Name: Isométrique et excentrique évaluation de génération de forces des muscles squelettiques Isolé à partir des modèles murins de dystrophies musculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Apprenez à mesurer les propriétés mécaniques des muscles squelettiques isolés chez la souris. Cette méthode évalue les contractions isométriques et excentriques pour étudier les dystrophies musculaires et tester de nouvelles thérapies.

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Ce travail a été soutenu par le Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par l&#39;Université de Pennsylvanie IACUC. 1. Dissection EDL et préparation (environ 30 min) <ol><li> Anesthésier les souris afin de s&#39;assurer qu&#39;ils n&#39;éprouvent aucune douleur ou de détresse au cours de la procédure, mais que les muscles restent bien oxygénée par la circulation. Nous utilisons régulièrement un cocktail kétamine / xylazine (100/10 mg / kg) injectée via IP. Plan chirurgical de l&#39;anesthésie est déterminé par l&#39;absence totale de pédale ou réflexes de retrait palpedral, ou l&#39;absence de réponse de tic oreille. </li><li> Immobiliser les pattes arrière à l&#39;aide de ruban médical, et enlever la peau de la partie inférieure des membres postérieurs antérieure à exposer les muscles de cette région. Garder les muscles humide par l&#39;application de PBS à intervalles réguliers. </li><li> Sous un microscope à dissection, faire une petite incision latérale du genou afin d&#39;exposer le tendon proximal du muscle EDL. Il ya deux tendons dans cette région, et les deux doivent être coupés pour permettre aux reDépose de l&#39;EDL. </li><li> À la cheville médial, couper le tendon du muscle TA pour exposer les tendons distaux de l&#39;EDL, qui s&#39;étendent le long des tarses méta. Soulevez le muscle TA de la route, en faisant attention de ne pas couper ou toucher le dessous EDL. Retour aux tendons distaux de l&#39;EDL, snip chacun et de les tirer au travers de la cheville, puis saisir les tendons, tirez doucement sur l&#39;EDL l&#39;écart du reste de la branche. Il devrait sortir de l&#39;extrémité proximale librement, mais si non, revenir à l&#39;incision latérale pour s&#39;assurer que le tendon est coupé. Retirer le muscle et le placer dans un plat rempli de dissection réfrigérés Ringers oxygénés. La broche à travers le muscle tendons à longueur approximativement au repos, qui est la longueur trouvée in vivo. La longueur est trop courte lorsque le muscle est flasque dans le plat, et trop long si le muscle est de tirer sur les broches de dissection. </li><li> Euthanasier la souris immédiatement après le retrait du muscle par dislocation cervicale. </li><li> Attachez sutures pour les dixDons, aussi près que possible du muscle, mais sans toucher le muscle. Pin le muscle au repos longueur à peu près à l&#39;aide des points de suture. </li></ol> 2. Dissection diaphragme et de préparation (environ 30 min) <ol><li> Euthanasier les souris avant cette procédure par dislocation cervicale sous anesthésie, si la souris même est soumis à deux dissections, ou par CO 2 suivie d&#39;une confirmation à la dislocation cervicale. </li><li> Faire une incision dans la peau pour exposer la cavité abdominale et thoracique. Ouvrir la cavité abdominale, et couper la paroi du corps juste en dessous des côtes. L&#39;aide de ciseaux os, et en commençant au-dessus du diaphragme d&#39;insertion, coupé autour de la cage thoracique tout en suivant la ligne de nervures, et couper à travers la colonne vertébrale. Couper les vaisseaux sanguins qui traversent le centre de la membrane de telle sorte que la membrane peut être enlevé facilement. </li><li> Retirer la membrane de la souris, et le placer dans un plat rempli de dissection Ringers oxygénés. Agiter doucement le diaphragm dans le plat pour laver le sang. Actualiser soluté de Ringer au besoin. </li><li> Couper une petite bande de la membrane à partir du tendon au centre des nervures le long de l&#39;orientation des fibres dans la partie centrale de la hemidiaphragms latérales. La bande doit être compris entre 2-4 mm de large. L&#39;aide de ciseaux os, couper la nervure de chaque côté de la bande, en laissant environ 1-2 mm surplomb de nervure de chaque côté de la bande de membrane. </li><li> Attachez sutures au tendon central. Fixation de suture à chacune des extrémités de nervures faisant saillie latéralement, et ensuite relier ceux-ci ensemble pour faire une grande boucle. </li><li> Deux bandes peuvent être obtenus auprès de toute membrane donnée (un de chaque côté). </li></ol> 