Name: Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Apprenez à isoler des organoïdes épithéliaux mammaires humains à partir de tissus chirurgicaux pour des cultures cellulaires à long terme. Cette méthode permet d'étudier la biologie cellulaire et la carcinogenèse.

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MAL, JCG, et MRS sont pris en charge par la NIA (R00AG033176 et R01AG040081) et par le Laboratoire Directed Research and Development, US Department of Energy contrat # DE-AC02-05CH11231.

1. Traitement des tissus et la digestion <ol><li> Obtenir le tissu mammaire humain en tant que matériau de défausse de procédures chirurgicales. Mammoplasties de réduction peuvent fournir des cellules normales ou bénignes; fibroadénomes et gynecomastias fournir des cellules bénignes; tissus non tumoraux mastectomie (périphérique ou controlatéral à la tumeur, ou sous-cutanée) fournir des cellules qui peuvent aller de bénigne à la normale à microtumeurs contenant. Assurez-vous approbation de l&#39;IRB bon existe avant l&#39;obtention du matériel de défausse. Tout le matériel doit être traité selon la réglementation des agents pathogènes transmissibles par le sang. </li><li> Placer le produit dans des récipients stériles contenant un tampon ou un support (par exemple 1:1 Medium Eagle modifié par Dulbecco et de Ham F-12), supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 5 pg / ml Fungizone, 50U/ml polymyxine B, et 10% de sérum foetal bovin, et le transport de laboratoire à 4 ° C. La mammoplastie de réduction des tissus peuvent être conservés ou expédiés à 4 ° C pendant 72 heures sans affecter significativement sula viabilité des cellules bsequent. De petits morceaux de tissu mammaire non-réduction peut nécessiter un traitement plus rapide. </li><li> Séparer les zones épithéliales de la matrice stromale du tissu adipeux, le tissu conjonctif et les vaisseaux sanguins en utilisant une combinaison de scalpel stérile, pinces et de ciseaux. Couper des morceaux de tissu avec des ciseaux et les placer dans un grand plat en verre stérile (par exemple, 150 mm). Disséquer délicatement sur les zones épithéliales, qui apparaissent comme des fils blancs noyées dans la matrice stromale plus jaune, à l&#39;aide des pinces pour maintenir le matériau et le scalpel pour gratter le matériau grossièrement gras. Pour faciliter la digestion, couper le tissu épithélial en petits morceaux de ~ 3-4 mm en utilisant des scalpels opposés et les placer dans un tube à essai de 50 ml. Si de grandes quantités de tissu sont en cours de traitement, frais lames de scalpel peut être nécessaire. Enlever la matière grasse du plat pour l&#39;élimination conformément aux réglementations institutionnelles. <ol class="lalpha"><li> Dans les tissus fortement fibreux (par exemple, sous-cutanée mastectomies atteints de la maladie fibrokystique grave), il y aura plus solide blanc, non épithéliaux matériel. Il peut être difficile de disséquer les cellules épithéliales de matrices fibreuses telles. De gros morceaux de matériau fibreux peut être coupé en petits morceaux qui sont carrés ~ 1-3 mm dans la zone et digéré séparément. </li></ol></li><li> Placer le tissu épithélial disséqué dans un tube à centrifuger conique (50 ml ou 15 ml) avec le tissu comprenant pas supérieure à un tiers du volume du tube. Mettre en place le tube à son volume maximum, laissant seulement un espace d&#39;air faible pour permettre le mélange, pendant la rotation, en utilisant un mélange de digestion de tissu (ou l&#39;équivalent DME/F-12, 10 ug / ml d&#39;insuline, antibiotiques comme ci-dessus, et la concentration finale de 10 % de FCS, 200 collagénase brute U / ml et 100 U / ml de hyaluronidase. </li><li> Placer les tubes sur un rotateur de tubes HulaMixer et tourner sur 360 ° à 8 tours par minute pendant la nuit à 37 ° C. </li><li> Tubes à centrifuger à 600 xg pendant 5 min. Jeter le gras surnageant et moyen terme pour l&#39;élimination accordtion de règles institutionnelles. </li><li> Vérifiez l&#39;achèvement de la digestion par dilution d&#39;une petite aliquote de la pastille dans le milieu. La digestion est terminée lorsque l&#39;examen microscopique montre des amas de cellules (organites) avec des structures canalaires lisse d&#39;apparence, alvéolaire, ou canalaire-alvéolaire libres de joint stroma (figure 1A). Tissus réduction mammaire est généralement montrent encore stroma joint après une digestion du jour au lendemain et il faudra du temps digestion supplémentaire. <ol class="lalpha"><li> Remettre en suspension le culot partiellement digéré en mélange tissu digestion fraîche et ré-incuber avec la rotation à 37 ° C pendant une autre heure 4-12. Répéter les étapes 1,6 et 1,7. Si la digestion est encore incomplète, encore une fois ajouter le mélange de digestion au culot et