Fibre optique d'implantation pour la stimulation chronique optogenetic de tissu cérébral

Le but de l’expérience suivante est d’activer et d’étudier les circuits neuronaux à long terme chez des souris éveillées et au comportement précoce. Cette méthode est adaptée du concept décrit à l’origine dans Sparta et al. Ceci est réalisé en assemblant d’abord un cordon de couple de fibre optique, qui relie le joint rotatif optique à l’implant de fibre optique.

Ensuite, la fibre optique est implantée sur le tissu cérébral d’intérêt pour créer un passage permettant à la lumière de se déplacer directement vers le canal redin exprimant les neurones. Enfin, la source lumineuse est connectée à l’articulation rotative optique afin de créer un chemin connecté en série de la source lumineuse au tissu cérébral. En fin de compte, l’activation induite par la lumière des neurones exprimant le canal redsin peut être évaluée sur la base d’études in vivo, d’électrophysiologie et d’études comportementales.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les canules guides est qu’elle minimise les dommages au tissu cérébral causés par l’insertion et le retrait répétés d’une fibre optique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du fonctionnement des circuits neuronaux, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes pour mieux comprendre les mécanismes dépendants des synapses et des circuits qui sous-tendent certains types de troubles neurologiques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Les étapes d’implantation étant difficiles à maîtriser, chaque étape apparemment mineure contribue grandement à la stabilité et à la fiabilité globales de la méthode. Commencez par couper 35 millimètres d’une fibre optique de 125 microns de diamètre avec un noyau de 100 microns en positionnant une pointe cunéiforme en carbure perpendiculaire à la fibre optique et en marquant la fibre en un seul mouvement unidirectionnel suivi d’une traction tout droit. Maintenant, insérez un sauvage en céramique lc avec un diamètre de 127 microns dans un alésage convexe côté pointé vers le bas dans un étau, puis insérez la pièce de fibre optique dans le sauvage.

La fibre optique doit glisser en douceur et dépasser légèrement de l’extrémité convexe du sauvage. Ensuite, appliquez une goutte d’époxy à fibre optique durcissable à la chaleur fraîchement préparée sur l’extrémité plate du sauvage, puis appliquez un pistolet thermique sur l’époxy. L’époxy doit remplir le sauvage car il est chauffé et durcit lorsqu’il devient noir.

Après durcissement, nettoyez tout époxy sur les côtés du sauvage, puis à l’aide d’un disque de polissage à fibre optique LC, créez des motifs de rotation circulaires pour polir l’extrémité convexe du sauvage sur de l’oxyde d’aluminium. Coupez ensuite la fibre optique à l’extrémité plate à la longueur appropriée pour cibler la région d’intérêt. Pour tester la fibre optique polie, insérez l’extrémité polie de l’implant dans le manchon du coupleur.

Jusqu’à ce qu’un contact direct avec le sauvage opposé soit ressenti, un mauvais implant aura un point focal faible près de l’extrémité de la fibre optique, alors qu’un bon implant transmettra un cercle concentrique lisse de lumière sans sortie. Des puissances allant jusqu’à 10 milliwatts stockent les implants finis dans de la mousse jusqu’à leur utilisation. Commencez cette étape en mesurant, puis en marquant une fibre optique de 220 microns de diamètre avec un noyau de 200 microns pour permettre à une souris de se déplacer librement mais ne pas permettre à la souris de mâcher la fibre.

Insérez ensuite la fibre optique dans un morceau de tube de furation d’un diamètre intérieur légèrement supérieur et d’une longueur légèrement plus courte que ceux de la fibre optique. Maintenant, dénudez environ 25 millimètres d’une extrémité de la fibre optique et insérez-la dans l’extrémité métallique d’un assemblage sauvage multimode FC MM. Avec un alésage de 230 microns de diamètre jusqu’à ce qu’il s’arrête, la fibre optique doit dépasser par l’extrémité sauvage.

Ensuite, fixez la connexion avec du cyanoacrylate à l’extrémité métallique et recouvrez la connexion avec un connecteur Boot polissez l’extrémité sauvage avec un disque de polissage FC comme nous venons de le démontrer. Après avoir dénudé l’autre extrémité de la fibre optique, insérez-la dans une céramique lc sauvage avec juste l’extrémité distale convexe. Appliquez ensuite une goutte d’époxy sur l’extrémité plate et chauffez jusqu’à ce qu’il soit durci comme cela vient d’être démontré.