3. Muscles de montage à Bath Mécanique <ol><li> Saisir les fils de suture et les utiliser pour fixer le muscle à un poste rigide sur une extrémité, et à un capteur de force sur l&#39;autre extrémité. </li><li> Réglez la longueur de s&#39;assurer que le muscle n&#39;est pas lâche, mais n&#39;est pas tendu. Une bonne approximation est le musc reposcomme dans le longueur de 1,4 à 1,5. </li><li> Bain doit être rempli avec une solution de Ringer oxygénée maintenue à 22 ° C pour prolonger la stabilité musculaire pour les tests. Les muscles doivent se reposer pendant 5 minutes dans ce bain avant le test fonctionnel de telle sorte que la température des muscles est équilibrée à 22 ° C. </li></ol> 4. Les contractions isométriques <ol><li> Mettre en place des conditions stimulation supramaximale. Après un muscle est placé dans le bain, utilisez unique de 0,5 ms impulsions de stimulation pour générer un mouvement convulsif, et de surveiller la production de force. Peu à peu, augmenter le courant jusqu&#39;à ce que la force atteigne un niveau maximum, mais régulière. Augmenter le courant à 10% de plus que ce niveau pour les expériences restantes. </li><li> Établir Longueur optimale. En utilisant des stimulations contraction isométrique, régler la longueur du muscle progressivement jusqu&#39;à ce qu&#39;une force maximale soit obtenue. Reposez le muscle ~ 10 sec entre chaque contraction. Longueur optimale du muscle (L o) est obtenue lorsque la force est maximale secousse. La longueur du muscle enregistrement (la durée seraentre les jonctions myotendineuses pour EDL, et entre la jonction centrale myotendineuse tendon et l&#39;insertion du muscle à la nervure) à l&#39;aide des étriers Vernier. </li><li> Force maximale isométrique tétanique. Stimuler le muscle fixé à L o pour une période de 500 ms, avec une série d&#39;impulsions ms 0,5 à une stimulation supramaximale et à la fréquence de fusion (depuis le plateau de la relation fréquence-force (par exemple Ref:. 8) Le plateau pour les muscles EDL est généralement réalisé avec 120 Hz, et pour les muscles du diaphragme avec 100 Hz. Stimuler 3 fois à la fréquence respective des périodes de repos de 5 minutes entre les périodes de stimulation pour chaque muscle. </li></ol> 5. Les contractions excentriques <ol><li> Laisser reposer les muscles à 5 min entre la réalisation des contractions isométriques et excentriques. </li><li> Stimuler les muscles à 80 Hz pour la première isométriquement 500 ms, suivi d&#39;un tronçon de L o 10% dans la dernière stimulation 200 ms (un taux d&#39;étirage de 0,5 L o/ Sec). </li><li> Répéter modèle de stimulation avec 5 min entre appuis pour le nombre désiré de contractions excentriques. </li><li> Mesurer la force de contraction pour chaque période dans le temps avant l&#39;étirage. Calculer la chute de la force entre la première et la dernière contraction. </li></ol> 6. Suppression des muscles de l&#39;appareil <ol><li> Raccourcir la longueur du muscle pour permettre le retrait en douceur des muscles du transducteur et d&#39;afficher et de le retourner dans un plat à dissection avec Ringer. </li><li> Retirer les sutures des muscles. </li><li> Pour le muscle EDL, éponger le muscle deux fois, puis le peser, avant un traitement ultérieur (par exemple, le gel, fixation, etc.) Ce sera important pour le calcul de la section transversale, et la force spécifique. </li><li> Pour le muscle du diaphragme, faire tremper dans 0,1% procion orange, un colorant imperméant membrane pendant 15-20 min. Cela fournira un indice de dommages dissection. </li><li> Disséquer le muscle, à partir de l&#39;insertion osseuse, ainsi que le pourcentagetendon ral. Cela est nécessaire pour fournir le poids exact du muscle. Éponger comme ci-dessus avant la pesée et l&#39;élaboration ultérieure. </li><li> Calculer l&#39;aire transversale (CSA): CSA (mm 2) = masse (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], où L / L o est la fibre musculaire au rapport de longueur (0,45 pour EDL, 1,0 pour le diaphragme) 5 et 1,06 est la densité du muscle. </li></ol>

<ol><li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD%22%5BJournal%5D)">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li>
<li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li>
<li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582(2011).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li>
<li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li>
<li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li>
</ol>

Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Aurora scientifique.