ré-incuber avec une rotation à 37 ° C pendant la nuit. La concentration d&#39;enzymes peut être réduite pour éviter une sur-digestion pendant une nuit. </li></ol></li><li> Lorsque la digestion est terminée, centrifuger les tubes à 600 xg pendant 5 min, aspirer le résuméion mélange, resuspendre le culot dans le milieu avec antibiotiques à environ 15 ml/50 ml tube, 5 ml/15 ml tube. </li></ol> 2. Filtration et congélation des matières digérées <ol><li> Transfert des aliquotes de l&#39;extrait concentré sur un tamis de 100 um stérile sur un tube stérile de 50 ml. Laissez le drain milieu dans le tube, puis relaver les organites sur le dessus 1-2x fois avec 2-3 ml de milieu. Répétez jusqu&#39;à ce que le culot remis en suspension a été transférée. S&#39;il existe des organites trop sur le filtre et le milieu n&#39;a plus facilement les drains, utiliser un nouveau filtre (s) de la matière restante. Soigneusement retournez le filtre (s) sur le dessus d&#39;un autre tube stérile et laver les organites dans le tube avec plus de support. Il s&#39;agit de la piscine de 100 um organoïde. </li><li> Prenez le matériau qui s&#39;écoule dans l&#39;original tube de 50 ml et répéter le processus de 2,1 en utilisant un tamis 40 um, pour obtenir la piscine de 40 um organoïde, qui contient la plupart des structures alvéolaires. Le matériau qui a drainé dans eTube électronique constitue la piscine filtrat, qui contient des touffes individuelles / petits groupes de cellules mésenchymateuses et épithéliales et des petits morceaux de la vascularisation. </li><li> Pellets de 100 um, 40 um, et les piscines filtrat à 600 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant, reconstituer chaque tube en CPM II (DME/F-12 ou équivalent avec 44% de FCS et 6% de DMSO) en utilisant environ 1 ml de CPMII par 0,1 ml de granulés emballés. Conserver à 4 ° C. </li><li> Un plat de graines de test pour les 2 piscines organoïdes en plaçant 0,1 ml de matériel remis en suspension dans une goutte de culture de tissu plat 35 mm en plastique à goutte comme dans 3.2 ci-dessous. La piscine filtrat peut être directement ensemencées sur des cultures de tissus en plastique avec support des fibroblastes (DME/F-12 ou équivalent avec 10 ug / ml d&#39;insuline et 10% de FBS). </li><li> Aliquoter le reste du matériel remis en suspension dans Nunc ampoules de type gel (1 ml / 2 ml en ampoule). Geler pendant une nuit à -80 ° C, puis transférer rapidement vers le stockage dans l&#39;azote liquide. Nous n&#39;avons pas observé de perte significative de viabilitédans nos ampoules d&#39;origine conservé congelé depuis la fin des années 1970. </li></ol> 3. L&#39;ensemencement organites congelés et Subculture des cultures primaires <ol><li> Décongeler rapidement l&#39;ampoule congelée contenant les organites dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Les semences organoïdes en 2 à 10 (habituellement ~ 6) 60 mm, des plats ou des boîtes de 100 mm 3.1, en fonction de l&#39;estimation visuelle du nombre de organoïdes dans l&#39;ampoule. Organites environ 20-40 ensemencées par antenne parabolique de 60 mm est optimal. </li><li> Organites décongelés sont placés avec soin, goutte à goutte, sur la surface de plat avec une pipette de 1 ml ou une pipette Pasteur pour une répartition uniforme de la organites. Organoïdes placés ensemble aura pour conséquence un espace limité, ce qui donne lieu à moins de cellules de la sous-culture ou de congélation. Évitez de vous gratter la surface plat (cellules ont tendance à ne pas se développer dernières surfaces rayées). Attendre 1-2 minutes pour permettre aux organites joindre, puis ajouter lentement milieu de croissance pour ne pas déloger les organites (par exemple 2-3 ml/60 plat mm). Jencubate à 37 ° C dans le CO 2 incubateur humidifié. Ce sont les cultures primaires. Nous utilisons actuellement M87A + ocytocine (X) moyen pour la croissance la plus vigoureuse HMEC (Figure 2). </li><li> Après 1 jour, vérifiez que les organites sont attachés. Ajouter à moyen supplémentaire (par exemple 2-3 ml/60 plat mm). La migration cellulaire des organites doit être visible par les 24-48 heures, et l&#39;excroissance mitotique par 48-72 h après le semis (figure 1B, C). Parfois, l&#39;attachement est pauvre bout de 24 heures, surtout si le placage organites overdigested ou organites de femmes plus âgées, mais la plupart des préparations joindre dans les 72 h. De petits morceaux de la vascularisation peut fixer et donner lieu à excroissance de cellules de fibroblastes (figure 1D). </li><li> Nourrir les cultures au moins 3 fois par semaine. Les cellules cultivées dans M87A-type de support croître jusqu&#39;à confluence près dans les 5-8 jours, en fonction de la densité de semis. </li><li> S&#39;il existe de croissance des fibroblastes important, la trypsine