Name: Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez la technique de photoblanchiment séquentiel pour visualiser la morphologie de cellules de Schwann individuelles à la jonction neuromusculaire chez la souris transgénique GFP. Cette méthode combine microscopie confocale et immunohistochimie.

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Nous tenons à remercier Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi et Kristina Wullimann d&#39;assistance technique excellente. Nous remercions W. Macklin pour fournir Plp-GFP souris. TM est soutenu par l&#39;Institut des hautes études (Technische Universität München), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), par la Alexander-von-Humboldt-Stiftung et par l&#39;organisme national de financement («Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) dans le cadre d&#39;ERA-NET NEURON &quot;iPSoALS» et «2-photons d&#39;imagerie». MC et MB sont pris en charge par le Center for Integrated Protein Science (Munich). PM a été soutenue par la Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explantation (Figure 1) Timing: 15 min. <ol><li> Préparer les instruments chirurgicaux: 2 paires de pinces, 1 paire de ciseaux, 1 paire de ciseaux à ressort, 1 boîte de culture tissulaire (10 cm). Pré-bulles (minimum 15 min) refroidie (4 ° C) une solution de Ringer avec 5% de CO 2/95% O 2. Remplir 15 cm boîte de culture tissulaire avec de la glace et le couvrir avec une plaque métallique. Préparer microscope à dissection et placez le plat de 15 cm avec de la glace sous le coup de dissection afin de refroidir l&#39;explant lors de la dissection. </li><li> Lethally anesthésier la souris par une surdose d&#39;isoflurane (ou toute autre méthode approuvée du sacrifice). Vaporiser la souris avec de l&#39;éthanol à 70% pour prévenir la contamination de la fourrure de l&#39;explant. Pour le SC de blanchiment, nous avons utilisé des souris Plp-GFP, qui peuvent être croisées pour Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 pour la visualisation simultanée de l&#39;axone. </li><li> En utilisant la paire de grands ciseaux, faire une incision médiane dela peau de la poitrine et deux incisions parallèles à l&#39;arête inférieure de la cage thoracique. </li><li> En utilisant la paire de grands ciseaux, enlever la peau, ouvrir la paroi abdominale, et faire des incisions parallèles à la cage thoracique tout le chemin du retour à la colonne vertébrale. Puis hors disséquer les muscles pectoraux en faisant des incisions à proximité de l&#39;insertion du muscle au niveau du sternum. </li><li> Couper le diaphragme ouvert juste en dessous du cartilage xiphoïde et disséquer au large de la membrane le long de ses insertions costales. </li><li> De maintien de la cage thoracique par la pointe du sternum avec un ensemble de pinces, de commencer à couper les nervures de la colonne vertébrale, le plus près possible de leurs insertions. Les réductions de gauche et de droite devraient converger au-dessus du cœur vers le manubrium sternal. Essayez d&#39;éviter de couper les vaisseaux sanguins majeurs (en particulier les veines sous-clavières). Meilleure visibilité est obtenue en soulevant doucement la préparation tout en maintenant sur le processus xiphoïde avec une pince. </li><li> Faites une coupe transversale juste au-dessous du manubrium sternalet transférer l&#39;explant dans le plat de 10 cm avec 5% de CO refroidi 2/95% O 2-bulles solution de Ringer. Placer la capsule 10-cm sur la plaque métallique qui recouvre la cuvette 15-cm de culture de tissu rempli de glace. Toutes les autres étapes devraient se faire sous le microscope de dissection. </li><li> Avec des ciseaux petit ressort enlever les restes du thymus, de la plèvre, membrane (à l&#39;intérieur) et les muscles pectoraux (en dehors; figure 1B-D). </li><li> Pour monter l&#39;explant dans le plat de 3,5 cm, disséquer off toutes les nervures qui ne sont pas insérer au sternum. Le mieux est d&#39;utiliser des ciseaux à ressort petites et couper le tissu entre les nervures (figure 1E). </li><li> Epingler la triangularis sterni nerf-muscle explant dans le Sylgard enduit de 3,5 cm boîte de culture tissulaire en utilisant des épingles minuties (raccourci à &lt;4 mm; figure 1G). Deux broches doivent passer par cartilagineux (blanc) parties du sternum. Insérer au moins deux repères à travers les nervures à la fois sur le côté gauche et droit de la ièmee explant viser les parties molles cartilagineux et en évitant les nervures sous ou à proximité du muscle triangularis. Les broches sont plus utilisés, le mieux (nous utilisons habituellement 8-10). Comme vous coincer la préparation, assurez-vous que les nervures sont peu répandue, la fixation du muscle