Isométrique et excentrique évaluation de génération de forces des muscles squelettiques Isolé à partir des modèles murins de dystrophies musculaires

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les propriétés mécaniques des muscles squelettiques isolés chez la souris. Ceci est accompli en disséquant d’abord le muscle extenseur des doigts longus ou EDL, ainsi que le muscle du diaphragme de l’animal. Après avoir préparé une bande de diaphragme, épinglez l’EDL et la bande de diaphragme dans une boîte de solution de sonnerie oxygénée, puis attachez des boucles de suture aux deux extrémités des muscles.

Ensuite, l’EDL ou la bande de diaphragme est fixée dans un bain d’organe entre deux électrodes fixées à un transducteur de force ou à un levier à une extrémité et ajustée à sa longueur optimale en fonction de la force de contraction. La dernière étape consiste à stimuler le muscle à l’aide d’un certain nombre de protocoles mécaniques et à mesurer la production de force. En fin de compte, le calcul de la production de force, de la résistance aux dommages, de la relation de fréquence de la force et d’autres propriétés est utilisé pour montrer la force et l’intégrité et d’autres propriétés du muscle, et le cas échéant, les effets d’un traitement ou d’une modification génétique.

Cette technique peut être utilisée pour tester des thérapies potentielles pour les dystrophies musculaires, car la plupart de ces thérapies visent à retrouver la force musculaire et à réduire la fragilité musculaire. Bien que nous ne soyons pas les premiers à utiliser cette technique, nous l’utilisons régulièrement pour étudier un certain nombre de modèles de souris différents et évaluer leur fonction musculaire, ainsi que pour caractériser et évaluer plusieurs thérapies pour les dystrophies musculaires. En plus de la Dre Catherine Morewood, nous ferons la démonstration de cette procédure à l’aide de deux membres de notre noyau d’évaluation physiologique, le Dr Min Liu, associé de recherche, et M. Ian, spécialiste de la recherche.

Les souris utilisées dans cette procédure sont anesthésiées à l’aide de kétamine et de xylazine pour s’assurer qu’elles ne ressentent aucune douleur ou détresse, mais que les muscles restent bien oxygénés par la circulation. Après avoir confirmé par un pincement des orteils que l’animal est suffisamment anesthésié, immobilisez ses membres supérieurs à l’aide de ruban adhésif médical et retirez la peau du membre postérieur antérieur inférieur pour exposer les muscles de cette zone, maintenez les muscles humides avec l’application de PBS à intervalles réguliers. Sous une lunette de dissection, faites une petite incision latérale au genou afin d’exposer le tendon proximal du muscle extenseur des doigts longs ou du muscle EDL.

Il y a deux tendons dans cette région et les deux doivent être coupés pour permettre l’ablation de l’EDL au niveau de la cheville médiale. Coupez le tendon des tibiaux antérieurs ou muscle TA pour exposer les tendons distaux de l’EDL, qui s’étendent le long des métatarsiens. Soulevez le muscle TA pour l’écarter.

Veillez à ne pas couper ou toucher l’EDL en dessous. Retournez aux tendons distaux de l’EDL et coupez chacun d’eux. Ensuite, saisissez les tendons et retirez doucement l’EDL du reste du membre.

Il doit se libérer librement de l’extrémité proximale. Retirez le muscle EDL et placez-le dans un plat de dissection rempli d’essoreuses oxygénées réfrigérées. Épinglez le muscle à travers les tendons à peu près à la longueur au repos, c’est-à-dire la longueur trouvée in vivo.

La longueur est trop courte lorsque le muscle est flasque dans le plat et trop longue si le muscle tire sur les broches de dissection. Attachez les sutures aux tendons aussi près que possible du muscle, mais sans toucher le muscle. Épinglez le muscle à peu près à la longueur du repos à l’aide des sutures.

Pour commencer cette procédure. Faites une incision dans la peau de l’animal euthanasié. Pour exposer la cavité abdominale et thoracique.

Ouvrez la cavité abdominale et coupez la paroi du corps juste en dessous des côtes à l’aide de ciseaux à os et en commençant au-dessus de l’insertion du diaphragme. Coupez autour de toute la cage thoracique en suivant la ligne des côtes et coupez à travers la colonne vertébrale. Coupez les vaisseaux sanguins qui traversent le centre du diaphragme afin que le diaphragme puisse être retiré facilement.

Retirez le diaphragme de la souris et placez-le dans un plat de dissection rempli de sonneries oxygénées. Agitez doucement le diaphragme dans le plat pour éliminer le sang. Actualisez la solution de sonnerie si nécessaire.

Ensuite, coupez une petite bande du diaphragme du tendon central aux côtes le long de l’orientation des fibres dans la partie centrale des diaphragmes latéraux de l’hémi. La bande doit avoir une largeur comprise entre deux et quatre millimètres. Attachez les sutures au tendon central, attachez les sutures à chacune des extrémités des côtes saillantes latéralement, puis attachez-les ensemble pour former une grande boucle à l’aide de ciseaux à os.

Coupez la nervure de chaque côté de la bande, en laissant environ un à deux millimètres, en surplomb de la côte de chaque côté du diaphragme. L’évaluation de la génération de force sur bande des muscles squelettiques isolés est effectuée par un système d’essai musculaire in vitro pour monter les muscles dans le bain mécanique, saisir les sutures et les utiliser pour fixer le muscle à un tenon rigide à une extrémité et à un transducteur de force à l’autre extrémité. Une bonne approximation est la longueur du muscle au repos.

