Name: Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Apprenez l'électroporation in ovo pour étudier le rôle des microARN dans le développement du mésencéphale chez l'embryon de poussin. Cette méthode permet une transfection sélective des régions ventrales et dorsales.

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Nous reconnaissons K. Mikic, qui ont contribué à la phase initiale de ce film et M. Nicolescu pour l&#39;image miR. C. Huber a été soutenue par une bourse de la IZKF du Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand par le programme fortune de la Universtitätsklinikum Tübingen.

Une. Exigences pour les ovo En électroporation <ol><li> Préparation de la construction de vecteur: miR amorces sens et antisens ont été conçus après les instructions de Ambion, recuits et ligaturées dans Apal / digéré par EcoRI U6.1 vecteur pSilencer. Après une transformation réussie des clones résultants a été cultivée et pSilencer plasmide a été isolé par la méthode de la lyse alcaline à l&#39;aide d&#39;un kit de préparation Qiagen midi. </li><li> Électrodes: Les électrodes peuvent être achetés ou facilement être construits 13. Nous utilisons des électrodes de self-made de fil de platine (Φ = 0,2, 0,25 ou 0,5 mm de diamètre) ou, dans certains cas, un fil-électrode de tungstène encore plus faible (Φ = 0,1 mm) 8 en fonction de la zone que nous voulons pour l&#39;électroporation. Pour éviter de brûler du tissu, nous utilisons en règle générale la plus proche du tissu le plus mince des électrodes. Pour large électroporation de mésencéphale, nous utilisons 0,5 fils de platine mm soudées à un tube laiton / acier inoxydablearbre et fixée à un porte-électrode avec un rayon de 5.3 mm (figure 1). Pour l&#39;électroporation des domaines spécifiques, on utilise 0,25 mm anodes en fil de platine de 0,2 mm et un fil de platine ou de tungstène de 0,1 mm de la cathode à une distance d&#39;environ 1 mm ou moins. </li><li> Solutions: Demandez les solutions suivantes Prêt: <ol><li> Assortie de poulet à l&#39;autoclave, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g de KCl, 0,24 g de CaCl2, dissoudre dans 1 L d&#39;eau distillée). </li><li> PBS (NaCl 8 g, 0,2 g de KCl, 0,24 g de KH 2 PO 4, 1,44 g de Na 2 HPO 4, dissoudre dans 1 litre de H 2 O distillée). </li><li> Fast Green: solution mère à 10 mg / ml H 2 O distillée </li><li> Encre de séchage lent (moins de laque et donc moins empoisonnement de l&#39;embryon). Remarque: un filtre dichroïque bleu fixé à une lampe à fibre optique tel que décrit dans Canto-Soler et Adler 14 améliore le contraste et peut éliminer la nécessité d&#39;injecter de l&#39;encre. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1highres.jpg"/> Figure 1. Diagramme schématique des électrodes et du porte-électrode. (A, B, C), le fil de platine est soudé à un côté d&#39;un arbre tubulaire en acier inoxydable. Un trou a été percé dans l&#39;autre extrémité de l&#39;arbre tubulaire ainsi que des fiches à broches peuvent s&#39;adapter po (A) et de fils de couleur rouge bleu ont été connectées aux fiches à broches. À l&#39;autre extrémité du fil a été installé sur les fiches bananes qui travaillent avec les prises électriques de la électroporateur. (A, C) Le fil de platine a été plié en un ange de 90 °. Une couche de vernis à ongles isolé l&#39;arbre au-dessus du coude. 2. Préparatifs directement devant Dans ovo électroporation <ol><li> Préparer le matériel suivant: <ol><li> Diluer l&#39;encre avec du poulet sonnerie 01:06, ajouter la solution antibiotique-antimycosique (100x de GIBCo) 1:100. </li><li> Préparer la solution de vecteur: 1-2 pg / pl par ADN spécifique en H 2 O complété avec Green rapide (1:20). </li><li> Stériliser pinces, ciseaux, aiguilles de tungstène et des électrodes avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Tirer micropipettes pour l&#39;injection de l&#39;acide nucléique à partir de capillaires en verre de borosilicate (longueur à diamètre extérieur: 100 mm x 0,9 mm). Nous utilisons simple extracteur PUL-1 (WPI, Berlin) avec les paramètres indiqués dans le tableau 1. </li><li> Régler les paramètres de l&#39;électroporateur comme indiqué dans le tableau 2. </li></ol></li></ol><table border="1" ><tbody><tr><td fo:width="1in"> Paramètres </td><td fo:width="1in"> Valeurs </td></tr><tr><td> Chaleur </td><td> 350 </td></tr><tr><td> Tirer </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Vitesse </td&gt; <td> 50 </td></tr><tr><td> Retard </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réglages