Le but de cet article est de fournir des directives pour réaliser la fonction musculaire isolée sur deux muscles de souris - l&#39;EDL et le diaphragme. L&#39;évaluation de ces muscles peut donner une idée si oui ou non candidats thérapeutiques pour les maladies musculaires sont bénéfiques. Pour les deux muscles, le facteur majeur dans l&#39;obtention de données fiables est une dissection propre. Par conséquent, la pratique et le perfectionnement de l&#39;étape d&#39;isolement initiale est essentielle avant de passer à des tests fonctionnels. En outre, l&#39;établissement de repères fonctionnels pour le muscle normal est essentiel avant de faire des comparaisons avec le muscle dystrophique, ou entre les traitements. Ceci assure que les résultats de l&#39;étude ne sont pas sujettes à la variabilité élevée transmise par la capacité de la personne effectuant les expériences. L&#39;utilisation d&#39;un colorant imperméant membrane peut vous aider à optimiser la préparation de dissection, pour l&#39;incubation d&#39;un muscle dans une solution contenant un tel colorant marquera fibres les plus endommagés, et peut servir d&#39;indice de dissection succès. Minimiser le nombre de fibres endommagées dans le muscle aidera à optimiser la mesure. Les fibres endommagées par la dissection fluorescence beaucoup plus vives que celles endommagées par la contraction excentrique, et donc si le colorant est également utilisé lors du processus de la mécanique, on peut utiliser l&#39;intensité du colorant de faire la distinction entre les deux types de dommages. Dissection de bandes membrane auront presque toujours détérioration de la fibre, tout simplement parce que en coupant le long de la longueur des fibres, certains sont inévitablement détruits. La montée du colorant est forte dans les fibres endommagées, et ceux-ci sont normalement limité aux bords extérieurs de la préparation. En moyenne, on observe une bande de fibres endommagées qui est ~ 3 fibres de largeur (~ 120 um) de chaque côté de la bande de muscle. Si la bande endommagée comprend plus de 15% du muscle, puis les données sont supprimées. La préparation diaphragme a également des contraintes sur la taille optimale pour les mesures fonctionnelles. Nous avons trouvé que des morceaux de diaphragm qui sont plus larges que 5 mm commencer à se replier sur eux-mêmes, car l&#39;attache du tendon central est uniquement en un point. Il en résulte une baisse de la force spécifique dans la préparation. Nous avons également constaté que les bandes plus étroites ont aussi moins de force spécifique, que nous croyons parce que le nombre de fibres endommagées lors de la dissection constituent une plus grande proportion du nombre total des fibres. Par exemple, si 0,1 mm de chaque côté est endommagé, qui est de 5% (2x0.1 mm / 4 mm bande) de la préparation de muscle qui ne contribue pas à la force, alors que si la bande est à seulement 1 mm, puis 20 % de la préparation de muscle est endommagé. Ainsi, à la fois la largeur de la zone endommagée, ainsi que la largeur de l&#39;ensemble de préparation sont des facteurs importants à contrôler. Les mesures de la tension isométrique maximale exigent que toutes les fibres musculaires dans un muscle sont stimulées. Parce qu&#39;il ya une variabilité considérable dans les composants d&#39;un appareil de fonction, celle-ci doit être déterminée pour chaque jeu individuelvers le haut. Par exemple, la taille ou le type de bain de stimulateur peut influer sur l&#39;intensité de la stimulation. Stimulation transcutanée est un moyen raisonnable de déterminer les conditions de stimulation supramaximale. Une fois cela établi pour une configuration spécifique et musculaire, il peut être utilisé pour des études ultérieures. En revanche, la durée optimale d&#39;un muscle donné doit être mesurée pour chaque préparation en utilisant le processus itératif décrit ci-dessus. Cela garantit que le chevauchement de filaments fins et épais est optimale et la capacité maximale potentielle de production de force est mesurée. D&#39;autres procédures peuvent s&#39;appuyer sur les diagrammes de diffraction associés aux stries musculaires, mais cela nécessite un équipement supplémentaire n&#39;est pas décrite ici. Nous utilisons régulièrement des durées de stimulation 500 ms, ce qui tombe dans la moyenne de ce paramètre utilisé par d&#39;autres chercheurs dans ce domaine. Bien que cela puisse provoquer une certaine fatigue du muscle pendant la contraction, ce qui est évidentpar un &quot;affaissement&quot; de la production de force maximale, ce qui en soi peut être instructif. Par exemple, une différence de fatigue pourrait se faire par différents types de thérapies, y compris ceux qui manipulent cet objectif de calcium, d&#39;où l&#39;affaissement en vigueur lors de la contraction active peut servir d&#39;indice pour l&#39;amélioration. Alternativement, la perte de la force pourrait indiquer que les points de suture sur les tendons ne sont pas assez serrés, et qu&#39;ils glissent lors de la contraction. Le muscle doit être retiré de la salle de bain et les sutures doivent être re-liée si cela se produit. Nous utilisons également une série de 3 contractions tétaniques, qui permet d&#39;évaluer la stabilité de la préparation. Encore une fois, les bordereaux de suture conduirait à une perte de la force entre