dans une position légèrement tendus. </li><li> En option: Visualisez les sites synaptiques contenant récepteurs de l&#39;acétylcholine en ajoutant bungarotoxine couplé à des colorants Alexa (concentration de 0,8 pg / ml dans 5% de CO 2/95% O 2-bulles solution de Ringer). Incuber explant coincé dans Sylgard plat couché pendant 15-20 min à température ambiante puis laver plusieurs fois avec 5% de CO 2/95% O 2-bulles solution de Ringer. </li></ol> 2. SC blanchir et option Time-lapse de microscopie (figure 2) Timing: 30 - 45 min + option 1 à 5 h pour le laps de temps. <ol><li> Transfert de 3,5 cm Sylgard enduit plat pour un esprit microscope confocal équipéh un laser argon (488 nm de longueur d&#39;onde) et les objectifs à immersion à eau (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA et 100x, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA). </li><li> En option pour la microscopie time-lapse: Insérer 3,5 cm Sylgard enduit plat dans l&#39;anneau de chauffage, installer un système de surfusion et la sonde de température (figure 2A). Assurez-vous qu&#39;aucun d&#39;entre eux touchent l&#39;explant, le bord de l&#39;assiette ou le revêtement Sylgard. Chauffer l&#39;échantillon à 33-35 ° C. Pour le SC blanchiment sans time-lapse, la température ambiante est meilleure, car les cellules afficher moins dynamique entre les étapes de blanchiment. </li><li> Avec un objectif 4x observer air modèle innervation du muscle sterni triangularis et trouver triangularis bande flasque manubrium. Mettez à tremper 20x-cône objectif et commencer à regarder pour les régions superficielles dans la bande de flasque (côtes zones sus-jacentes sont de bons candidats). Modifier l&#39;objectif 100x ou 60x trempage cône objectif de vérifier JNM individuels. Idéal est un NMJ qui est couvert par plusieurs SC et est situé très superficially (figure 2B). Si vous effectuez imagerie time-lapse après le blanchiment, sélectionnez jusqu&#39;à 3 JNM qui sont relativement proches les unes pour augmenter le rendement. </li><li> Acquérir une image confocale de la jonction neuromusculaire avant photo-blanchiment SC individuelles (figure 2B). (Pour l&#39;imagerie haute résolution, par exemple sur un microscope Olympus FV1000, utiliser un 100x, 1,0 NA objectif zoom et 2,5, ce qui conduit à de Nyquist-échantillonnage limité de ~ 0,1 um par pixel.) </li><li> &quot;Park&quot; le faisceau laser de 488 nm au centre sur le noyau d&#39;un SC en utilisant la puissance maximale pendant 5 secondes (encore un modèle de balayage efficace dans une petite région d&#39;intérêt peut être utilisé, tel que la &quot;tornade scan&quot; sur un microscope Olympus; car nous utilisons un microscope confocal, le laser est focalisé dans les plans image-conjugués et, par conséquent, à 488 nm avec un objectif de 1,0 NA, &lt;0,5 um de diamètre). Recentrer sur la cellule et le juge de blanchiment résultat. Si nécessaire, répétez étape de blanchiment à nouveau jusqu&#39;à ce que les niveaux de GFP sont de réduired à la quasi-fond les niveaux. Acquérir une image après le blanchiment (figure 2C). Il est essentiel de veiller à ce que la région blanchie est en dehors de tout chevauchement entre les deux cellules - s&#39;il ya chevauchement, de blanchiment dans une deuxième cellule sera évidente. </li><li> Répétez l&#39;étape ci-dessus jusqu&#39;à ce que tous sauf un sont blanchis SC (figure 2D-E). Le dernier «écrus» SC est adapté pour confocale microscopie time-lapse. Reconstruire des cellules individuelles par soustraction d&#39;images, par exemple en utilisant le logiciel Photoshop, pour délimiter seule morphologie SC et territoire (figure 2F). Soyez conscient du fait que la soustraction de deux mages ajoute du bruit (par exemple, en les important dans consécutifs &quot;couches&quot; dans Photoshop, puis définir le canal supérieur à la «différence» dans le menu déroulant en haut de l&#39;onglet canaux). Cela peut être contournée en utilisant le mode &quot;Dépoussiérer&quot; sur les canaux avant soustraction et de culture loin n&#39;importe quel fond qui ne veut évidemment pas provenir de lacellule blanchie. Pour optimiser le contraste, il peut être nécessaire d&#39;ajuster la luminosité des deux canaux dans le &quot;niveau&quot; fenêtre. L&#39;image résultante de la cellule blanchie est superposée à l&#39;image de l&#39;original d&#39;une synapse, pseudo-couleur dans une teinte unique et rendu transparent à la couleur sur le territoire de la cellule blanchie dans l&#39;image d&#39;origine (à partir de cela pendant toute la dernière blanchie et , les cellules écrus l&#39;image affichée dans les résultats 2F Figure). </li><li> En option: Démarrer confocale microscopie time-lapse après le blanchiment tous