différentielle (DT), sur la base de l&#39;détachement rapide des fibroblastes provenant de la surface en plastique, est nécessaire pour éliminer les fibroblastes. Lorsque les plaques épithéliales deviennent grands médias aspirés, plat de lavage (par exemple, 1-2 ml/60 plat mm) avec STE (solution saline, la trypsine 0,05%, 0,02% d&#39;EDTA), aspiration, ajouter de l&#39;0,5 ml STE et laisser à température ambiante pendant environ 1 min avec l&#39;observation microscopique continue. Lorsque les fibroblastes se détacher, mais les cellules épithéliales sont encore adhérent, doucement mais fortement frapper le côté du plat contre une surface dure pour déloger les fibroblastes, puis rapidement aspirer. Laver une fois avec du PBS, et aspirer à nouveau. Cultures fortement contaminés par des fibroblastes peut-être besoin d&#39;une DT supplémentaire. </li><li> Repiquer des cultures primaires lors de grandes plaques épithéliales sont présentes, mais avant la confluence. La densité de semis organoïde et l&#39;attachement va influencer le temps nécessaire. Pour conserver la culture primaire et de générer de multiples cultures secondaires, réparties dans le temps, nous effectuons Trypsinizations partielles (PT). </li><li> Aspirer les médias, laver un plat de 60 mm avec 1-2 STE ml, ajouter 0,5 ml STE frais à plat. Observez le détachement des cellules sous le microscope à température ambiante pendant 1-5 min, avec coups doux du plat de promouvoir le détachement des cellules. Trypsinisation doit être arrêtée lorsque ~ 50% des cellules sont détachées. Au début des TP ont généralement détachement cellulaire rapide. Pour plus tard, physiothérapeutes, les cellules peuvent être placés à 37 ° C pour accélérer le détachement, avec une surveillance attentive, comme toutes les cellules peuvent se détacher rapidement. </li><li> Ajouter 2 ml de sérum contenant des médias pour le plat, repipette pour se laver, et transférer dans un tube de 15 ml stérile. Répéter 2 fois avec un autre support de ~ 1-2 ml, en ajoutant le lavage dans le tube. Réalimenter le plat principal et le retour de l&#39;incubateur. Compter le nombre de cellules dans le tube avec l&#39;hémocytomètre. TP peut être répété environ 4 à 8 fois avec la repousse des cellules bien dans les plats principaux et les équivalents croissance à long terme des repiquées secondaires ou congelés (cellules second passage sont appelés secondaires, une fois repiquées, les cellules ne sont longer primaires). Une fois le matériau organoïde n&#39;est plus présente dans les cultures primaires, secondaires repiquées montrent un déclin à long terme du potentiel de doublement de population. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pour repiquer secondaires, les cellules de semence directement du tube dans des boîtes. Les semis de 1-2 x 10 5 mm cellules/100 plat dans un milieu solide tel que M87A + X conduira à la confluence dans les 4-7 jours. Nous ajoutons la toxine du choléra dans le milieu au second passage d&#39;accroître le potentiel prolifératif; la toxine du choléra est omis dans la culture primaire car elle conduit à excroissance cellulaire multicouche des organites. </li><li> Pour la congélation comme secondaires, tube de granulés à 600 xg pendant 5 min, et remettre en suspension dans CPMII avec une densité finale de 10 6 cellules / ml. Aliquoter remis en suspension les cellules dans Nunc ampoules de type gel, geler toute la nuit à -80 ° C, puis transférer sans tarder au stockage dans l&#39;azote liquide. </li></ol></li><li> Il est recommandé de congeler les cellules de la PT première garde, etutiliser des cellules de la PT deuxième sous-culture. TP supplémentaires peuvent être conservés congelés pour une utilisation future. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode humaine de traitement des tissus mammaires présentée ici permet d&#39;obtenir pures cellules épithéliales mammaires à partir du mélange hétérogène de types de cellules dans le sein humain. Filtration au travers des pores de taille fixe permet la séparation des différentes fractions de la glande mammaire (par exemple, des canaux et canalaire contre-alvéolaire alvéolaire) de la matrice digéré stroma. Isogéniques fibroblastes mammaires peuvent être obtenues pour correspondre aux cellules épithéliales. Frozen matière digérée a conservé une bonne viabilité pendant plus de 30 ans. Cette méthode a fonctionné avec succès sur tous, mais très fibreuses tissus mammaires, et est simple à réaliser. D&#39;autres variantes de traitement des tissus mammaires existent qui ne fournissent pas de fractions épithéliales qui sont aussi viables, propres ou séparés. Placement des organites transformés en culture avec de faibles inducteurs de stress médias tels que M87A permet croissance à long terme du HMEC avec des marqueurs de la lignée