les contractions, ce qui nécessite de suture re-lier. Gros muscles peuvent également générer des noyaux anoxiques, ce qui conduit à des pertes de force pendant le protocole. La taille des muscles est un facteur limitant pour effectuer des tests de la fonction musculaire isolée, où les muscles EDL avec des masses supérieures à 20 mg perdre de la force à chaque contractiontion, et ne peut être pris en charge par surfusion dans un bain. Bandes membrane ne souffrent pas de complications mêmes parce qu&#39;ils sont suffisamment minces pour avoir une viabilité prolongée dans le bain. D&#39;autres muscles peuvent être utilisés pour la fonction musculaire isolée, y compris le muscle soléaire, qui est couramment utilisé, mais pas décrits ici. Un grand nombre des mêmes procédures peuvent être adoptées pour le soléaire en termes de préparation et les essais fonctionnels. Cependant, les principales différences sont la fréquence de stimulation, et les paramètres de contractions excentriques. Utilisez du soléaire pour la fonction complémentaire à celle des deux autres muscles, et donc il doit être considéré comme faisant partie d&#39;un «paquet standard&quot; pour l&#39;évaluation des souris dystrophiques 4, 7. Contraction excentrique fournit un index de fragilité contractile, et il est important d&#39;utiliser un protocole qui entraîne une perte modeste de la force dans les muscles des animaux de type sauvage et une perte importante de la force dansmuscles dystrophiques non traitées afin qu&#39;il y ait une large plage dynamique pour les comparaisons. Une absence de toute perte de force dans les muscles normaux suggère que la contraction excentrique est trop doux, et ne sera pas suffisant pour distinguer entre les traitements qui ne sont pas efficaces et celles qui sont vraiment bénéfiques. Cependant, une perte dramatique de la force dans les muscles normaux soumis à la contraction excentrique peut être trop grande pour faire ressortir les différences associées à la maladie. Notre protocole pour l&#39;EDL et utilise un taux de diaphragme 0,5 tronçon Lo / s pour produire une variation de longueur de 10%. Nous effectuent généralement 5 contractions excentriques, qui se traduisent par une petite perte de force dans les muscles normaux et une perte importante de la force dans les muscles dystrophiques. Certes, tous ces paramètres peuvent être modifiés pour augmenter la variation de longueur totale, le taux d&#39;étirement, ou le nombre de contractions excentriques afin de distinguer les différences entre les muscles malades et en bonne santé, ainsi que sur les effets d&#39;un type spécifique de mutation ou traitement l&#39;on étudie. Tant qu&#39;il y aura une différence marquée entre les muscles normaux et malades, alors il ya une règle d&#39;or pour atteindre en termes de traitements. En résumé, ce protocole établit des lignes directrices pour la réalisation des contractions isométriques et excentriques, et identifie j&#39;espère que les pièges potentiels à éviter lors de la mise en place de cette technique dans votre laboratoire.

Mesures de la fonction musculaires contribuer à l&#39;évaluation des traitements potentiels pour les pathologies musculaires, ainsi que pour la détermination des mécanismes sous-jacents physiologie de ce tissu. Pour la maladie musculaire, l&#39;utilisation de modèles de souris sont devenus un élément central pour comprendre les liens entre le génotype et le phénotype, et pour étendre ces connaissances dans la conception et l&#39;essai des agents thérapeutiques potentiels. Les dystrophies musculaires, en particulier, se sont appuyés sur des souris pour évaluer ces agents et d&#39;établir des données pré-cliniques nécessaires pour aller de l&#39;avant aux essais chez les patients. Une mesure conséquence fréquente utilise la fonction musculaire isolée pour déterminer la force, qui est applicable à un large éventail d&#39;études. Une autre mesure est l&#39;utilisation d&#39;excentrique, ou l&#39;allongement, les contractions pour déterminer les changements intégrité de la membrane musculaire, ce qui est déficient dans la dystrophie musculaire de Duchenne, et le modèle de la souris pour cette maladie (mdx). Par conséquent, il est essentiel que ces types de Measuremparents d&#39;être sensible et reproductible. La souris extenseur commun des orteils (EDL) musculaire a été largement utilisé pour la fonction musculaire isolée en raison de sa géométrie idéale et la taille, y compris l&#39;orientation des fibres uniformes et les tendons définitifs 2, 5, 6, 10, 12. Méthodes de muscles EDL isométriques mesures fonctionnelles ont été décrites dans une publication précédente JoVE 8, ainsi que dans les SOP Treat-NMD 1. Nous avons étendu la description de ces méthodes pour inclure à la fois des contractions isométriques et excentriques. Caractéristiques de la maladie sont évidentes dans l&#39;EDL, y compris les cycles heighted de dégénérescence / régénération et de sortie de force diminuée. Le diaphragme de souris présente la progression la plus rapide pathologique de la dystrophie musculaire par rapport aux autres muscles de la souris 11. En 6 mois, la fibrose cumulatif comprend environ 50% du muscle. Il en résulte de façon significative impaired force de sortie 11. Par conséquent, les agents thérapeutiques qui peuvent prévenir l&#39;infiltration