Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Ce protocole vise à isoler les parties épithéliales de la glande mammaire libres de cellules stromales mammaires associées. Commencer par une dissection accumulée du matériau chirurgical à enrichir pour les structures épithéliales à l’aide de la digestion enzymatique. Séparez les organoïdes épithéliales du matériel stromal à l’extérieur de la membrane basale.

Ensuite, traitez les organoïdes digérés à travers des passoires cellulaires de taille de pores fixes pour obtenir des fractions enrichies. Semez les organoïdes pour une culture immédiate ou congelez les stocks pour une utilisation future. En fin de compte, les organoïdes épithéliaux sont utilisés pour générer des cultures à long terme de cellules épithéliales mammaires humaines normales.

J’ai d’abord développé cette méthode à la fin des années 1970 afin de faire progresser le domaine de la biologie des cellules épithéliales humaines et de la cancérogenèse. Une abondance de matériel chirurgical provenant de tissus de mémoire humaine normaux était disponible. Ce qu’il fallait, c’était une méthode pour traiter ce matériau hétérogène en vrac afin de le rendre apte à la culture de cellules épithéliales pures et à des milieux pour soutenir la croissance à long terme.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile, en particulier pour noter comment faire la dissection grossière. À quoi ressemblent des organoïdes correctement digérés ? Filtrage des organoïdes et placage des organoïdes pour la culture.

L’avantage de cette technique est qu’elle fournit des fractions épithéliales propres car le stroma et les cellules épithéliales restent intactes. Les organoïdes, que nous avons trouvés, donnent la meilleure croissance initiale et maximisent le nombre de cellules que l’on peut obtenir. Deux scientifiques du Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey et Mark LeBarge, vont maintenant faire la démonstration de cette procédure à partir du matériel mis au rebut des procédures chirurgicales.

Prélevez des tissus mammaires humains dans des contenants stériles contenant un tampon ou un milieu complet ainsi que des antibiotiques à quatre degrés Celsius. Coupez des morceaux de tissu et placez-les dans un grand plat stérile en verre. Séparez les zones épithéliales de la matrice stromale du tissu adipeux, du tissu conjonctif et des vaisseaux sanguins.

Disséquez doucement les brins blancs des zones épithéliales incrustées dans la matrice stromale plus jaune. Tenez le matériau avec une pince et grattez le matériau grossièrement gras avec un scalpel. Ensuite, avec des scalpels opposés, coupez le tissu épithélial en morceaux d’environ quatre millimètres pour faciliter la digestion.

Transférez le tissu épithélial disséqué dans un tube à centrifuger conique de 50 ou 15 millilitres dans un tissu fortement fibreux. Il y aura plus de matériel blanc non épithélial. S’il est difficile de disséquer les cellules épithéliales à partir de telles matrices fibreuses.

Le tissu peut être coupé en morceaux d’une à trois millimètres carrés et digéré séparément. Remplissez le tube avec le milieu de digestion contenant de la collagénase brute et des jours d’alur élevés, en laissant un petit espace d’air pour permettre le mélange pendant la rotation. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius sur un rotateur à 360 degrés à huit tr/min après la digestion.

Granulez les échantillons par centrifugation 600 G pendant cinq minutes. Jetez la graisse et le milieu surnageants conformément aux directives institutionnelles pour l’élimination des tissus humains. Pour surveiller la digestion des tissus, diluez un petit Eloqua de la pastille dans un milieu et examinez-le au microscope dans des organoïdes complètement digérés pour montrer le stroma attaché.

Répétez la digestion enzymatique jusqu’à ce que le tissu soit complètement digéré en organoïdes purs. Si une deuxième digestion pendant la nuit est nécessaire, il peut être nécessaire de réduire la concentration d’enzymes pour éviter une digestion excessive. Des organoïdes correctement digérés présenteront des structures alvéolaires canalaires ou alvéolaires canalaires d’apparence lisse sans stroma attaché.

Lorsque la digestion est terminée, suspendez la dernière pastille dans des antibiotiques de lieu moyen. Passez l’échantillon digéré en quats à travers une passoire stérile de 100 microns sur un tube stérile de 50 millilitres. Une fois que le milieu s’est écoulé dans le tube, lavez les organoïdes avec trois millilitres de milieu.

Répétez l’opération jusqu’à ce que toute la pastille remise en suspension ait été transférée. Ensuite, retournez soigneusement le filtre sur un tube stérile et lavez les organoïdes dans le tube avec plus de milieu. Il s’agit de la piscine organoïde de 100 microns.

Passez maintenant le matériau qui s’est écoulé dans le tube d’origine de 50 millilitres à travers une passoire de 40 microns pour séparer les structures alvéolaires du pool de filtrat de cellules uniques et de petits amas de cellules mésenchymateuses et épithéliales et de petits morceaux de tissu vasculaire. Centrifugez les flaques de 100 microns, 40 microns et de filtrat à 600 G pendant cinq minutes. Reconstituez chaque échantillon à l’aide d’un millilitre de ccpm.

Deux solutions de congélation par 0,1 millilitre de palais emballé. Conserver à quatre degrés Celsius. Placez soigneusement 0,1 millilitre de chacun des deux flaques organoïdes.