multiples. HMEC qui ont été cultivées sur plastique tout en conservant la capacité de générationte des structures 3D avec la normale dans les relations lignagères vivo similaires. Ces cultures HMEC conviennent pour une étude expérimentale approfondie, y compris à haut débit, d&#39;un comportement normal et HMEC facteurs qui peuvent propulser ou inhiber la sénescence et de la transformation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Une boîte de Pétri en verre 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Ciseaux 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Pince à 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Scalpels jetables </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Sulfate de polymyxine B </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Trypsine 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire 40 pm </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tubes 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> Plats TC 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> Plats TC 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Flacons cryogéniques </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser scientifique </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf modèle </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour culture cellulaire

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Examen expérimental des cellules mammaires humaines normales (HMEC) épithélial comportement, et comment les cellules normales acquérir des propriétés anormales, peut être facilitée par des systèmes de culture in vitro de façon plus précise le modèle en biologie in vivo. L&#39;utilisation de matières provenant de l&#39;homme pour l&#39;étude de la différenciation cellulaire, le vieillissement, la sénescence et l&#39;immortalisation est particulièrement avantageux étant donné les nombreuses et importantes différences moléculaires dans ces propriétés entre les cellules de rongeurs et de l&#39;homme couramment utilisé 1-2. Les cellules mammaires présentent un système modèle très pratique car de grandes quantités de tissus normaux et anormaux sont disponibles en raison de la fréquence de réduction mammaire et la chirurgie mastectomie. La glande mammaire est constituée d&#39;un mélange complexe de nombreux types cellulaires distincts, par exemple, l&#39;épithélium, tissu adipeux, mésenchymateuses, endothéliales. Les cellules épithéliales sont responsables de la fonction différenciée mammaire de la lactation,et sont aussi à l&#39;origine de la grande majorité des cancers du sein. Nous avons développé des méthodes pour traiter les tissus mammaires glande rejets chirurgicales en pures composants épithéliaux ainsi que des cellules mésenchymateuses 3. La matière traitée peuvent être conservés congelés indéfiniment, ou initié à la culture primaire. Matière de défausse chirurgicale est transporté au laboratoire et manuellement disséqué pour enrichir le tissu épithélial contenant. Digestion ultérieure du tissu découpé à l&#39;aide de la collagénase et la hyaluronidase matériau des bandes de stroma de l&#39;épithélium à la membrane basale. Les pièces résultant de petits épithélial de l&#39;arbre (organites) peut être séparé du stroma digéré par filtration séquentielle sur des membranes de porosité fixe. Selon la taille des pores, les fractions peuvent être obtenues composé de grandes canalaires / alvéolaire pièces, des grappes plus petites alvéoles ou cellules stromales. Nous avons observé une croissance supérieure lorsque les cultures sont initiées comme organites plutôt que comme dissociated cellules individuelles. Placement des organites dans la culture en utilisant les médias induisant peu de stress en charge à long terme la croissance des HMEC normale avec des marqueurs de la lignée types multiples (myoépithéliales, luminal, l&#39;ancêtre) 4-5. Un nombre suffisant de cellules peuvent être obtenues à partir de tissus d&#39;un individu pour permettre vaste examen expérimental utilisant des lots de cellules standardisées, ainsi que d&#39;interrogatoire selon des modalités à haut débit. HMEC culture ont été utilisés dans une grande variété d&#39;études sur les processus normaux qui régissent la croissance, la différenciation, le vieillissement et la sénescence, et comment ces processus normaux sont modifiés au cours de la transformation maligne immortelle et 4-15,16. Les effets de la croissance en présence d&#39;un matériau de matrice extracellulaire, d&#39;autres types cellulaires et / ou la culture 3D peuvent être comparées avec la croissance sur 5,15 plastique. HMEC culture, à commencer par les cellules normales, apporter à un système expérimental maniable pour examiner les facteurs quipeut propulser ou prévenir le vieillissement humain et la cancérogenèse.