Après avoir poli l’extrémité convexe du sauvage comme nous venons de le démontrer, faites glisser un manchon sauvage lc sur l’extrémité convexe du sauvage jusqu’à ce que le sauvage atteigne le milieu du manchon. Placez ensuite une gaine thermorétractable sur la gaine et le manchon et chauffez la gaine thermorétractable pour sécuriser et protéger la connexion. Enfin, connectez le sauvage à la source laser, puis testez-le en mesurant la sortie lumineuse à travers le coupleur avec un spectrophotomètre, la perte de lumière entre la sortie laser et la sortie du coupleur mesurée ne doit pas dépasser 30 % avant de commencer la chirurgie.

Désinfectez la zone chirurgicale avec de l’alcool à profil isop suivi d’une solution de chlorhexidine. Ensuite, placez la souris dans la plate-forme stéréotaxique et fixez la tête en vous assurant que le crâne est de niveau. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse et la douleur postopératoire.

Faites maintenant une incision à travers la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne des orbites oculaires à la suture lambda. Utilisez des pinces à séraffinement pour retenir la peau et maintenir l’accès au crâne. Ensuite, utilisez un cure-dents pour graver un motif à carreaux sur toute la surface du crâne.

Lavez les débris résultants avec une solution saline stérile. Après le séchage soigneux, utilisez un coton-tige pour appliquer du peroxyde d’hydrogène à 3 % sur le crâne exposé pendant environ deux à trois secondes pour créer des micropores. Ensuite, lavez le crâne plusieurs fois avec une solution saline plus stérile et séchez-le soigneusement.

Après avoir gravé, lavé et séché le motif en damier dans le crâne, insérez à nouveau l’implant sauvage à fibre optique dans le support de sonde, puis connectez-le au bras stéréotaxique. Déterminez l’emplacement du trou de fraise à l’aide d’un atlas stéréotaxique calibré en bgma et lambda. Ensuite, utilisez une perceuse dentaire rotative pour faire une petite craniotomie de moins d’un millimètre de diamètre au-dessus de la région d’intérêt, en faisant attention de ne pas casser la dure-mère ou d’endommager les tissus.

À l’aide du bras stéréotaxique, positionnez l’implant en place directement au-dessus de la région d’intérêt, le sauvage doit reposer sur le tissu crânien environnant. Utilisez maintenant un cure-dent stérile pour appliquer une fine couche uniforme de ciment dentaire fraîchement préparé sur le crâne et sur la partie inférieure de l’implant. En veillant à ne pas entrer en contact avec la peau de l’animal, la couche de base du ciment dentaire doit couvrir autant de surface que possible sur le crâne.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’application du ciment dentaire sans qu’il ne touche la peau de la masse. Pour assurer le succès, appliquez de petites quantités de ciment à la fois en couches minces et attendez que chaque couche soit complètement sèche avant d’ajouter la suivante. Appliquez des couches uniformes de ciment dentaire pour former un petit monticule sur le dessus du crâne et autour de l’implant.

Laissez les trois à cinq millimètres de l’extrémité convexe du ciment sauvage propre pour permettre une connexion lisse et non obstruée. Ensuite, suturez le cuir chevelu sur le monticule de ciment dentaire et autour de l’implant, l’adhésif vet bond peut être utilisé pour une liaison supplémentaire après la suture. Enfin, appliquez des analgésiques topiques et des antibiotiques sur la peau de la suture et autour de la base de l’implant, puis placez la souris dans une cage pour la récupération postopératoire.

Un assemblage correct de l’implant et du coupleur de fibre optique permet une perte minimale de photons entre la source lumineuse et l’extrémité de la fibre optique dans la région d’intérêt. Alors que les fibres optiques polies doivent transmettre la lumière dans un cercle concentrique uniforme similaire au cercle montré ici, comme on peut le voir sur cette image, avec une implantation et une suture minutieuses, l’implant ne provoque aucune irritation visible chez la souris et peut rester en place pour des études à long terme sans aucune dégradation significative de la fibre optique ou de la quantité de lumière transmise. Les tests comportementaux fonctionnels chez une souris éveillée montrent une réponse directe de la stimulation par le biais d’une fibre optique implantée sur le cortex moteur, comme en témoignent ces données vidéo d’électrophysiologie in vivo montrant l’activation des neurones ciblés par l’implant et la réponse comportementale de l’animal lors de la stimulation cérébrale. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la photostimulation des régions cérébrales ciblées peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quels sont les modèles de connectivité des circuits associés aux cellules cibles ?

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler des implants à fibres optiques et des cordons de coupleur, et comment les implanter sur du tissu cérébral exprimant des porteurs optogénétiques.