pour PUL-1 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> Paramètres </td><td fo:width="1.5in"> Valeurs </td></tr><tr><td> Fréquence </td><td> 50 Hz </td></tr><tr><td> Retard </td><td> 20-50 msec * </td></tr><tr><td> Largeur </td><td> 20 msec </td></tr><tr><td> Tension </td><td> 8-25 V * </td></tr><tr><td> Impulsion </td><td> 3 - 5 fois </td></tr><tr><td colspan="2"> * Selon le diamètre de l&#39;électrode et de la distance. S&#39;il vous plaîten tenir compte lors du changement de l&#39;un des paramètres. </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réglages pour le stimulateur d&#39;impulsions <ol start="2"><li> Préparer des embryons de poulet pour l&#39;électroporation: <ol><li> Incuber des oeufs de poule fécondés, de leur côté plus de 37 ° C avec 65% d&#39;humidité pour 39 h d&#39;acquérir embryons entre Hamburger &amp; Hamilton (HH) met en scène 15 9-11. L&#39;embryon s&#39;installe à la partie supérieure de l&#39;œuf, de sorte que vous devrait marquer avec un trait de crayon. </li><li> Désinfecter les œufs avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Percer l&#39;œuf à son côté plus large, où la cavité d&#39;air devrait être. </li><li> Retirez 1-2 ml de blanc d&#39;oeuf. Cela détacher l&#39;embryon de la coquille. </li><li> Cello-bande la coquille pour éviter les éclats d&#39;obus tombent sur l&#39;embryon. Utilisez une paire de ciseaux pour couper une petite fenêtre dans la coquille autour de la ligne de crayon. </li><li> Injecter un peu d&#39;encreen dessous de la zone opaca de visualiser l&#39;embryon. </li><li> Faire une coupe dans la membrane vitelline avec une aiguille de tungstène aiguisées pour obtenir une meilleure accessibilité de l&#39;embryon pour l&#39;injection de l&#39;acide nucléique et l&#39;électroporation. </li></ol></li></ol> 3. Électroporation et incubation <ol><li> Ajouter quelques gouttes de solution de Ringer chaud sur les embryons. Cela permettra de diminuer les embryons, d&#39;éviter toute surchauffe, le collage des électrodes au tissu et à fournir un support pour le courant entre les deux électrodes. </li><li> Injecter la solution de vecteur dans la lumière du tube neural au niveau du mésencéphale. Si le vecteur d&#39;expression d&#39;ADN ne contient pas de gène rapporteur (par exemple EGFP), ajouter un vecteur de gène rapporteur légèrement inférieure concentré (1 ug / ul miR vecteur exprimant à 0,9 ug / vecteur du gène rapporteur ul) à la solution d&#39;ADN. Cela permettra d&#39;assurer que vous reconnaissez cellules transfectées plus tard 8. Nous utilisons le vecteur soi-disant pCAX, un cadeau aimable vientm C. Krull 13. </li><li> Pour une large transfection du mésencéphale, placer les électrodes gauche et à droite de l&#39;embryon à la hauteur du mésencéphale. La distance entre les électrodes doit être d&#39;environ 3-5 mm. Les autres paramètres sont 15V, 20 impulsions ms et 50 ms de retard pour HH 10. Le changement de position des deux électrodes légèrement le long de la (DV) axe dorso-ventral du mésencéphale assure une plus large transfection de cellules de la transfection de l&#39;axe de DV. </li><li> Pour la transfection ventrale, ajouter un peu de sonnerie de relever la tête de la membrane du jaune et placer l&#39;anode sous mésencéphale ventral. Si la tête ne dépasse pas pousser l&#39;électrode sous la membrane qui sépare le jaune et l&#39;embryon d&#39;éviter de brûler du tube neural. La cathode doit être placé au-dessus du mésencéphale dorso-latérale opposée à l&#39;anode. Ne touchez pas le tube neural. Nous transfecter la moitié ventrale du mésencéphale gauche pour éviter des difficultés avec le développement du cœur. La distance entre les électrodesest d&#39;environ 1-0,5 mm, le reste des paramètres sont 10V, 20 msec de large et 50 ms de retard. </li><li> Appliquer une goutte de solution saline sur des embryons pour la refroidir et enlever les bulles d&#39;air. </li><li> Sceller les oeufs avec la bande et incuber pendant au moins 4 heures, le temps minimum requis pour l&#39;expression de vecteur. </li></ol> 4. Fixation des embryons de poulet <ol><li> Retirez les embryons de leurs œufs. </li><li> Embryons nettoyer sous un stéréomicroscope et d&#39;évaluer l&#39;ampleur de la transfection avec un microscope stéréo fluorescent. </li><li> Fixer les embryons pendant la nuit dans 4% PFA à 4 ° C. Procéder à la coupe et / ou coloration (hybridation in situ, immunohistochimie) pour analyser les changements dans le domaine transfectées. </li></ol>