Des chiffres représentatifs pour les tissus digérés correctement à organites et mis en culture sont présentés dans la figure 1. Tissus incomplètement digérés montrera matériau encore attaché à l&#39;extérieur de ces structures, et aura probablement une certaine croissance des cellules fibroblastiques en culture primaire, nécessitant DT pour le retirer. Tissus Overdigested montrera moins lisses frontières extérieures, et peut prendre plus de temps pour fixer en culture primaire. Excroissance épithéliale doit débuter dans les 48-72 heures (1B, C). De petits morceaux de vascularisation (1D) peut être une source d&#39;excroissance des cellules mésenchymateuses. Excroissances épithéliales montrent que les populations morphologiquement hétérogènes, avec des populations proliférantes qui contiennent des mélanges de cellules avec des marqueurs associés à myoépithéliales, l&#39;ancêtre, et les lignées luminales (1E, 3C-E). Croissance dans des milieux de faible contrainte comme M87A complétés avec la toxine cholérique et l&#39;ocytocine soutiendra à long terme supérieurela croissance de la normale pré-stase HMEC par rapport aux précédentes formulations de milieux (figure 2). M87A-type de support soutiendra également la croissance des cellules luminales et progénitrices à travers des passages 4-8 (figures 3C-E, 4); par la suite, la plupart des cellules montrer les marqueurs de lignage ne ​​myoépithéliales. HMEC cultivés sur plastique peuvent conserver leur capacité à former 3D correcte auto-organisation à micro micropuits 3D, avec des cellules luminales intérieur des cellules myoépithéliales (figure 4A, B), et pour former des structures organisées moment de l&#39;étalement dans le Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. HMEC organites et de la culture primaire. (A) organoïde montrant la structure canalaire-alvéolaire après digestion et la filtration. (B, C) montrant la structure organites canalaire et alvéolaire 2 jours après le placement en culture primaire; noter la cellule de début outgroissance (flèches blanches). (D) des vaisseaux sanguins Petit attachée et avec des fibroblastes de départ excroissance de mêmes cultures que B, C. (E) excroissance des cellules épithéliales de la culture organoïde primaire au bout de 4 jours. Lignées sont identifiées par coloration avec des anticorps contre K14 (rouge) et K19 (vert); noyaux ont été colorées avec du DAPI (bleu). Luminal (K14-/K19 +, vert), myoépithéliales (K14 + /-K19, rouge), et les cellules progénitrices (K14 + / K19 +, cellules jaunes) sont visibles. Cellules non colorées sont observées dans le noyau organoïde due à la pénétration d&#39;anticorps incomplet. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Organites de croissance des cultures HMEC dans les formulations de différents médias. Obtenus à partir d&#39;un individu, un spécimen 184, ont été lancés dans la culture primaire en utilisant différentes formulations de milieux. Meilleure croissance à long terme est obtenue en utilisant notre formulation la plus récente, M87A + ocytocine (X) 4. Ce milieu prend également en chargecroissance de plusieurs lignées HMEC (voir Fig. 1E). Une formulation antérieure médias, MM 3 procuré une croissance moins robuste, tandis qu&#39;un milieu sans sérum, MCDB170 (commercial MEGM) 17 conduit à une induction rapide de l&#39;inhibiteur de la kinase cycline p16 INK4a et de sélection des cellules aberrantes 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figure 3. Comparaison de la diversité dans la lignée organites incultes et HMEC culture à 4 analyse FACS ème passage. (A, B) d&#39;un inculte, organoïde enzymatique dissocié de (A) l&#39;expression de EpCAM et CD49f/alpha 6 intégrine, et (B) CD227/Muc1 et CD10/CALLA. (C, D) analyse FACS des 4 ème passage pré-stase HMEC pour l&#39;expression de (C) et de l&#39;intégrine EpCAM CD49f/alpha 6, et (D) et CD227/Muc1 CD10/CALLA. P identifiablesopulations sont étiquetés comme LEP (exprimant EpCAM luminale des marqueurs ou CD227), député européen (exprimant myoépithéliales marqueurs CD49f ou CD10), ou PROG (enrichi en CD49f + / + EpCAM population). Notez que lors de l&#39;adaptation à la réglementation culture de modifications EpCAM et CD49f par rapport aux organites incultes. (E) Unsorted HMEC et FACS enrichi LEP et député à 4 ème passage colorées pour une analyse par immunofluorescence de la kératine K14 (MEP marqueur) et K19 (LEP marqueur) pour vérifier l&#39;identité lignée. Noyaux colorés au DAPI apparaissent en bleu. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figure 4. HMEC culture sont capables de former des structures organisées en relation avec la lignée de type in vivo quand ils sont placés dans des micro-environnements appropriés. (A) pré-stase 4 ième passage HMEC étaient FACS enrichi into luminale LEP et les lignages MEP myoépithéliales l&#39;aide de marqueurs pour CD227 et CD10, avec ces lignées vérifiées par l&#39;expression de K14 et K19 (non représentée). (B) Une fois mélangés dans des micropuits à micro, les cellules cultivées étaient capables d&#39;auto-organisation dans des bicouches avec des MEP à l&#39;extérieur et le LEP interne [adapté de Chanson et al. 5]. Marqué par fluorescence LEP (vert) et député européen (rouge) ont été imagées avec un microscope confocal à 0 h, 24 h et 48 h après l&#39;addition de la micropuits (supérieure). Contrôle HMEC ont été arbitrairement étiqueté avec le rouge ou le vert des marqueurs fluorescents (inférieur). (C) image Fond clair FACS des cellules souches enrichies (CKIT +) plaqué en 3D (Matrigel) la culture et cultivées pendant 18 jours. Structures qui en résultent peuvent présenter morphogenèse alvéolaire. (D) Les structures ont été extraites de Matrigel et colorées pour détecter K14 et K19; noyaux ont été DAPI. L&#39;analyse par immunofluorescence montre des structures organisées avec pola luminal et basal correcterité.

Une méthode pour traiter humaine matériau mammaire chirurgicale est décrite de défausse. Tissu traité, sous la forme d&#39;organites, peuvent être conservés congelés indéfiniment ou mis en culture pour la croissance à long terme. Cette méthode permet d&#39;examiner expérimentale de biologie cellulaire normale épithéliale humaine, et les effets des perturbations exogènes.

Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Ce protocole vise à isoler les parties épithéliales de la glande mammaire libres de cellules stromales mammaires associées. Commencer par une dissection accumulée du matériau chirurgical à enrichir pour les structures épithéliales à l’aide de la digestion enzymatique. Séparez les organoïdes épithéliales du matériel stromal à l’extérieur de la membrane basale.Ensuite, traitez les organoïdes digérés à travers des passoires cellulaires de taille de pores fixes pour obtenir des fractions enrichies. Semez les organoïdes pour une culture immédiate ou congelez les stocks pour une utilisation future. En fin de compte, les organoïdes épithéliaux sont utilisés pour générer des cultures à long terme de cellules épithéliales mammaires humaines normales.J’ai d’abord développé cette méthode à la fin des années 1970 afin de faire progresser le domaine de la biologie des cellules épithéliales humaines et de la cancérogenèse. Une abondance de matériel chirurgical provenant de tissus de mémoire humaine normaux était disponible. Ce qu’il fallait, c’était une méthode pour traiter ce matériau hétérogène en vrac afin de le rendre apte à la culture de cellules épithéliales pures et à des milieux pour soutenir la croissance à long terme.La démonstration visuelle de cette méthode est utile, en particulier pour noter comment faire la dissection grossière. À quoi ressemblent des organoïdes correctement digérés ? Filtrage des organoïdes et placage des organoïdes pour la culture.L’avantage de cette technique est qu’elle fournit des fractions épithéliales propres car le stroma et les cellules épithéliales restent intactes. Les organoïdes, que nous avons trouvés, donnent la meilleure croissance initiale et maximisent le nombre de cellules que l’on peut obtenir. Deux scientifiques du Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey et Mark LeBarge, vont maintenant faire la démonstration de cette procédure à partir du matériel mis au rebut des procédures chirurgicales.Prélevez des tissus mammaires humains dans des contenants stériles contenant un tampon ou un milieu complet ainsi que des antibiotiques à quatre degrés Celsius. Coupez des morceaux de tissu et placez-les dans un grand plat stérile en verre. Séparez les zones épithéliales de la matrice stromale du tissu adipeux, du tissu conjonctif et des