Name: Un In vivo Tester la perméabilité des vaisseaux sanguins (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez à tester la perméabilité vasculaire in vivo chez la souris en utilisant un colorant bleu lié à l'albumine. Cette méthode permet d'évaluer l'intégrité des cellules endothéliales et de visualiser la diffusion tissulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health, R01CA142928.

1. Injection intraveineuse de bleu d&#39;Evans dans la veine de la queue de la souris latéral <ol><li> Préparer une solution à 0,5% stérile de bleu d&#39;Evans dans du PBS. Si nécessaire, stériliser par filtration la solution pour éliminer toute particule qui n&#39;a pas dissous. </li><li> Aspirer 200 pi Bleu Evans solution dans une seringue. Évitez toutes les bulles d&#39;air qui auraient échappé dans la seringue. </li><li> Placer les souris qui sont de 8-12 semaines vieux dans un dispositif de retenue pour que l&#39;animal n&#39;est pas librement mobile, mais sa queue peut être manipulé. </li><li> Placez le dispositif de retenue de la souris sur le côté afin de la veine latérale de la queue est facilement visible et sont tournées vers le haut. </li><li> Tenez la queue avec la main non dominante entre le pouce et l&#39;index. </li><li> Insérer l&#39;aiguille (petit calibre, 27-30) à une avance 10-15 degrés d&#39;angle, biseau vers le haut, dans la veine latérale de la queue dans la direction de la tête. Gardez l&#39;aiguille et la seringue parallèlement à la queue. </li><li> Do ne s&#39;applique pas contre-pression pour confirmer le placement approprié car cela pourrait réduire la veine. </li><li> Injecter lentement 200 pi Bleu Evans solution dans la veine de la queue de la souris. </li><li> Observez la facilité avec laquelle les progrès piston, car c&#39;est la preuve de la mise en place correcte de l&#39;aiguille dans la veine. </li><li> Placez la souris de nouveau dans sa cage et l&#39;observer pendant 30 min. </li></ol> 2. Collection d&#39;organes et d&#39;extraction de Bleu d&#39;Evans des organes <ol><li> Sacrifier les souris par dislocation cervicale. Pour Miles fins de dosage dislocation cervicale est recommandée car elle limite l&#39;interférence significative avec la perméabilité vasculaire. Sacrifier toutes les souris en même temps, aussi vite que possible. Travailler avec les cohortes de 6 souris ou moins, car peu de temps après la mort vaisseaux sanguins deviennent plus perméables. </li><li> Placez la souris sur le dos et la broche leurs pieds sur un tableau blanc. </li><li> Ouvrir la cavité abdominale et thoracique pour exposer thorACIC et organes abdominaux. </li><li> Prenez des photos représentatives de montrer les différences dans l&#39;extravasation du bleu d&#39;Evans. Inclure toutes les souris dans le même domaine afin d&#39;avoir des conditions d&#39;éclairage identiques pour toutes les souris. </li><li> Recueillir des organes d&#39;intérêts et de les mettre dans des tubes de 1,5 ml </li><li> Peser un tube vide et apporter la valeur d&#39;équilibre à zéro. </li><li> Transférer l&#39;échantillon de tissu et il pondérer. Répétez l&#39;opération pour tous les échantillons de tissus. Les tissus peuvent être séchés à l&#39;air pour éliminer la variabilité de la teneur en eau entre les différents organes. </li><li> . Ajouter 500 ul de formamide dans chaque tube échantillon de tissu. </li><li> Transférez tous les tubes à un bain d&#39;eau à 55 ° C ou du bloc chauffant. Incuber pendant 24-48 heures pour extraire Evans Blue à partir de tissu. </li></ol> 3. Quantification de Evans Blue extravasé dans le tissu interstitiel <ol><li> Centrifuger le formamide / Bleu Evans mélange de granulés tous les fragments de tissus restants. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 610nm. Utiliser 500 ul formamide comme vide. </li><li> Calculer ng extravasation du bleu Evans par mg de tissu. </li><li> Tracer toutes les données dans un graphique. </li><li> Effectuer une analyse statistique pour déterminer les différences significatives. </li></ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
<li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li>
<li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+reactions+to+histamine%2C+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li>
<li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li>
<li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability%3A+implications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li>
<li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability%2C+vascular+permeability+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%2C+histamine%2C+and+serotonin%2C+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle%2C+the+vesiculo-vacuolar+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li>
<li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit ou en concurrence intérêts financiers.