fibreuse peut être évalué de manière efficace dans la membrane. La perte de la dystrophine dans le muscle conduit à une fragilité accrue et renforcée dommages contractile dans les 9 muscles. Par conséquent, de nombreux traitements pour la dystrophie musculaire de Duchenne sont adaptés pour remplacer la dystrophine. En tant que tel, un test qui est devenu essentiel pour l&#39;évaluation de ces stratégies est la contraction excentrique, qui permet de distinguer entre le muscle normal et dystrophique, ainsi que de déterminer quel est l&#39;avantage d&#39;une stratégie particulière a pour protéger un muscle dystrophique des dommages contractile 2, 3, 4, 12. Cette procédure nécessite soit une bi-mode servo-moteur qui peut moduler une longueur d&#39;enregistrement / et la force, ou un procédé de réglage de longueur rapide séparé d&#39;un transducteur de force.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> dans le système de test in vitro Muscle </td><td> Aurora scientifique </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Source de lumière ACE </td><td> Schott-FOSTEC </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux à dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angle ciseaux de dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Manche de bistouri </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10003-12 </td><td> autre outil de dissection </td></tr><tr><td> Courbes des lames de scalpel n ° 12 </td><td> Sciences fineOutils </td><td> 10012-00 </td><td> autre outil de dissection </td></tr><tr><td> Ciseaux os </td><td> Outils Fine Science </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T de suture lier pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont pince SS - coudée </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Tressé taille suture de soie 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 30/07/10 </td><td></td></tr><tr><td> Ruban adhésif médical </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine hydrochloride 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Dose final est de 80 mg / kg </td></tr><tr><td> Injection TranquiVed (xylazine 100 mg / ml) </td><td> VEDCO </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Dose final est de 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reactive Orange 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Composants de la solution de Ringer </td><td></td><td></td><td> La solution est équilibrée avec du gaz de 95% 2 O et 5% de CO 2, pH final 7,4 </td></tr><tr><td> De chlorure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Concentration finale: 118 mM </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Concentration finale: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium dihydraté </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Concentration finale: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Le phosphate de potassium monobasique </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Concentration finale: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Le sulfate de magnésium </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Concentration finale: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-hydroxyéthyl) tuyaupipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Concentration finale: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Concentration finale: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isométrique et excentrique évaluation de génération de forces des muscles squelettiques isolé à partir des modèles murins de dystrophies musculaires

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Essentielle à l&#39;évaluation des agents thérapeutiques potentiels pour les maladies musculaires sont sensibles et reproductibles des évaluations physiologiques de la fonction musculaire. Parce que de nombreux essais pré-cliniques s&#39;appuient sur des modèles murins de ces maladies, la fonction musculaire isolée est devenue l&#39;une des normes de Go / NoGo décisions en se déplaçant vers l&#39;avant des candidats-médicaments à des patients. Nous allons démontrer la préparation du long extenseur des orteils (EDL) et les muscles du diaphragme pour les tests fonctionnels, qui sont les muscles prédominants utilisés pour ces études. La géométrie du muscle EDL est idéal pour les préparations musculaires isolées, avec deux tendons facilement accessibles, et une petite taille qui peuvent être pris en charge par surfusion dans un bain. Le diaphragme présente profonde progressive pathologie chez les animaux dystrophiques, et peut servir de plate-forme pour l&#39;évaluation de nombreuses thérapies potentielles contrer la fibrose et la promotion de la stabilité myofibrille. Les protocoles pour les tests de routine, y compris isométrique et excencontractions gastriques, seront affichés. Force isométrique permet d&#39;évaluer la force et des contractions excentriques aider à évaluer la stabilité sarcolemme, qui est perturbée dans de nombreux types de dystrophies musculaires. Des comparaisons entre les résultats attendus entre les muscles de type sauvage et les muscles dystrophiques seront également fournis. Ces mesures peuvent compléter les mesures morphologiques et biochimiques de l&#39;homéostasie tissulaire, ainsi que des évaluations d&#39;animaux entiers de la fonction musculaire.

