Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

L’objectif de l’expérience suivante est d’analyser le développement des cellules de Schwan le long des axones en croissance, leur habitat naturel. Ceci est réalisé en explant d’abord les ganglions cervicaux supérieurs, ou S cg d’embryons de souris sur les matrices de collagène dans un deuxième temps. Les S cg sont traités avec le facteur de croissance nerveuse ou NGF, qui facilite la croissance axonale des neurones SCG de manière coronale.

En plus de la croissance axonale à partir de l’explan X, on peut observer des cellules de Schwan endogènes migrer le long des axones étendus vers la périphérie. Le développement des cellules de Schwan peut être analysé par imagerie time-lapse et également par analyse des points finaux des tissus fixés, ce qui permet des mesures de distance. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de migration des rayures, est que l’habitat naturel des cellules du cygne est inclus dans ce test.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme l’assemblage correct des métriques de collagène et la dissection correcte des sgs sont la clé du succès. Ces étapes ne sont pas particulièrement difficiles à apprendre.

Ils ont juste besoin de pratique d’abord. En travaillant dans une cagoule de culture tissulaire, j’ai compris nos conditions avec toutes les solutions sur la glace. Préparez le milieu de culture mère et le collagène de la queue de rat selon les instructions du protocole écrit.

Mélangez, 800 microlitres de collagène de queue de rat avec 210 microlitres de milieu de stock. Sans introduire de bulles, la solution doit rester de couleur rouge. Si la solution jaunit, la solution de collagène Ratal est trop acide et doit être refaite avec une plus grande concentration d’hydroxyde de sodium pipette 100 micro libération de la solution dans chaque puits d’une lame multi-puits et assurez-vous que le fond de chaque puits est complètement couvert.

Placez les plats dans un incubateur de culture de tissus humidifié réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après la récolte, les embryons E 16 à E 18 sont placés dans une boîte de Pétri contenant du PBS puis disséqués à partir de l’amnios et décapités au niveau cordal du C claviculaire. Les régions de la tête et du cou sont ensuite transférées dans une boîte inférieure en silicone, et tout en regardant à travers un microscope de dissection, des aiguilles d’insectes sont utilisées pour épingler le tissu dans les régions sous-mandibulaire et claviculaire.

Utilisez maintenant une pince pour enlever la peau et le tissu sous-cutané de la région sous-mandibulaire. Ensuite, retirez les glandes salivaires sous-mandibulaires pour révéler les muscles supra-hyoïde, infra-hial et sternocléido-mastoïdien. Ensuite, utilisez une pince pour retirer soigneusement les muscles infra hial et sternocléido-mastoïdien afin de révéler le larynx et la trachée.

Saisissez la trachée avec la pince et soulevez la trachée et le larynx. Une fois le larynx et la trachée enlevés, les artères carotides sont visibles, sont des deux côtés des muscles prévertébraux. Les ganglions cervicaux supérieurs sont situés dans la bifurcation des artères carotides et peuvent être identifiés comme une forme ovale.

À l’aide d’une pince et d’un porte-aiguille monté avec une aiguille à insectes, retirez les ganglions cervicaux supérieurs et placez-les dans un plat frais contenant du PBS, puis disséquez tous les vaisseaux sanguins ou tissus connectés des ganglions. À l’aide d’aiguilles de seringue, retirez les gels de collagène gélatinisés de l’incubateur et utilisez des aiguilles de seringue montées sur des seringues pour transférer les ganglions sur les gels. Placez les explants dans l’incubateur de culture tissulaire réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et dans des conditions humides pendant une à deux heures.

Après une à deux heures d’incubation, les explants de ganglions cervicaux supérieurs sont récupérés de l’incubateur de culture tissulaire et 100 microlitres de milieu neurobasal contenant de la glutamine et des antibiotiques sont ajoutés à chaque explan. Par la suite, 200 microlitres de milieu neurobasal contenant 60 nanogrammes par millilitre. Le NGF est également ajouté aux puits pour faciliter la croissance axonale.

Des substances d’essai peuvent également être ajoutées à ce moment, qui est défini comme le jour zéro in vitro, pour étudier l’effet sur les cellules de cygne qui ont déjà commencé à migrer. Les substances Axons peuvent être administrées in vitro pendant trois jours en prélevant 180 microlitres du milieu existant et en les remplaçant par 200 microlitres de milieu contenant la substance d’intérêt et le NGF au double de la concentration finale, l’imagerie en accéléré est réalisée à l’aide d’une configuration de microscope inversé qui permettra l’incubation parallèle de la culture cellulaire et l’imagerie en accéléré pour comparer différentes substances d’essai. Dans une expérience, un réglage multi-positions est recommandé au point final de l’expérience.

Après avoir fixé les explants dans les lames de culture avec 4 % de PFA pendant trois à quatre heures et lavé avec du PBS, effectuez l’immunohistochimie pour valider l’explant X car le SCG bloque le tissu avec du PBS contenant 10 % de sérum d’âne normal et 2 % de tritton X 100 pendant deux heures. Ensuite, l’incubation d’anticorps primaires dans une solution bloquante pendant la nuit. Le lendemain de l’incubation de l’anticorps primaire, transférez l’explan X contenant des gels dans une plaque à 24 puits après le lavage au PBS, incubez avec des anticorps secondaires marqués fluorescents pendant deux heures à l’abri de la lumière, puis lavez avec du PBS et incubez avec une solution dappy pendant 10 minutes.

Après plusieurs lavages, placez les gels de collagène contenant l’explan X sur un microscope, glissez, séchez les lames et montez ensuite avec du veau. Utilisez un microscope fluorescent standard pour obtenir des images en vue d’une analyse quantitative ultérieure. Il est utile que le logiciel du microscope soit capable d’enregistrer des métadonnées.

L’analyse quantitative des images obtenues peut être effectuée avec le logiciel Fiji ou ImageJ, qui peut être utilisé gratuitement pour des applications scientifiques. La croissance axonale d’un schéma SCGX EXPLAN sur quatre jours in vitro est démontrée dans ce film. L’immunohistochimie peut être réalisée au quatrième jour in vitro pour identifier clairement le ganglion explanté.

En tant que ganglion sympathique, on peut observer des cellules de Schwan migrer le long de l’axone, se déplaçant du ganglion cervical supérieur vers la périphérie. Cette vidéo montre le même schéma de migration que celui observé à un grossissement plus élevé. Les distances de migration peuvent être facilement mesurées sur des échantillons contre-colorants pour les noyaux avec DPI en mesurant la distance entre les noyaux des cellules de Schwan principales et la bordure du SCG explanté à plusieurs endroits, comme le montre le schéma et l’image d’un échantillon traité NGF marqué DPI à quatre jours in vitro, cette vidéo montre la migration des cellules de Schwan au bord d’un explan SCG.

La combinaison du fond clair et de la fluorescence permet de visualiser les cellules de cygne positives à la GFP S 100 et les axones. Enfin, ce film montre la migration des cellules de Schwan à la frontière d’un ganglion cervical supérieur ex explan. Ici, seul le canal de fluorescence est montré, ce qui permet une interprétation plus facile des cellules de Schwan S 100 GFP positives.

À la suite de cette procédure, des analyses quantitatives supplémentaires peuvent être effectuées, comme la quantification de la prolifération d’une cellule ou la quantification de l’apoptose d’une cellule. Bien sûr, l’immunohistochimie adéquate doit être effectuée pour l’analyse des paramètres ou les animaux transgéniques spécifiques doivent être utilisés pour montrer les effets dans le contexte vivant.