sauf un SC. Prendre une photo à des intervalles fixes (par exemple toutes les 5 min à 10). Utiliser en tant que puissance laser faible que possible. Jusqu&#39;à 3 JNM peuvent être visualisés à la même session. </li><li> Faire une carte des JNM temps expiré en prenant une image à 100x sans zoom, puis des images de la région en utilisant 20x et objectifs 4x (figure 2G-I). Cette «carte» est nécessaire pour trouver JNM après immunohistochimie d&#39;un muscle fixe. </li><li> Pour l&#39;imagede traitement, de convertir des images individuelles dans les projections d&#39;intensité maximale et enregistrer au format TIFF. Mélanger tous les z-projetées points temporels dans une pile et aligner en xy, par exemple en utilisant le &quot;stackreg&quot; plugin 10 en Fidji (un package basé sur le logiciel libre ImageJ, National Institutes of Health). </li></ol> 3. Fixation et immunohistochimie (Figure 3) Timing: Nuit. <ol><li> Transférer l&#39;explant dans un tube de réaction de 50 ml contenant au moins 15 ml PFA à 4% en prenant soin de retirer les broches. Post-fixer la paroi thoracique antérieure contenant le muscle triangularis sterni pendant 1 heure sur la glace. Rincer le tissu fixe avec 0,1 M de glycine dans du PBS (pour étancher fixateur résiduel et donc de réduire de fond) pendant au moins 10 min. Les échantillons peuvent être conservés à ce point et exécutée plus tard. </li><li> Transfert explant fixe à un 10-cm Sylgard tissu enduit boîte de culture rempli de PBS 0,01 M. Découpez une forme trapézoïdale avec une siparallèlement au sternum de l&#39;autre à travers les transitions os-cartilage - contient le muscle triangularis sur sa surface. Enlever la partie inférieure côtes avec une horizontale (trans-sternale) découpé de telle sorte que l&#39;extrémité caudale du muscle triangularis peut être librement accessibles (figure 3A-D). </li><li> Insérer une aiguille hypodermique comme une broche dans la partie supérieure du trapèze (figure 3E). Utilisez une aiguille hypodermique attachée à une seringue de 1 ml et une pince pour retirer le muscle triangularis sur la surface doucement en maintenant un coin caudale du muscle et en utilisant l&#39;aiguille comme un micro-scalpel. Assurez-vous que les coupes sont faites parallèlement au plan de la paroi thoracique. Une fois la partie caudale du muscle est relâché, insérez une autre aiguille hypodermique comme une épingle en dessous du muscle à travers la paroi thoracique - ce immobilise la préparation et permet d&#39;exercer une légère traction sur le muscle en utilisant une pince (figure 3F). Comme vous coupez tiss conjonctifinsertions ue, &quot;peler&quot; loin le muscle du thorax. Couper dernière pièce jointe caudale avec des ciseaux à ressort. Retirer les restes de graisse et le sang des vaisseaux à l&#39;aide de pinces. Veillez à ne pas déchirer loin les nerfs. Remarque: Utilisez des ensembles d&#39;outils distincts et des plats pour travailler avec des tissus vivants et fixe. </li><li> Début immunohistochimie (en utilisant un protocole standard) en transférant des échantillons de tissu dans une solution de blocage pendant 1 heure sur un agitateur à température ambiante. Plus petit volume possible pour la coloration est de 200 ul en utilisant une plaque de 96 puits. </li><li> Appliquer un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage, 200 ul par puits, une nuit à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min. </li><li> Appliquer une anticorps secondaire pendant 1-2 heures à la température ambiante dilué dans une solution de blocage. </li><li> Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min. </li><li> Montez dans la lutte anti-fading support (par exemple Vectashield) et la lamelle. </li><li> Placer la lame sur une plaque de métal magnétique, aimant placer sur le dessusde l&#39;échantillon pour aplatir pendant quelques heures ou toute la nuit à 4 ° C. Sceller avec du vernis à ongles. </li></ol>

<ol><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li>
<li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li>
<li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li>