Les valeurs attendues pour les forces isométriques des muscles EDL à partir de 12 semaines d&#39;âge des animaux sont présentés dans la figure 1. Parce que les muscles mdx présentent une hypertrophie compensatrice, au total la force tétanique peut être plus élevé dans le muscle mdx par rapport à l&#39;âge contrôles appariés de type sauvage. Toutefois, une mesure plus appropriée de sortie fonctionnelle est la force spécifique (figure 2), où la force est normalisé pour section transversale de calculer cette valeur. Force spécifique dépend de la capacité inhérente fonctionnelle du muscle, où la faiblesse dans les muscles dystrophiques est plus apparente lorsque les deux la force absolue et la surface transversale sont comptabilisés. Dans nos mains, muscles EDL de souris mdx générer environ 20 à 25% inférieurs forces spécifiques que ceux des souris de type sauvage appariés pour l&#39;âge de 10 à 26 semaines d&#39;âge. Pour la membrane, que la force spécifique est pertinent pour des comparaisons car la préparation est un morceau de muscle dépend de la dissection. Comparaison de la force spécifique entre type sauvage et muscles du diaphragme mdx reflète la pathologie progressive dans ce tissu. Sortie de force isométrique diminue avec l&#39;âge (figure 3), de sorte qu&#39;en 6 mois d&#39;âge, les muscles du diaphragme de souris mdx ne produisent pas plus de la moitié de la sortie fonctionnelle de bandes de membrane appariés selon l&#39;âge des contrôles de type sauvage. Un exemple de contractions excentriques de tests diaphragme est illustré à la figure 4. A chaque contraction ultérieure excentrique, force de sortie diminue en bandes de membrane à la fois de type sauvage (C57) et des souris mdx. Toutefois, la perte de la force est plus dramatique dans les échantillons de muscle de la souris mdx, sans doute de l&#39;absence de dystrophine et ses protéines associées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figure 1. Isométrique force tétanique en type sauvage et mdx EDL muscles f<html> souris rom semaine 12 vieux. Force absolue peut être plus élevé en appariés par l&#39;âge muscles EDL mdx dues à une hypertrophie compensatrice. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figure 2. Vigueur isométrique tétanique normalisée par aire de section musculaire est la force spécifique, et révèle déprimé capacité fonctionnelle des muscles EDL de souris mdx par rapport à ceux des souris de type sauvage. Les traces sont de la même souris que dans la figure 1. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figure 3. La perte progressive de la capacité de production de force évalué par la force spécifique est le plus évident dans le diaphragme de souris mdx (barres rouges) par rapport au type sauvage (C57 en ligne bleue). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. La perte de la force en fonction du nombre contraction excentrique des muscles du diaphragme de 12 semaine vieux C57 et souris mdx. Les données sont la moyenne ± SEM de n = 4 muscles par génotype.

Mesures de la fonction musculaires contribuer à l&#39;évaluation des agents thérapeutiques potentiels pour les pathologies musculaires, ainsi que pour la détermination des mécanismes sous-jacents physiologie de ce tissu. Nous allons démontrer la préparation du long extenseur des orteils et muscles du diaphragme pour les tests fonctionnels. Les protocoles de contractions isométriques et excentriques seront affichés, ainsi que les différences de résultats entre les muscles dystrophiques, ce qui représente un état pathologique, et les muscles de type sauvage.

Isométrique et excentrique évaluation de génération de forces des muscles squelettiques Isolé à partir des modèles murins de dystrophies musculaires

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les propriétés mécaniques des muscles squelettiques isolés chez la souris. Ceci est accompli en disséquant d’abord le muscle extenseur des doigts longus ou EDL, ainsi que le muscle du diaphragme de l’animal. Après avoir préparé une bande de diaphragme, épinglez l’EDL et la bande de diaphragme dans une boîte de solution de sonnerie oxygénée, puis attachez des boucles de suture aux deux extrémités des muscles.Ensuite, l’EDL ou la bande de diaphragme est fixée dans un bain d’organe entre deux électrodes fixées à un transducteur de force ou à un levier à une extrémité et ajustée à sa longueur optimale en fonction de la force de contraction. La dernière étape consiste à stimuler le muscle à l’aide d’un certain nombre de protocoles mécaniques et à mesurer la production de force. En fin de compte, le calcul de la production de force, de la résistance aux dommages, de la relation de fréquence de la force et d’autres propriétés est utilisé pour montrer la force et l’intégrité et d’autres propriétés du muscle, et le cas échéant, les effets d’un traitement ou d’une modification génétique.Cette technique peut être utilisée pour tester des thérapies potentielles pour les dystrophies musculaires, car la plupart de ces thérapies visent à retrouver la force musculaire et à réduire la fragilité musculaire. Bien que nous ne soyons pas les premiers à utiliser cette technique, nous l’utilisons