bien faite, cette approche aboutit à une cellule finale clairement révélée, souvent avec une morphologie assez surprenante que l’on n’aurait pas pu deviner avant de commencer la procédure. Répétez le processus de blanchiment jusqu’à ce que toutes les cellules de Schwan sauf une soient blanchies.

La dernière cellule de Schwan non blanchie convient à la microscopie confocale time-lapse. Après avoir terminé l’imagerie en accéléré, faites une carte de ces njs en prenant une image à 100 x sans zoom, puis des images de la région à l’aide de l’objectif 20 x et répétez le processus à l’aide de l’objectif quatre x. Cette carte est nécessaire pour trouver le njs suite à la chimie immunohistique d’un muscle fixe.

Après l’imagerie et le blanchiment, décollez l’explan et transférez-le dans un tube de 50 millilitres avec au moins 15 millilitres de PFA à 4 %. Ensuite, placez le tube sur de la glace pendant une heure après avoir refroidi le mouchoir pendant une heure, rincez-le avec de la glycine à 0,1 molaire dans du PBS pendant au moins 10 minutes. Transférez ensuite l’explan fixe dans une boîte de culture tissulaire recouverte d’un garde de soie de cinq centimètres remplie de PBS 0,01 molaire et préparez-vous à disséquer davantage l’explan.

Tout d’abord, découpez une forme trapézoïdale avec un côté parallèle au sternum et l’autre à travers les transitions osseuses et cartilagineuses. Celui-ci contient le muscle triangulaire à sa surface. Ensuite, retirez les côtes inférieures avec une coupe horizontale ou transsternale afin que l’extrémité du dorlotement du muscle triangulaire soit librement accessible.

Insérez maintenant une aiguille hypodermique comme une goupille dans la partie supérieure du trapèze. Ensuite, retirez le muscle triangulaire. Tout d’abord, utilisez une pince pour tenir doucement le coin du dorlotement du muscle.

Et deuxièmement, utilisez une seringue et une aiguille comme un micro-scalpel pour couper parallèlement au plan de la paroi thoracique. Une fois que la partie dorlotée du muscle est relâchée, insérez une autre aiguille sous le muscle à travers la paroi thoracique pour immobiliser la préparation. Tout en coupant les insertions de tissu conjonctif, retirez le muscle du thorax en tirant doucement avec la pince.

Enfin, retirez les restes de graisse et de vaisseaux sanguins à l’aide d’une pince. Attention à ne pas arracher les nerfs. Le muscle triangulaire est maintenant prêt pour l’immunohistochimie.

Un explan triangulaire de l’œil stern utilisant des souris exprimant la GFP sous le promoteur PLP a été préparé pour la visualisation ex vivo des cellules de Schwan. Les axones pourraient être visualisés simultanément en croisant P-L-P-G-F-P à une cuisse OFP trois souris. En utilisant le protocole décrit, la morphologie des cellules de Schwan terminales uniques a été révélée avec des détails étonnamment élevés en blanchissant les deux cellules de Schwan terminales voisines et les premières cellules de Schwan axonales en direct.

Les jonctions neuromusculaires imagées ont été retracées à l’aide de la carte créée au préalable et numérisées à haute résolution dans le tissu fixé après microscopie confocale en direct, l’explan de poupe triangulaire a été fixé et coloré. On voit ici les récepteurs de l’acétylcholine marqués avec du toin bungalow couplé à Alexa 6 47 en rouge et des vésicules synaptiques marquées avec un anticorps antis synaptophysine en blanc. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser la morphologie des cellules uniques, qui étaient initialement toutes marquées par la même protéine fluorescente et emballées trop densément pour se résoudre individuellement.

Notre exemple montre la jonction neuromusculaire, mais il existe de nombreuses autres applications potentielles.