Goutte à goutte en une répartition uniforme sur une ou 2 paraboles de 35 millimètres. Évitez de rayer la surface du plat après quelques minutes de fixation des organoïdes. Ajouter lentement les milieux de culture pour éviter de déloger les organoïdes.

Ensuite, incubez les cultures primaires à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2 humidifié. Semez également 0,1 millilitre du pool de filtrat directement sur du plastique de culture tissulaire avec un milieu de fibroblastes. Incuber les cultures primaires à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2 humidifié.

Après 24 à 48 heures, vérifiez la migration cellulaire des organoïdes et après deux à trois jours, surveillez la culture d’excroissance mitotique. Les cellules à proximité de la confluence reconstituant le milieu tous les deux à trois jours. De petits morceaux du système vasculaire peuvent se fixer et donner naissance à une excroissance de cellules fibroblastiques.

En cas de croissance importante de fibroblastes. Effectuez une trippinisation différentielle pour retirer les fibroblastes des grandes plaques épithéliales. Lavez les cellules une fois dans le tampon STE.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitres de STE frais pour couvrir le plat d’une observation microscopique continue et de coups doux mais secs du plat contre une surface dure. Recherchez le décollement des fibroblastes pendant que les cellules épithéliales sont encore en transit adhérent. Les cultures primaires lorsque les plaques d’excroissance épithéliale approchent de la confluence.

Pour conserver la culture primaire et générer plusieurs cultures secondaires, utilisez de la trypsine partielle. Lavez les cellules une fois dans le tampon STE, puis ajoutez du STE frais pour couvrir le plat. Vérifiez qu’environ 50 % des cellules se sont détachées.

Ajoutez ensuite deux millilitres de sérum contenant du milieu de croissance et récoltez les cellules. Transférez ensuite les cellules dans un tube stérile de 15 millilitres après deux lavages. La mise en commun des cellules récoltées et de la culture La mise en culture partielle peut être répétée environ quatre à huit fois avec une bonne repousse cellulaire à partir des plats primaires et avec une croissance équivalente à long terme à partir de la sous-culture ou des secondaires congelés.

Nous recommandons de congeler les cellules de la première trypsinisation partielle pour la conservation et d’utiliser les cellules de la deuxième combinaison pour la sous-culture. Lorsque le tissu est correctement digéré et filtré, les organoïdes affichant des structures canalaires et alvéolaires peuvent être vus avec des bords lisses sans stroma attaché. S’il n’est pas suffisamment digéré, il y aura du matériel attaché et plus de contamination par les fibroblastes s’il est trop digéré, les bords seront rugueux et la fixation sera moins efficace après la fixation des organoïdes.

La croissance épithéliale commence dans les 48 à 72 heures à 48 heures. Il n’y a pas encore de division cellulaire active avec mitose visible à 72 heures. La mitose devrait devenir plus visible.

De petits morceaux de système vasculaire peuvent être une source de croissance des cellules mésenchymateuses après quatre jours. Les excroissances épithéliales présentent des populations morphologiquement hétérogènes ici, la coloration avec des anticorps contre la kératine 14 et la kératine 19 marque les lignées myoépithéliales vertes K 19 positives et rouges K 14 positives, ainsi que les cellules progénitrices jaunes K 14 positives K 19 positives. Le HMEC peut être cultivé dans différentes formulations de milieux.

Les milieux à faible stress tels que le M 87 a complété par la toxine cholérique et l’ocytocine favoriseront la croissance supérieure à long terme du HMEC normal avant la stase, ainsi que la croissance de plusieurs lignées HMEC. Les résultats de l’analyse des faits illustrent la diversité des lignées chez les organoïdes non cultivés et dans le quatrième passage, les HMEC cultivés en M 87, un milieu. Ici, les populations luminales et myoépithéliales sont identifiées par l’expression de marqueurs luminaux, EPCA et CD 2 27 et marqueurs myoépithéliaux CD 49 F et CD 10 replaqués.

Quatrième passage, HMEC. La lignée des faits enrichis pour les marqueurs luminaux et myoépithéliaux précédents a été confirmée par des analyses d’immunofluorescence pour la kératine K 14 et K 19 HMEC. Cultivés sur du plastique jusqu’au passage quatre, ils sont capables de former des structures organisées, avec des relations de lignée in vivo de cellules luminales et myoépithéliales lorsqu’elles sont placées dans des cellules appropriées : les CD 2 27 et CD 10 sont utilisés pour enrichir ces deux lignées.

Les HMC conservent leur capacité à former une bonne organisation cellulaire 3D dans des micro-puits 3D à motifs micro avec des cellules luminales à l’intérieur des cellules myoépithéliales. Les cellules progénitrices enrichies en matériaux peuvent également former des structures 3D robustes lorsqu’elles sont plaquées dans du matrigel, imitant les structures ductulaires et alvéolaires. Les structures 3D de Matrigel présentent également une auto-organisation 3D appropriée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les parties épithéliales de la glande mammaire sans le stroma mammaire associé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur une période de deux à trois jours. La technique de traitement des tissus est généralement simple.

Il est important de se rappeler d’arrêter la digestion au bon moment.