Comme indiqué précédemment, le bain est rempli d’une solution de sonneries oxygénées maintenue à 22 degrés Celsius. Pour prolonger la stabilité musculaire pour tester, les muscles doivent se reposer pendant cinq minutes dans ce bain avant les tests fonctionnels, de sorte que la température musculaire soit équivalente à 22 degrés Celsius pour établir des conditions de stimulation supra maximales. Une fois qu’un muscle est placé dans le bain, utilisez des impulsions de stimulation uniques de 0,5 milliseconde pour générer une contraction et surveiller la sortie de force.

Augmentez progressivement le courant jusqu’à ce que la force atteigne un niveau maximal mais régulier, augmentez le courant à 10 % de plus que ce niveau pour les expériences restantes afin d’établir une longueur optimale, d’abord, assurez-vous que le muscle n’est pas relâché, mais pas enseigné non plus. Une bonne approximation est la longueur du muscle au repos, comme indiqué précédemment. À l’aide de stimulations isométriques, ajustez progressivement la longueur du muscle jusqu’à ce qu’une force maximale soit obtenue.

Reposez le muscle environ 10 secondes entre chaque contraction. La longueur musculaire optimale est obtenue lorsque la force de contraction est maximale : enregistrez la longueur musculaire à l’aide d’étriers vernier. Pour l’EDL, il s’agit de la longueur entre les jonctions myo tendines.

Pour le diaphragme, il s’agit de la longueur entre la jonction myo-tendineuse centrale et l’insertion musculaire vers la côte. Pour déterminer la force isométrique maximale du titanic, stimulez le muscle à la longueur musculaire optimale pendant une période de 500 millisecondes avec une série d’impulsions de 0,5 milliseconde à une stimulation super maximale et à une fréquence de fusion. Le plateau pour les muscles EDL est généralement atteint avec 120 hertz et pour les muscles du diaphragme avec 100 hertz, stimulez trois fois à la fréquence respective avec des périodes de repos de cinq minutes entre les séances de stimulation pour chaque muscle après un repos de cinq minutes.

Après avoir effectué des contractions isométriques, commencez la procédure pour les contractions excentriques. Stimulez le muscle à 80 hertz de manière isométrique pendant les 500 premières millisecondes, suivi d’un étirement optimal de 10 % de la longueur musculaire lors de la stimulation finale de 200 millisecondes. Répétez le schéma de stimulation avec cinq minutes de repos entre les deux.

Pour le nombre souhaité de contractions excentriques, mesurez la force de chaque contraction dans la période précédant l’étirement. Calculez la chute de force entre la première et la dernière contraction à la fin du test fonctionnel. Raccourcissez la longueur du muscle et retirez doucement le muscle de la sonde et de la cheville.

Remettez le muscle dans un plat de dissection avec des sonnettes. Retirez les sutures des muscles pour le muscle EDL. Bloquez le muscle deux fois, puis pesez-le avant de poursuivre le traitement.

Cela sera important pour calculer la section transversale et la force spécifique pour l’absorption musculaire du diaphragme dans 0,1 % de pros et d’orange, une membrane et un colorant perméable pendant 15 à 20 minutes. Cela fournira un indice des dommages causés par la dissection, disséquera le muscle du diaphragme loin de l’insertion osseuse ainsi que le tendon central. Ceci est nécessaire pour fournir un poids précis du transfert musculaire avant la pesée et la préparation ultérieure.

La section transversale ou CSA est calculée à l’aide de la formule suivante où L sur LO est le rapport fibre/longueur musculaire et 1,06 est la densité musculaire attendue Les valeurs attendues pour les forces isométriques dans les muscles sauvages de type C 57 et de dystrophie musculaire ou M-D-X-E-D-L d’animaux âgés de 12 semaines sont indiquées dans cette figure. Parce que les muscles MDX présentent une hypertrophie compensatoire, la force totale à titanesque peut être plus élevée dans les muscles MDX par rapport aux témoins de type sauvage appariés selon l’âge. Une mesure plus appropriée de la sortie fonctionnelle est la force spécifique où la force est normalisée pour l’aire de la section transversale.

Pour calculer cette valeur, la force spécifique dépend de la capacité fonctionnelle inhérente du muscle, où la faiblesse des muscles dystrophiques est plus apparente lorsque la force absolue et l’aire de la section transversale sont prises en compte. Il a été observé dans cette étude que les muscles EDL des souris MDX génèrent environ 20 à 25 % moins de forces spécifiques que ceux des souris de type sauvage appariées d’âge de 10 à 26 semaines. Pour le diaphragme, seule la force spécifique est pertinente pour les comparaisons, car la préparation est un morceau du muscle dépendant de la dissection.

Une comparaison de la force spécifique entre le muscle de type sauvage C 57 indiqué par la ligne bleue et le muscle du diaphragme MDX indiqué par les barres rouges reflète la pathologie progressive de ce tissu. La force isométrique diminue avec l’âge, de sorte qu’à l’âge de six mois, les muscles du diaphragme des souris MDX ne produisent pas plus de la moitié de la production fonctionnelle des bandes de diaphragme des témoins de type sauvage appariés selon l’âge. Cette figure montre un exemple de contractions excentriques provenant d’un test de diaphragme.

À chaque contraction excentrique ultérieure, la force de sortie diminue dans les bandes de diaphragme des souris sauvages de type C 57 illustrées en bleu et des souris MDX indiquées en rouge. Cependant, la perte de force est plus spectaculaire dans les échantillons musculaires de la souris MDX, probablement à cause de l’absence de dystrophine et de ses protéines associées une fois maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en environ une heure pour un seul muscle si elle est exécutée correctement en suivant cette technique.

D’autres méthodes, telles que le western blot ou d’autres mesures biochimiques, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, par exemple si le traitement a modifié les niveaux de protéines ou normalisé l’intégrité musculaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer l’EDL et le diaphragme de la souris et comment mesurer et analyser la production de force avant et après les contractions excentriques.