Name: Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse du développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance chez la souris. Cette technique d'imagerie temps réel permet d'étudier la migration cellulaire dans leur environnement naturel.

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Nous tenons à remercier Arumae Urmas pour partager un protocole de collagène et Jutta Fey et Ursula Hinz d&#39;assistance technique excellente. En outre, nous tenons à remercier Christian F. Ackermann, Ulrike Engel et le Nikon Imaging Center à l&#39;Université de Heidelberg et aussi Joachim Kirsch d&#39;avoir bien voulu contribuer à la shoting vidéo. Le travail a été partiellement financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

1. Préparation de gels de collagène <ol><li> Préparer le milieu de stock, contenant 455 ul MEM 10x, 112 ul de 7,5% de NaHCO 3, 50 ul glutamine et NaOH. La concentration et la quantité de NaOH dépend de la préparation de collagène de queue de rat (voir 1.2), le volume final du milieu stocks étant 1,000 pi. </li><li> Préparer du collagène de queue de rat selon la Ebendal (1). Conserver la solution de collagène à 4 ° C. Une dégradation de la solution de collagène n&#39;a pas pu être observée. Après la préparation d&#39;un nouveau lot, estimer la concentration de NaOH nécessaire pour le support d&#39;actions (voir 1.1). Utiliser l&#39;indicateur de pH du milieu pour le titrage de la quantité et la concentration de NaOH. 800 ul acide de collagène de queue de rat ont à prendre une teinte rouge lorsqu&#39;il est mélangé avec 210 ul du milieu boursier. Si la concentration de NaOH est trop faible, la solution devient jaune collagène, du fait de l&#39;indicateur de pH du milieu. Ajouter le collagène dans le milieu et mélanger sans produitspremière utilisation de bulles. Exécutez ces étapes sur la glace. La polymérisation a lieu dans les 2 heures après la solution de collagène et le moyen de stock ont ​​été mélangés et la nouvelle solution est incubée à 37 ° C. Testez cela avant de commencer une expérience. 1,3) Mélanger 800 ul de solution de collagène avec 210 de moyenne ul stock (voir 1.2). Placer 100 ul de cette solution dans les puits d&#39;une diapositive 8 chambre bien. Incuber les lames à 37 ° C, 5% de CO 2 et les conditions humides dans un incubateur de culture cellulaire. Préparer les gels de collagène sous un banc de culture cellulaire et des conditions stériles. Le collagène gelatinise dans les 2 heures. </li></ol> 2. Dissection de SCGs embryonnaires <ol><li> Récolte des embryons de souris gravides temps (E16-18) de l&#39;utérus et gardez-les dans du PBS jusqu&#39;à nouvel nécessaire. </li><li> Disséquer un embryon à partir de l&#39;amnios. Décapiter l&#39;embryon caudale du niveau de la clavicule. Fixer la tête sur un plat en bas de silicium avec des insectes &quot;aiguilles&quot;. La face ventrale de la tête doit faire face à vous unD Vous devez voir la région sous-maxillaire. La fixation permet de faciliter la préparation. </li><li> Retirez la peau de la région sous-maxillaire gauche et à droite, et avec elle le tissu conjonctif sous-cutané. </li><li> Retirez les glandes sous-maxillaires salivaires de leur emplacement pour dégager la vue sur l&#39;os hyoïde, les muscles infrahyoidal et le muscle sterno. </li><li> Enlevez ces muscles avec soin pour dégager la vue sur le larynx et la trachée. Retirer la trachée et le larynx. Les artères carotides sont alors visibles des deux côtés sur les muscles prévertébraux. La CTB est situé à la bifurcation de l&#39;artère carotide et a une forme ovale. Retirez délicatement les ganglions et les placer dans du PBS. Retirez délicatement les ganglions des outils de dissection, si elles s&#39;en tiennent à leur disposition. Il est avantageux d&#39;utiliser une pince ainsi qu&#39;un porte-aiguille monté avec une &quot;aiguille papillon&quot; pour le retrait CTB. </li><li> Une fois dans du PBS, stocker les ganglions à la température ambiante dans du PBS jusqu&#39;à ce que vous disséqué enouganglions gh. Ensuite, nettoyer les ganglions des vaisseaux sanguins et des tissus conjonctifs. La dissection CTB et le nettoyage sous un microscope à dissection placé sous un banc à flux laminaire. </li><li> Enfin, placer les noyaux explanté sur les gels de collagène gélatinisé à l&#39;aide d&#39;aiguilles de seringues montées sur une seringue pour une manipulation plus aisée. </li><li> Incuber les explants CTB sur le collagène gélatinisé dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec des conditions de CO 2 humide et 5%. </li></ol> 3. Traitement des explants SCG <ol><li> Après 1-2 heures d&#39;incubation, couvrir le collagène explant CTB contenant avec 100 pl de milieu de culture contenant Neurobasal cellule B27 supplément, la glutamine et des antibiotiques. Maintenant les puits des diapositives de chambre contenir un volume de 200 pi (100 ul gel et 100 pl de milieu). Ajouter un autre ul 200 de la moyenne, mais maintenant contenant NGF (60 ng / ml) pour faciliter la croissance axonale. En conséquence, la concentration finale est NGF 30 ng / ml. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pour étudier l&#39;apparition de la SC migration, ajoutez d&#39;autres facteurs directement au jour in vitro 0 (DIV0). Dissoudre les facteurs du milieu contenant du NGF dans le double concentration nécessaire (2). </li><li> Afin d&#39;analyser l&#39;impact sur la SC, qui ont déjà commencé la migration le long des axones, ajouter des facteurs supplémentaires à DIV3 jusqu&#39;à DIV4 (arrêt potentiel de l&#39;expérience). À cette fin, retirez avec précaution 180 ul de la solution, à DIV3, et ajouter 200 ul NGF milieu neuf contenant et les autres facteurs d&#39;intérêt à la concentration double (2). </li></ol></li></ol> 4. Imagerie time-lapse Utiliser un microscope inversé pour les analyses. Divers objectifs peuvent être utilisés, en définissant le champ de vision et le grossissement. Un aspect important, cependant, est la distance de travail de l&#39;objectif utilisé, comme l&#39;imagerie des explants CTB est effectuée par la lame de verre et le collagènegel. La cadence d&#39;enregistrement des 1/10-30 minutes a montré de bons résultats (2). Cependant, cet aspect doit être ajusté à la question scientifique. Une caméra CCD normale peut être utilisée pour l&#39;acquisition des images. Pour l&#39;imagerie en accéléré une chambre d&#39;incubation de culture cellulaire doit être fixé à la platine du microscope. Incuber le tissu lors de l&#39;imagerie à 37 ° C, avec des conditions de CO 2 humide et 5%. Démarrer le système d&#39;incubation une heure avant le début de la formation d&#39;image. Ceci permet aux parties (par exemple, microscopie objectif), y compris la chambre de coulissement pour régler la température et évite les dérives induites par la température. Définir des domaines spécifiques d&#39;analyses (dans le explant et entre les différents explants) à l&#39;aide du logiciel microscope et une étape contrôlée par logiciel motorisé (réglage multiposition) pour les analyses simultanées de différentes conditions appliquées aux explants SCG. Pour imagerie time-lapse de type sauvage tissu ainsi que des tissus d&#39;animaux transgéniques peuvent être utilisésmarquant le SC (S100B: GFP) (3). Pour fluorophores imagerie d&#39;une source de lumière fluorescente doit être mis en œuvre dans la configuration micropscope. Utiliser les filtres standards. 5. Quantification des distances de migration SC <ol><li> Au point de fin (DIV4 par exemple), fixer les gels de collagène avec 4% de PFA dans la chambre de coulissement pour 3-4 heures. Consécutivement laver les gels de collagène 5 fois pendant 10 minutes avec du PBS. Appliquer des protocoles normalisés pour l&#39;immunocytochimie (2). Si vous êtes nouveau à la préparation du GEC, vérifier l&#39;identité du ganglion en ganglion sympathique par immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (TH) un marqueur commun pour les cellules catécholaminergiques. Au cours de l&#39;immunohistochimie (après l&#39;anticorps primaire), transférer les gels de collagène contenant des explants de plaques à 24 puits, qui ont un plus grand volume, ce qui est bénéfique pour le lavage des gels. </li><li> Après immunohistochimie, placer soigneusement les gels de collagène sur des lames de verre. Soigneusementenlever le reste de la solution et laisser sécher le collagène / réduire à deux dimensions. Cela permet de mesurer facilement les distances (2). Après cela, montez les échantillons. </li><li> Enfin, mesurer les distances de migration à l&#39;aide de Fidji (NIH) des logiciels. Aucun plugin spéciaux sont nécessaires à cette fin. Afin de permettre des mesures correctes dans um, vérifiez les métadonnées imagerie correcte et les paramètres sous les Fidji, l&#39;image et l&#39;échelle. Utilisez Fidji ont également pour la quantification des cellules. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
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<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
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<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le développement du système nerveux périphérique est un processus passionnant. Lorsque le développement est terminé, les axones sont entourées par SC sur toute la longueur, ce qui peut, chez l&#39;homme, souvent plus de 100 cm. À cette fin, le nombre exact des SC requis doit être établi au cours du développement et les SC ont aussi à se déplacer le long des axones s&#39;étendent à la périphérie pour assurer la couverture complète des axones. Cela est vrai pour myélinisées, mais aussi pour les axones unmeylinated. Dans l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> MEM 10x </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium (7,5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Roche </td><td> 1058231 </td><td> R &amp; D # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Moyen Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> antibiotiques </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> aiguilles d&#39;insectes </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> aiguille de la seringue </td><td> Braun </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 Faites glisser chambre bien </td><td> Lab tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyser murin développement des cellules de schwann le long des axones en croissance