régulièrement pour étudier un certain nombre de modèles de souris différents et évaluer leur fonction musculaire, ainsi que pour caractériser et évaluer plusieurs thérapies pour les dystrophies musculaires. En plus de la Dre Catherine Morewood, nous ferons la démonstration de cette procédure à l’aide de deux membres de notre noyau d’évaluation physiologique, le Dr Min Liu, associé de recherche, et M. Ian, spécialiste de la recherche.Les souris utilisées dans cette procédure sont anesthésiées à l’aide de kétamine et de xylazine pour s’assurer qu’elles ne ressentent aucune douleur ou détresse, mais que les muscles restent bien oxygénés par la circulation. Après avoir confirmé par un pincement des orteils que l’animal est suffisamment anesthésié, immobilisez ses membres supérieurs à l’aide de ruban adhésif médical et retirez la peau du membre postérieur antérieur inférieur pour exposer les muscles de cette zone, maintenez les muscles humides avec l’application de PBS à intervalles réguliers. Sous une lunette de dissection, faites une petite incision latérale au genou afin d’exposer le tendon proximal du muscle extenseur des doigts longs ou du muscle EDL.Il y a deux tendons dans cette région et les deux doivent être coupés pour permettre l’ablation de l’EDL au niveau de la cheville médiale. Coupez le tendon des tibiaux antérieurs ou muscle TA pour exposer les tendons distaux de l’EDL, qui s’étendent le long des métatarsiens. Soulevez le muscle TA pour l’écarter.Veillez à ne pas couper ou toucher l’EDL en dessous. Retournez aux tendons distaux de l’EDL et coupez chacun d’eux. Ensuite, saisissez les tendons et retirez doucement l’EDL du reste du membre.Il doit se libérer librement de l’extrémité proximale. Retirez le muscle EDL et placez-le dans un plat de dissection rempli d’essoreuses oxygénées réfrigérées. Épinglez le muscle à travers les tendons à peu près à la longueur au repos, c’est-à-dire la longueur trouvée in vivo.La longueur est trop courte lorsque le muscle est flasque dans le plat et trop longue si le muscle tire sur les broches de dissection. Attachez les sutures aux tendons aussi près que possible du muscle, mais sans toucher le muscle. Épinglez le muscle à peu près à la longueur du repos à l’aide des sutures.Pour commencer cette procédure. Faites une incision dans la peau de l’animal euthanasié. Pour exposer la cavité abdominale et thoracique.Ouvrez la cavité abdominale et coupez la paroi du corps juste en dessous des côtes à l’aide de ciseaux à os et en commençant au-dessus de l’insertion du diaphragme. Coupez autour de toute la cage thoracique en suivant la ligne des côtes et coupez à travers la colonne vertébrale. Coupez les vaisseaux sanguins qui traversent le centre du diaphragme afin que le diaphragme puisse être retiré facilement.Retirez le diaphragme de la souris et placez-le dans un plat de dissection rempli de sonneries oxygénées. Agitez doucement le diaphragme dans le plat pour éliminer le sang. Actualisez la solution de sonnerie si nécessaire.Ensuite, coupez une petite bande du diaphragme du tendon central aux côtes le long de l’orientation des fibres dans la partie centrale des diaphragmes latéraux de l’hémi. La bande doit avoir une largeur comprise entre deux et quatre millimètres. Attachez les sutures au tendon central, attachez les sutures à chacune des extrémités des côtes saillantes latéralement, puis attachez-les ensemble pour former une grande boucle à l’aide de ciseaux à os.Coupez la nervure de chaque côté de la bande, en laissant environ un à deux millimètres, en surplomb de la côte de chaque côté du diaphragme. L’évaluation de la génération de force sur bande des muscles squelettiques isolés est effectuée par un système d’essai musculaire in vitro pour monter les muscles dans le bain mécanique, saisir les sutures et les utiliser pour fixer le muscle à un tenon rigide à une extrémité et à un transducteur de force à l’autre extrémité. Une bonne approximation est la longueur du muscle au repos.Comme indiqué précédemment, le bain est rempli d’une solution de sonneries oxygénées maintenue à 22 degrés Celsius. Pour prolonger la stabilité musculaire pour tester, les muscles doivent se reposer pendant cinq minutes dans ce bain avant les tests fonctionnels, de sorte que la température musculaire soit équivalente à 22 degrés Celsius pour établir des conditions de stimulation supra maximales. Une fois qu’un muscle est placé dans le bain, utilisez des impulsions de stimulation uniques de 0,5 milliseconde pour générer une contraction et surveiller la sortie de force.Augmentez progressivement le courant jusqu’à ce que la force atteigne un niveau maximal mais régulier, augmentez le courant à 10 % de plus que ce niveau pour les expériences restantes afin d’établir une longueur optimale, d’abord, assurez-vous que le muscle n’est pas relâché, mais pas enseigné non plus. Une bonne approximation est la longueur du muscle au repos, comme indiqué précédemment. À l’aide de stimulations isométriques, ajustez progressivement la longueur du muscle jusqu’à ce qu’une force maximale soit obtenue.Reposez le muscle environ 10 secondes entre chaque contraction. La longueur musculaire optimale