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<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation%3A+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li>
<li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2%2C+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10(2012).</li>
<li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter%2Fsensor+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Cette vidéo montre une méthode efficace pour transfecter le plasmide dans les cellules neuro-épithéliales des zones spécifiques du cerveau moyen de poussin. Impulsions électriques rectangulaires de basse tension peuvent introduire de l&#39;ADN dans des cellules du tube neural de poussin in ovo 6,16. Toutefois, la précision de ciblage de l&#39;ADN est souvent entravée par le champ électrique de large, qui s&#39;élève à travers les relativement grandes électrodes (Φ = 0,5 mm). Nous avons essayé de s&#3...

La reconnaissance de petits ARN non-codants que les joueurs supplémentaires pour l&#39;expression du gène a lancé une nouvelle complexité à la réglementation génomique programmation / de gène. Différentes espèces d&#39;ARN non-codants ont une importance fonctionnelle dans les cellules neuronales, y compris les petits ARN non-codant 1-4. Les microARN miR (ou miARN) par exemple montrent des profils d&#39;expression distincts et l&#39;évolution dans le cerveau en développement 5. Ciblée dans électroporation in ovo d&#39;embryons de poulet offre une occasion unique pour le contrôle temporelle et spatiale de l&#39;expression génique et de la répression au cours du développement. Cette vidéo montre les différentes étapes de réalisation d&#39;expression ectopique de mirs dans des zones spécifiques du cerveau moyen de poussin en utilisant l&#39;électroporation in ovo 6-10. Pour assurer un effet de longue durée de ces petits ARN non codants dans les cellules, la séquence d&#39;ADN de mirs ont été clones dans des vecteurs de mono-ou bi-cistroniques. Pour en électroporation in ovo, miR contenant vecteur est injecté dans le tube neural par exposition du mésencéphale embryonnaire après avoir effectué une petite fenêtre dans la coquille de l&#39;oeuf. Pour transfecter des zones spécifiques du petit plus mésencéphale (anode) et moins (cathode) électrodes de platine sont placés à des positions spécifiques. Pour la transfection du mésencéphale ventral, l&#39;anode est placée sous le mésencéphale ventral gauche et la cathode au-dessus de la moitié droite du mésencéphale avant l&#39;application d&#39;un courant. L&#39;ouverture dans la coquille d&#39;oeuf est fermé avec la bande et les embryons sont incubés pendant aussi longtemps que nécessaire pour toute l&#39;analyse. Cette méthode a été décrite par Muramatsu et al. 6 et amélioré par Momose et al. 8 pour la zone transfection spécifique. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> Vue d&#39;ensemble schématique. <ol><li> L&#39;embryon dans l&#39;œuf est exposée en coupant une petite fenêtre en ee coquille. </li><li> Le vecteur (s) en solution est injecté dans le mésencéphale en utilisant un micro-capillaire. </li><li> Deux électrodes placées parallèlement - ou en dessous et au-dessus de l&#39;embryon, - générer un champ électrique pulsé. </li><li> Le champ électrique crée temporairement des pores dans la membrane cellulaire, ce qui facilite l&#39;entrée dans la cellule par l&#39;ADN chargé négativement (ou d&#39;ARN) attirés par l&#39;anode 11,12. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Capillaires en verre borosilliqué </td><td>Hartenstein</td><td></td><td>Modèle : 0,9 mm</td></tr><tr><td>Extracteur microcapillaire</td><td>WPI, Berlin</td><td></td><td>Modèle : Pul1-E</td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Intracel</td><td></td><td>Modèle : TSSIC</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope - fluorescence </td> Modèle <td>LEICA</td><td></td><td>: MZFLIII</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modèle : Stemi</td></tr><tr><td>Caméra et logiciel</td> Modèle <td>Zeiss</td><td></td><td>: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td></tr></tbody></table>