vaisseaux sanguins.Disséquez doucement les brins blancs des zones épithéliales incrustées dans la matrice stromale plus jaune. Tenez le matériau avec une pince et grattez le matériau grossièrement gras avec un scalpel. Ensuite, avec des scalpels opposés, coupez le tissu épithélial en morceaux d’environ quatre millimètres pour faciliter la digestion.Transférez le tissu épithélial disséqué dans un tube à centrifuger conique de 50 ou 15 millilitres dans un tissu fortement fibreux. Il y aura plus de matériel blanc non épithélial. S’il est difficile de disséquer les cellules épithéliales à partir de telles matrices fibreuses.Le tissu peut être coupé en morceaux d’une à trois millimètres carrés et digéré séparément. Remplissez le tube avec le milieu de digestion contenant de la collagénase brute et des jours d’alur élevés, en laissant un petit espace d’air pour permettre le mélange pendant la rotation. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius sur un rotateur à 360 degrés à huit tr/min après la digestion.Granulez les échantillons par centrifugation 600 G pendant cinq minutes. Jetez la graisse et le milieu surnageants conformément aux directives institutionnelles pour l’élimination des tissus humains. Pour surveiller la digestion des tissus, diluez un petit Eloqua de la pastille dans un milieu et examinez-le au microscope dans des organoïdes complètement digérés pour montrer le stroma attaché.Répétez la digestion enzymatique jusqu’à ce que le tissu soit complètement digéré en organoïdes purs. Si une deuxième digestion pendant la nuit est nécessaire, il peut être nécessaire de réduire la concentration d’enzymes pour éviter une digestion excessive. Des organoïdes correctement digérés présenteront des structures alvéolaires canalaires ou alvéolaires canalaires d’apparence lisse sans stroma attaché.Lorsque la digestion est terminée, suspendez la dernière pastille dans des antibiotiques de lieu moyen. Passez l’échantillon digéré en quats à travers une passoire stérile de 100 microns sur un tube stérile de 50 millilitres. Une fois que le milieu s’est écoulé dans le tube, lavez les organoïdes avec trois millilitres de milieu.Répétez l’opération jusqu’à ce que toute la pastille remise en suspension ait été transférée. Ensuite, retournez soigneusement le filtre sur un tube stérile et lavez les organoïdes dans le tube avec plus de milieu. Il s’agit de la piscine organoïde de 100 microns.Passez maintenant le matériau qui s’est écoulé dans le tube d’origine de 50 millilitres à travers une passoire de 40 microns pour séparer les structures alvéolaires du pool de filtrat de cellules uniques et de petits amas de cellules mésenchymateuses et épithéliales et de petits morceaux de tissu vasculaire. Centrifugez les flaques de 100 microns, 40 microns et de filtrat à 600 G pendant cinq minutes. Reconstituez chaque échantillon à l’aide d’un millilitre de ccpm.Deux solutions de congélation par 0,1 millilitre de palais emballé. Conserver à quatre degrés Celsius. Placez soigneusement 0,1 millilitre de chacun des deux flaques organoïdes.Goutte à goutte en une répartition uniforme sur une ou 2 paraboles de 35 millimètres. Évitez de rayer la surface du plat après quelques minutes de fixation des organoïdes. Ajouter lentement les milieux de culture pour éviter de déloger les organoïdes.Ensuite, incubez les cultures primaires à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2 humidifié. Semez également 0,1 millilitre du pool de filtrat directement sur du plastique de culture tissulaire avec un milieu de fibroblastes. Incuber les cultures primaires à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2 humidifié.Après 24 à 48 heures, vérifiez la migration cellulaire des organoïdes et après deux à trois jours, surveillez la culture d’excroissance mitotique. Les cellules à proximité de la confluence reconstituant le milieu tous les deux à trois jours. De petits morceaux du système vasculaire peuvent se fixer et donner naissance à une excroissance de cellules fibroblastiques.En cas de croissance importante de fibroblastes. Effectuez une trippinisation différentielle pour retirer les fibroblastes des grandes plaques épithéliales. Lavez les cellules une fois dans le tampon STE.Ajoutez ensuite 0,5 millilitres de STE frais pour couvrir le plat d’une observation