<li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode de blanchiment SC présenté ici est simple, rapide et polyvalent: (i) Il permet de révéler la morphologie unique SC et la dynamique par microscopie confocale basée sur un seul transgène - ce qui est un avantage non négligeable lorsque l&#39;on combine l&#39;approche avec par exemple des modèles de maladies qui nécessitent des allèles supplémentaires . (Ii) Le procédé est rapide, à partir de dissection de fixation peut être effectuée en une demi-journée. (Iii) Le nombre de demandes est large, car elle ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société (exemple) </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Une solution d&#39;éthanol à 70% (vol / vol) </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> en vaporisateur </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> tout autre anesthésique approuvé peut être utilisé pour l&#39;anesthésie mortelle </td></tr><tr><td> des souris transgéniques (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> être obtenue à partir de sources citées </td></tr><tr><td> microscope à dissection avec lumière froide éclairage </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> équipé d&#39;Schott KL LCD 1500 </td></tr><tr><td> pince #2 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> forceps n ° 5 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux, grand médicaux </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux, petite coudée à ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> en ligne réchauffeur </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> chauffage anneau de 3,5 cm de plats </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> système à deux canaux de contrôle de température </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Système de pompe superfusion </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> rempli de glace et recouvert par une plaque métallique </td></tr><tr><td> 10 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> avec une solution de Ringer oxygénée de </td></tr><tr><td> 3,5 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> rempli avec du Sylgard polymère </td></tr><tr><td> Sylgard polymère </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Kit élastomère silicone </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Olympe </td><td> FV1000 </td><td> avec de l&#39;argon laser </td></tr><tr><td> Tube de réaction de 50 ml </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% dans du PBS PFA </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Canule 0,5 x mm 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> seringue de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> anticorps synaptophysine </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> lapin </td></tr><tr><td> anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> Plaque de 24 puits </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 0,01 M </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glycine dans du PBS </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> lamelles </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositives </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Laboratoires Vecteur </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> épingles minuties × 10 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-20 </td><td> abrégée &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-bungarotoxine couplé à Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blocking Solution </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de sérum de chèvre normal </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% de sérum albumine bovine </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sonneur barboter avec 95% O 2/5% de CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM de NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM de CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 1 mM </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs spécifiques et des équipements. </td></tr></tbody></table>

séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Séquentielle photo-blanchiment constitue un moyen non invasif d&#39;étiqueter SC individuels à la jonction neuromusculaire. Le MNJ est le plus grand des synapses du système nerveux des mammifères et a servi comme directeur de modèle pour étudier la structure et la fonction synaptique. Dans souris terminaux JNM axone moteur former des sites de contact bretzel comme avec des fibres musculaires. L&#39;axone moteur et sa borne sont gainés par SC. Au cours des dernières décennies, plusieurs souris transgéniques ont été générés pour visualiser les neurones moteurs et de SC, par exemple Thy1-XFP 1 et PLP-GFP souris 2, respectivement. Le long des axones moteurs, myélinisantes SC axonales sont disposées en se chevauchant pas noeuds, séparés par des nœuds de Ranvier, afin de permettre la propagation saltatoire potentiel d&#39;action. En revanche, SC terminaux à la synapse sont spécialisés cellules gliales, qui surveiller et de promouvoir la neurotransmission, digérer les débris et les guides axones. JNM sont hermétique jusqu&#39;à une demi-douzaine non myelnaires SC terminaux - ceux-ci, cependant, ne peuvent pas être résolus individuellement par microscopie