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

Le développement des nerfs périphériques est un processus fascinant. Neurones envoient des axones innervent à des objectifs spécifiques, qui chez l&#39;homme sont souvent de plus de 100 cm du soma du neurone. La survie neuronale au cours du développement dépend de facteurs de croissance dérivés cible, mais aussi sur le soutien des cellules de Schwann (CS). Vers l&#39;extrémité des axones ensheath sc de la région de la soma neuronale (ou la transition de la centrale au système nerveux périphérique) de la synapse ou de la jonction neuromusculaire. Les cellules de Schwann sont des dérivés de la crête neurale et migrent le long des axones en tant que précurseurs émergents jusqu&#39;en l&#39;axone entier est couvert de SC. Cela montre l&#39;importance de la migration SC pour le développement du système nerveux périphérique et souligne la nécessité d&#39;enquêter sur ce processus. Afin d&#39;analyser le développement SC, une configuration qui est nécessaire à côté des castes repose aussi sur le substrat physiologique de la migration, de l&#39;axone. En raison du développement intra-utérin <em&gt; in vivo imagerie time-lapse, cependant, n&#39;est pas réalisable chez les vertébrés placentaires comme la souris (Mus musculus). Pour contourner cela, nous avons adapté la technique supérieure du col explant ganglion (CTB). Lors du traitement avec le facteur de croissance des nerfs (NGF) explants CTB étendre les axones, suivis par des précurseurs SC migrent le long des axones du ganglion vers la périphérie. La beauté de ce système est que le SC sont issus d&#39;un pool de SC endogène et qu&#39;ils migrent le long des axones leurs propres physiologiques qui se développent en même temps. Ce système est particulièrement intéressant parce que le développement SC le long des axones peuvent être analysées par imagerie time-lapse, ouvrant de nouvelles possibilités pour mieux comprendre la migration en SC.

La croissance axonale est facilitée à partir SCG explants par traitement avec NGF (4) (schéma de film S1 Figure 1 schéma). Ce processus est facilement visible par n&#39;importe quel microscope inversé et peut être suivi par imagerie time-lapse (film S2). Si un scientifique est nouveau pour disséquer CTB à partir d&#39;embryons de souris, nous recommandons fortement une validation de la technique par un simple anti-tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochimie. TH est un marqueur commun po...

Nous décrivons ici une cellule de Schwann (SC) essai de migration dans lequel SC sont en mesure de développer le long des axones s&#39;étendent.

Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

L’objectif de l’expérience suivante est d’analyser le développement des cellules de Schwan le long des axones en croissance, leur habitat naturel. Ceci est réalisé en explant d’abord les ganglions cervicaux supérieurs, ou S cg d’embryons de souris sur les matrices de collagène dans un deuxième temps. Les S cg sont traités avec le facteur de croissance nerveuse ou NGF, qui facilite la croissance axonale des neurones SCG de manière coronale.En plus de la croissance axonale à partir de l’explan X, on peut observer des cellules de Schwan endogènes migrer le long des axones étendus vers la périphérie. Le développement des cellules de Schwan peut être analysé par imagerie time-lapse et également par analyse des points finaux des tissus fixés, ce qui permet des mesures de distance. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de migration des rayures, est que l’habitat naturel des cellules du cygne est inclus dans ce test.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme l’assemblage correct des métriques de collagène et la dissection correcte des sgs sont la clé du succès. Ces étapes ne sont pas particulièrement difficiles à

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Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Cette vidéo montre le modèle de coculture d’un explant ganglionnaire de la racine dorsale et de cellules de Schwann. Dans des conditions de coculture, l’acide ascorbique favorise la différenciation des cellules de Schwann en formes myélinisantes. Les cellules de Schwann myélinisantes enveloppent les axones plusieurs fois pour créer une gaine de myéline, essentielle à la fonction nerveuse.

Co-culture d’un explant de ganglion de la racine dorsale avec des cellules de Schwann pour la myélinisation des neurones

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Ce protocole décrit l’isolement des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) isolés de rats et la culture de neurones DRG sur un système de culture cellulaire statique pré-étiré pour améliorer l’alignement axonal, avec co-culture ultérieure de cellules de Schwann (SC) pour favoriser la myélinisation.

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

Un présagéex-invivo permet d'imaginer l'excroissance du nerf oculomoteur en temps réel. Les tranches sont générées par l'intégration d'embryons E10.5 IslMN:GFP dans l'agarose, en coupant sur un vibratome et en grandissant dans un incubateur de toit de scène. Le rôle des voies de guidage d'axone est évalué en ajoutant des inhibiteurs aux médias de culture.

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Découvrez une méthode d'analyse du développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance chez la souris. Cette technique d'imagerie temps réel permet d'étudier la migration cellulaire dans leur environnement naturel.

Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

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