microscopique continue et de coups doux mais secs du plat contre une surface dure. Recherchez le décollement des fibroblastes pendant que les cellules épithéliales sont encore en transit adhérent. Les cultures primaires lorsque les plaques d’excroissance épithéliale approchent de la confluence.Pour conserver la culture primaire et générer plusieurs cultures secondaires, utilisez de la trypsine partielle. Lavez les cellules une fois dans le tampon STE, puis ajoutez du STE frais pour couvrir le plat. Vérifiez qu’environ 50 % des cellules se sont détachées.Ajoutez ensuite deux millilitres de sérum contenant du milieu de croissance et récoltez les cellules. Transférez ensuite les cellules dans un tube stérile de 15 millilitres après deux lavages. La mise en commun des cellules récoltées et de la culture La mise en culture partielle peut être répétée environ quatre à huit fois avec une bonne repousse cellulaire à partir des plats primaires et avec une croissance équivalente à long terme à partir de la sous-culture ou des secondaires congelés.Nous recommandons de congeler les cellules de la première trypsinisation partielle pour la conservation et d’utiliser les cellules de la deuxième combinaison pour la sous-culture. Lorsque le tissu est correctement digéré et filtré, les organoïdes affichant des structures canalaires et alvéolaires peuvent être vus avec des bords lisses sans stroma attaché. S’il n’est pas suffisamment digéré, il y aura du matériel attaché et plus de contamination par les fibroblastes s’il est trop digéré, les bords seront rugueux et la fixation sera moins efficace après la fixation des organoïdes.La croissance épithéliale commence dans les 48 à 72 heures à 48 heures. Il n’y a pas encore de division cellulaire active avec mitose visible à 72 heures. La mitose devrait devenir plus visible.De petits morceaux de système vasculaire peuvent être une source de croissance des cellules mésenchymateuses après quatre jours. Les excroissances épithéliales présentent des populations morphologiquement hétérogènes ici, la coloration avec des anticorps contre la kératine 14 et la kératine 19 marque les lignées myoépithéliales vertes K 19 positives et rouges K 14 positives, ainsi que les cellules progénitrices jaunes K 14 positives K 19 positives. Le HMEC peut être cultivé dans différentes formulations de milieux.Les milieux à faible stress tels que le M 87 a complété par la toxine cholérique et l’ocytocine favoriseront la croissance supérieure à long terme du HMEC normal avant la stase, ainsi que la croissance de plusieurs lignées HMEC. Les résultats de l’analyse des faits illustrent la diversité des lignées chez les organoïdes non cultivés et dans le quatrième passage, les HMEC cultivés en M 87, un milieu. Ici, les populations luminales et myoépithéliales sont identifiées par l’expression de marqueurs luminaux, EPCA et CD 2 27 et marqueurs myoépithéliaux CD 49 F et CD 10 replaqués.Quatrième passage, HMEC. La lignée des faits enrichis pour les marqueurs luminaux et myoépithéliaux précédents a été confirmée par des analyses d’immunofluorescence pour la kératine K 14 et K 19 HMEC. Cultivés sur du plastique jusqu’au passage quatre, ils sont capables de former des structures organisées, avec des relations de lignée in vivo de cellules luminales et myoépithéliales lorsqu’elles sont placées dans des cellules appropriées : les CD 2 27 et CD 10 sont utilisés pour enrichir ces deux lignées.Les HMC conservent leur capacité à former une bonne organisation cellulaire 3D dans des micro-puits 3D à motifs micro avec des cellules luminales à l’intérieur des cellules myoépithéliales. Les cellules progénitrices enrichies en matériaux peuvent également former des structures 3D robustes lorsqu’elles sont plaquées dans du matrigel, imitant les structures ductulaires et alvéolaires. Les structures 3D de Matrigel présentent également une auto-organisation 3D appropriée.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les parties épithéliales de la glande mammaire sans le stroma mammaire associé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur une période de deux à trois jours. La technique de traitement des tissus est généralement simple.Il est important de se rappeler d’arrêter la digestion au bon moment.

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