optique, car ils sont en contact direct de la membrane 3. Plusieurs approches existent pour visualiser individuellement SC terminaux. Aucun d&#39;entre eux sont impeccables, bien. Par exemple, le remplissage de colorant, où les cellules isolées sont empalé avec une micro-électrode de colorant remplie, nécessite détruire une cellule marqué avant de le remplir une seconde. Ce n&#39;est pas compatible avec la suite enregistrements time-lapse 3. Multi-spectrale &quot;Brainbow&quot; étiquetage des castes a été réalisé en utilisant l&#39;expression combinatoire des protéines fluorescentes 4. Cependant, cette technique nécessite la combinaison de plusieurs transgènes et est limitée par le profil d&#39;expression des promoteurs utilisés. À l&#39;avenir, l&#39;expression de &quot;photo-commutables&quot; protéines dans SC pourrait être encore un autre 5 alternative. Ici, nous présentons photo-blanchiment séquentiel, où les cellules individuelles sont blanchis, et leur image obtenue par soustraction. Nous croyonsque cette approche - en raison de sa facilité et la polyvalence - représente un ajout à la palette de technologies durables de la neuroscientifique, en particulier car il peut être utilisé in vivo et transférés à d&#39;autres types cellulaires, sites anatomiques ou des espèces 6. Dans le protocole suivant, nous détaillons l&#39;application de la séquence de blanchiment et après confocale time-lapse de microscopie à SC terminaux dans des explants musculaires triangularis manubrium. Cette fine, superficielle et facilement disséquée préparation nerf-muscle 7,8 s&#39;est avéré utile pour les études de NMJ développement, la physiologie et la pathologie 9. Enfin, nous expliquons comment le muscle triangularis manubrium est préparé après la fixation d&#39;effectuer une corrélation à haute résolution imagerie confocale, immunohistochimie ou examens ultrastructuraux.

Un exemple d&#39;un explant triangularis sterni prêt pour l&#39;imagerie plat est illustré à la figure 1G. Cette explant est particulièrement adapté pour l&#39;imagerie JNM ex vivo que le muscle triangularis composée uniquement de quelques couches de fibres musculaires. Ceci permet d&#39;obtenir des images haute définition à partir d&#39;explants issus de lignées de souris transgéniques qui supporte clou SC (PLP-GFP 2) et / ou des axones (Thy1-XFP 1). Les...

Visualisation des cellules individuelles dans les tissus densément emballés, comme les cellules de Schwann terminales (SC) à jonctions neuromusculaires (JNM), est un défi. &quot;Sequential photo-blanchiment&quot; permet la délimitation SC seul terminal, par exemple dans le muscle explant sterni triangularis, une pratique nerf-muscle préparation, où séquentiel de blanchiment peut être combiné avec le temps écoulé et d&#39;imagerie<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunomarquages.

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Le photoblanchiment séquentiel offre un moyen non invasif de marquer des cellules satellites (SC) individuelles au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM). La JNM est la synapse la plus volumineuse du système nerveux des mammifères...

L'objectif général de l'expérience suivante est de délimiter des cellules de Schwann uniques à la jonction neuromusculaire à l'aide de la microscopie confocale. Ce protocole utilise des souris transgéniques exprimant la GFP dans les cellules de Schwann terminales et axonales. La première étape consiste à disséquer un explant de nerf et de muscle.Un blanchiment séquentiel successif de toutes les cellules de Schwann, sauf une, au niveau d'une jonction neuromusculaire donnée est ensuite effectué afin de révéler la morphologie d'une cellule unique. Enfin, une carte à faible grossissement est établie. Le tissu est fixé et utilisé pour une immunohistochimie permettant de visualiser n'importe quel marqueur souhaité par rapport à la cellule de Schwann non blanchie restante.Les résultats montrent la morphologie des cellules uniques et, si désiré, une microscopie en time-lapse ou une analyse de colocalisation immunohistochimique sur tissu fixé, basée sur l'imagerie confocale. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la morphologie et le territoire des cellules uniques de type swan au niveau de la jonction neuromusculaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que des lignées cellulaires, des tranches de cerveau vivantes ou même d'autres espèces comme le poisson zèbre.