dans expression in ovo de microarn dans ventrale poussin mésencéphale

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Les ARN non codantes sont des acteurs supplémentaires dans la régulation de l&#39;expression génique. Ciblée dans électroporation in ovo de domaines spécifiques fournit un outil unique pour le contrôle spatial et temporel de l&#39;expression de microARN extra-utérine. Cependant, les structures du cerveau comme le mésencéphale ventral ventrales sont plutôt difficiles à atteindre pour tous les manipulations. Ici, nous démontrons un moyen efficace pour l&#39;électroporation des miARN dans le mésencéphale ventral en utilisant des électrodes de platine minces. Cette méthode offre un moyen fiable pour transfecter des zones spécifiques du cerveau moyen et un outil utile pour les études in vivo.

L&#39;étendue de la région mésencéphalique transfectée avec miR est visible au travers de l&#39;expression de GFP à partir d&#39;un vecteur rapporteur injectée en même temps que le vecteur exprimant miR (figure 2). En utilisant des électrodes en platine d&#39;un diamètre de 0,5 mm et placée parallèlement à l&#39;axe AP du conduit mésencéphale normalement à la transfection d&#39;une large zone le long de la et DV-AP-axe, dont rhombencéphale, le mésencéphale, et parfois diencéphale (figures 2A et ...

L&#39;expression ectopique est une technique permettant d&#39;éclaircir le rôle des microARN dans le développement du cerveau. Cependant, le ciblage des zones spécifiques à l&#39;aide de l&#39;électroporation in ovo est un défi. Ici, nous montrons de manière efficace à des régions du mésencéphale ventral et dorsal sélectivement l&#39;électroporation.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Une électroporation ovale commence par l'ouverture de l'acte afin d'exposer l'embryon de joue. Aux stades de Hamburger Hamilton neuf à onze, de l'ADN est injecté dans la région du mésencéphale. Ensuite, des électrodes sont placées à gauche et à droite du mésencéphale et une tension électrique est appliquée.Cela provoque une prise de l'ADN par les cellules progénitrices murales situées dans la zone ventriculaire pour la transfection ventrale. Une électrode, l'anode, est positionnée sous la membrane recouvrant l'A en dessous de la région du mésencéphale.L'électrode cathodique est placée en position latérale dorsale du côté opposé au mésencéphale avant l'application d'une tension électrique. Veillez à ce que les électrodes ne touchent pas le tube neural. Vingt-quatre heures plus tard, au stade 16 ou 17 de Hamburger et Hamilton, les embryons sont prélevés de l'œuf, fixés et analysés par des anticorps, des colorations ou une hybridation in situ.Les cellules positives pour la GFP indiquent la zone de transfection génique. L'électroporation de précurseurs d'ARN micro ou d'un duplex d'ARN micro procure un effet immédiat mais bref ; pour assurer une expression prolongée des ARN micro, nous

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Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.

Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Apprenez l'électroporation in ovo pour étudier le rôle des microARN dans le développement du mésencéphale chez l'embryon de poussin. Cette méthode permet une transfection sélective des régions ventrales et dorsales.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

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