est obtenue lorsque la force de contraction est maximale : enregistrez la longueur musculaire à l’aide d’étriers vernier. Pour l’EDL, il s’agit de la longueur entre les jonctions myo tendines.Pour le diaphragme, il s’agit de la longueur entre la jonction myo-tendineuse centrale et l’insertion musculaire vers la côte. Pour déterminer la force isométrique maximale du titanic, stimulez le muscle à la longueur musculaire optimale pendant une période de 500 millisecondes avec une série d’impulsions de 0,5 milliseconde à une stimulation super maximale et à une fréquence de fusion. Le plateau pour les muscles EDL est généralement atteint avec 120 hertz et pour les muscles du diaphragme avec 100 hertz, stimulez trois fois à la fréquence respective avec des périodes de repos de cinq minutes entre les séances de stimulation pour chaque muscle après un repos de cinq minutes.Après avoir effectué des contractions isométriques, commencez la procédure pour les contractions excentriques. Stimulez le muscle à 80 hertz de manière isométrique pendant les 500 premières millisecondes, suivi d’un étirement optimal de 10 % de la longueur musculaire lors de la stimulation finale de 200 millisecondes. Répétez le schéma de stimulation avec cinq minutes de repos entre les deux.Pour le nombre souhaité de contractions excentriques, mesurez la force de chaque contraction dans la période précédant l’étirement. Calculez la chute de force entre la première et la dernière contraction à la fin du test fonctionnel. Raccourcissez la longueur du muscle et retirez doucement le muscle de la sonde et de la cheville.Remettez le muscle dans un plat de dissection avec des sonnettes. Retirez les sutures des muscles pour le muscle EDL. Bloquez le muscle deux fois, puis pesez-le avant de poursuivre le traitement.Cela sera important pour calculer la section transversale et la force spécifique pour l’absorption musculaire du diaphragme dans 0,1 % de pros et d’orange, une membrane et un colorant perméable pendant 15 à 20 minutes. Cela fournira un indice des dommages causés par la dissection, disséquera le muscle du diaphragme loin de l’insertion osseuse ainsi que le tendon central. Ceci est nécessaire pour fournir un poids précis du transfert musculaire avant la pesée et la préparation ultérieure.La section transversale ou CSA est calculée à l’aide de la formule suivante où L sur LO est le rapport fibre/longueur musculaire et 1,06 est la densité musculaire attendue Les valeurs attendues pour les forces isométriques dans les muscles sauvages de type C 57 et de dystrophie musculaire ou M-D-X-E-D-L d’animaux âgés de 12 semaines sont indiquées dans cette figure. Parce que les muscles MDX présentent une hypertrophie compensatoire, la force totale à titanesque peut être plus élevée dans les muscles MDX par rapport aux témoins de type sauvage appariés selon l’âge. Une mesure plus appropriée de la sortie fonctionnelle est la force spécifique où la force est normalisée pour l’aire de la section transversale.Pour calculer cette valeur, la force spécifique dépend de la capacité fonctionnelle inhérente du muscle, où la faiblesse des muscles dystrophiques est plus apparente lorsque la force absolue et l’aire de la section transversale sont prises en compte. Il a été observé dans cette étude que les muscles EDL des souris MDX génèrent environ 20 à 25 % moins de forces spécifiques que ceux des souris de type sauvage appariées d’âge de 10 à 26 semaines. Pour le diaphragme, seule la force spécifique est pertinente pour les comparaisons, car la préparation est un morceau du muscle dépendant de la dissection.Une comparaison de la force spécifique entre le muscle de type sauvage C 57 indiqué par la ligne bleue et le muscle du diaphragme MDX indiqué par les barres rouges reflète la pathologie progressive de ce tissu. La force isométrique diminue avec l’âge, de sorte qu’à l’âge de six mois, les muscles du diaphragme des souris MDX ne produisent pas plus de la moitié de la production fonctionnelle des bandes de diaphragme des témoins de type sauvage appariés selon l’âge. Cette figure montre un exemple de contractions excentriques provenant d’un test de diaphragme.À chaque contraction excentrique ultérieure, la force de sortie diminue dans les bandes de diaphragme des souris sauvages de type C 57 illustrées en bleu et des souris MDX indiquées en rouge. Cependant, la perte de force est plus spectaculaire dans les échantillons musculaires de la souris MDX, probablement à cause de l’absence de dystrophine et de ses protéines associées une fois maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en environ une heure pour un seul muscle si elle est exécutée correctement en suivant cette technique.D’autres méthodes, telles que le western blot ou d’autres mesures biochimiques, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, par exemple si le traitement a modifié les niveaux de protéines ou normalisé l’intégrité musculaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer l’EDL et le diaphragme de la souris et comment mesurer et analyser la production de force avant et après les contractions excentriques.

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