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il faut une certaine expérience pour identifier une jonction neuromusculaire suffisamment superficielle et ne pas perdre de temps sur des structures qui ne valent tout simplement pas l'effort. Avant de commencer la chirurgie, oxygénez et refroidissez la solution de Ringer pendant au moins 15 minutes. Placez une boîte de culture de tissus de 15 centimètres sur de la glace sous un microscope. Recouvrez-la d'une plaque métallique.Placer la boîte de culture de tissus de 10 centimètres remplie de solution de Ringer sur la plaque métallique. Placer la pierre d'oxygénation dans la solution. L'étape suivante consiste à sélectionner une souris dont les cellules en forme de cygne et les axones sont marquées par des couleurs différentes.Après l'euthanasie de la souris, vaporisez-la avec de l'éthanol afin de prévenir la contamination par le pelage. À l'aide de ciseaux larges, pratiquez une incision médiane au niveau du sternum ainsi que deux incisions parallèles au bord inférieur de la cage thoracique. Retirez la peau, ouvrez l'abdomen et disséquez les muscles pectoraux en effectuant des incisions près de l'insertion musculaire au niveau du sternum. À l'aide d'une pince, saisissez le cartilage xiphoïde et sectionnez le diaphragme juste en dessous du cartilage xiphoïde.Dissez le diaphragme le long de ses insertions costales. Humidifiez occasionnellement le tissu avec une solution de Ringer afin d’éviter qu’il ne s’assèche, en tenant la cage thoracique par le processus xiphoïde à l’aide de pinces. Commencez à couper les côtes au niveau de la colonne vertébrale aussi près que possible de leurs insertions.Les incisions gauche et droite doivent converger au-dessus du cœur vers le manubrium du sternum. Essayez d'éviter de sectionner les vaisseaux sanguins importants, en particulier les veines sous-clavières. Pour une meilleure visibilité.Soulevez délicatement la préparation en tenant le processus xiphoïde avec une pince. Effectuez maintenant une incision transversale juste en dessous du manubrium sterni pour enlever le thorax, puis transférez l'explication X dans la boîte de 10 centimètres contenant la solution de Ringer préparée. Placez la boîte sur la plaque métallique et le récipient rempli de glace sous le microscope.À l'aide de petites ciseaux à ressort, retirer les restes du thymus, de la plèvre, du diaphragme et des muscles pectoraux. À l'aide de petites ciseaux à ressort, disséquer toutes les côtes qui n'insèrent pas au sternum. Couper le tissu situé entre les côtes.Cela permet à l'explant X de s'insérer dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres revêtue d'un protecteur SIL. Maintenant, à l'aide de huit à dix épingles minucieuses raccourcies, fixez l'explant X en évitant le muscle sterno-oculaire triangulaire indiqué ici. Deux épingles doivent traverser les parties cartilagineuses du sternum, et deux épingles doivent traverser les parties cartilagineuses plus molles situées entre les côtes.Évitez de percer les côtes situées sous ou près du muscle triangulaire. Continuez à piquer jusqu'à ce que les côtes soient légèrement écartées. Fixez le muscle dans une position légèrement étirée.Transférez la boîte de 3,5 centimètres revêtue d’un pare-flamme à un microscope confocal équipé d’un laser Argonne et d’objectifs à immersion dans l’eau. Pour une microscopie en laps de temps, insérez la boîte de 3,5 centimètres revêtue d’un pare-flamme dans l’anneau chauffant. Installez un système de superfusion et placez une sonde de température.Veillez à ce que rien ne touche l'explants, le rebord de la boîte ou le revêtement du cigare. Pour la microscopie en time-lapse, chauffez l'explants X, mais pour la photobléachissement des cellules de Schwann, une température ambiante est préférable. Ensuite, à l'aide d'un objectif air Forex, observez le schéma d'innervation du muscle sternotriangulaire de l'œil et repérez la bande de la plaque motrice sternotriangulaire de l'œil.Passer à l'objectif à cône de plongée 20 x et commencer à rechercher des régions superficielles dans les zones des bandes de nplate. Les régions situées au-dessus des côtes et près des nerfs intercostaux constituent de bons emplacements candidats. Passer à l'objectif à cône de plongée 100 x ou 60 x pour examiner les individus et les mjs.Idéalement, localisez une jonction neuromusculaire recouverte par plusieurs cellules de Schwann et située très superficiellement. Il est essentiel, pour la réussite de ce protocole, de trouver des jonctions neuromusculaires superficielles et planes. Étant donné que la jonction neuromusculaire entoure les fibres musculaires cylindriques, elle a tendance à être enroulée autour de la fibre, ce qui rend souvent l'angle d'imagerie non optimal. Ne sélectionnez que les jonctions neuromusculaires superficielles, planes et situées en surface. Utilisez maintenant un objectif de 100 x à ouverture numérique de 1,0.Avec un grossissement de 2,5, acquérez une image confocale de la JNM. Ces paramètres fournissent une taille de pixel d'environ 0,1 micromètre, assurant un échantillonnage spatial adéquat selon le critère de Nyquist. Photoblanchissez maintenant la cellule de Schwann en positionnant le faisceau laser à 488 nanomètres au centre du noyau avec une puissance maximale pendant cinq secondes.Ensuite, recentrez-vous sur la cellule et évaluez le résultat du blanchiment. Si nécessaire, répétez à nouveau l'étape de blanchiment jusqu'à ce que les niveaux de GFP soient réduits à des niveaux proches du fond, puis acquérez une autre image. Il est essentiel de s'assurer que la zone blanchie se trouve en dehors de toute zone de recouvrement entre deux cellules.S'il y a un chevauchement, la photobléachissement dans une seconde cellule sera évident. Lorsqu'elle est correctement réalisée, cette approche permet d'obtenir des cellules finales clairement visibles, souvent dotées d'une morphologie tout à fait surprenante que l'on n'aurait pas pu deviner avant de commencer la procédure. Répétez le processus de photobléachissement jusqu'à ce que toutes les cellules de Schwann soient photoblanchies, sauf une.La dernière cellule de Schwann non décolorée convient à la microscopie confocale en lapso-temporel. Après avoir terminé l'acquisition en lapso-temporel, établissez une carte de ces njs en prenant une image à 100 x sans zoom, puis des images de la région à l'aide de l'objectif 20 x, et répétez le processus avec l'objectif 4 x. Cette carte est nécessaire pour localiser les njs après la chimie immunohistologique d'un muscle fixé.Après l'acquisition d'images et le blanchiment, détachez l'explants et transférez-le dans un tube de 50 millilitres contenant au moins 15 millilitres de PFA à 4 %. Ensuite, placez le tube sur de la glace pendant une heure ; après avoir refroidi le tissu pendant une heure, rincez-le avec de la glycine 0,1 molaire dans du PBS pendant au moins 10 minutes. Puis, transférez l'explants fixé dans une boîte de culture tissulaire de cinq centimètres recouverte de soie et remplie de PBS 0,01 molaire, et préparez-vous à poursuivre la dissection de l'explants.Tout d'abord, découpez une forme trapézoïdale avec un côté parallèle au sternum et l'autre passant par les transitions osseuses aux cartilages. Cette section contient le muscle triangulaire à sa surface. Ensuite, retirez les côtes inférieures à l'aide d'une coupe horizontale ou transsternale afin d'accéder librement à l'extrémité caudale du muscle triangulaire.Insérez maintenant une aiguille hypodermique comme un pion dans la partie supérieure du trapèze. Ensuite, retirez le muscle triangulaire. Commencez par utiliser une pince pour tenir délicatement le coin inférieur du muscle.Deuxièmement, utilisez une seringue et une aiguille comme un micro-scalpel pour couper parallèlement au plan de la paroi thoracique. Une fois que la partie inférieure du muscle est relâchée, insérez une autre aiguille sous le muscle à travers la paroi thoracique afin d'immobiliser la préparation. Lors de la section des insertions des tissus conjonctifs, détachez délicatement le muscle du thorax en tirant doucement avec la pince.Enfin, retirez les résidus de graisse et de vaisseaux sanguins à l’aide de pinces. Veillez à ne pas arracher les nerfs. Le muscle triangulaire est désormais prêt pour l’immunohistochimie.Un œil sternal triangulaire a été préparé pour la visualisation ex vivo des cellules de Schwann à l’aide de souris exprimant la GFP sous le promoteur PLP. Les axones pouvaient être simultanément visualisés en croisant des souris PLP-GFP avec des souris OFP3 thigh one. À l’aide du protocole décrit, la morphologie des cellules de Schwann terminales uniques a été révélée avec un niveau de détail étonnamment élevé en photoblanchissant les deux cellules de Schwann terminales voisines ainsi que la première cellule de Schwann axonale en conditions vivantes.Les jonctions neuromusculaires images ont été retracées à l’aide de la carte établie préalablement et analysées à haute résolution dans le tissu fixé après la microscopie confocale en direct, le sternon triangulaire explanté ayant été fixé et coloré. On observe ici les récepteurs de l’acétylcholine marqués par la bungarotoxine couplée à l’Alexa 647 en rouge et les vésicules synaptiques marquées par un anticorps anti-synaptophysine en blanc. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser la morphologie de cellules individuelles, initialement toutes marquées par la même protéine fluorescente et trop densément groupées pour être distinguées individuellement.Notre exemple montre la jonction neuromusculaire, mais il existe de nombreuses autres applications possibles.

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