La perméabilité vasculaire est un marqueur essentiel pour l&#39;état des vaisseaux sanguins. Augmentation de la perméabilité vasculaire a été montré pour être présent dans plusieurs maladies systémiques telles que le diabète, l&#39;hypertension et les maladies auto-immunes 6,7,8. Augmentation de la perméabilité vasculaire a été montré pour être médiée par la contrainte de cisaillement, des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et le facteur de croissance des fibroblas...

Formation et le maintien des barrières perméables sélectives sont essentiels pour le développement des organes appropriée et 1,2 performance. Les cellules endothéliales tapissent la lumière des vaisseaux sanguins et de former une barrière semi-perméable qui est essentiel dans le transport sélectif entre le sang et l&#39;espace interstitiel de tous les organes. Une barrière de perméabilité suffisante est maintenue par serrées cellule à cellule jonctions qui sont strictement contrôlées par des facteurs de croissance, des cytokines et des molécules de stress autres produits 3. Rupture de la barrière de cellules endothéliales peut entraîner une plus grande perméabilité et une fuite vasculaire. Ces effets sont observés dans divers états pathologiques et la compréhension de la signalisation moléculaire souligner nécessite des méthodes pluridisciplinaires 4,5. Dans cet article, nous décrivons une méthode in vivo pour mesurer la perméabilité des vaisseaux en utilisant un modèle de souris. Le test que nous décrivons, également connu sous le nom d&#39;analyse Miles, est un bien établMINE Procédé pour tester la perméabilité vasculaire in vivo. Le test est basé sur le fait que, dans des conditions physiologiques basales, l&#39;albumine ne traverse pas la barrière endothéliale. Bleu d&#39;Evans, un colorant azoïque avec une forte affinité pour l&#39;albumine, est injecté dans le flux sanguin d&#39;un animal expérimental, et dans des conditions physiologiques, il est prévu d&#39;être limité à l&#39;intérieur des vaisseaux sanguins. Lorsqu&#39;un stimulus perméabilité vasculaire est ajouté, par voie topique ou systémique, les vaisseaux sanguins commencent à couler protéine et donc, aussi le bleu Evans qui est lié à l&#39;albumine. Cela se traduit par une coloration bleutée des tissus rapide dont les navires perméables. Injection réussie du colorant dans la veine de la queue de la souris latéral est essentiel pour la bonne réussite de l&#39;expérience. Technique d&#39;injection queue veine exige de la pratique approfondie et doivent être maîtrisées avant de commencer l&#39;expérience. La perméabilité des vaisseaux est fortement dépendante de l&#39;âge et du poids de l&#39;unimal, donc lorsque l&#39;on compare différentes souches de souris, il est impératif que les souris ou les sujets de test ont d&#39;autres proches de la date de naissance et le poids identiques. Parmi les autres facteurs qui influent sur la perméabilité de la barrière endothéliale sont des conditions environnementales comme la température, l&#39;humidité, et c&#39;est très important, le stress de manipulation de la souris. En raison de la multitude de facteurs qui peuvent influencer le résultat de l&#39;expérience, il est toujours conseillé que l&#39;expérience est répétée au moins trois fois et l&#39;analyse statistique effectuée. Ce test peut être utilisé ou pour comparer la perméabilité des vaisseaux de souris qui ont été génétiquement modifiés, ainsi que les souris de différentes origines génétiques. On peut évaluer la perméabilité à la présence ou l&#39;absence d&#39;un stimulus, en fonction de la fonction du gène qui est modulé. Ce test peut également être utilisé ou pour tester l&#39;effet de différents composés sur la perméabilité des vaisseaux.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIF </td></tr><tr><td> Evans Blue </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDE </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Phosphate 0,2 M 1,5 M de NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> SPECTROPHOTOMÈTRE </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> DISPOSITIF DE RETENUE SOURIS </td><td> HARVARD APPARATUS </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> SERINGUE </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> AIGUILLES </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> La jauge de l&#39;aiguille dépend de la taille de l&#39;animal. </td></tr><tr><td> SOLDE </td><td> Denver Instrument </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vivo</emtest&gt; tester la perméabilité des vaisseaux sanguins

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Cette méthode est basée sur l&#39;injection intraveineuse de bleu d&#39;Evans dans la souris comme modèle animal d&#39;essai. Bleu Evans est un colorant qui se lie albumine. Dans les conditions physiologiques de l&#39;endothélium est imperméable à l&#39;albumine, de sorte Evans bleus assortis de restes d&#39;albumine limitée dans les vaisseaux sanguins. Dans des conditions pathologiques qui favorisent l&#39;augmentation des cellules endothéliales vasculaires perméabilité partiellement perdent leurs contacts étroits et l&#39;endothélium devient perméable à de petites protéines comme l&#39;albumine. Cette condition permet d&#39;extravasation de bleu d&#39;Evans dans les tissus. Un endothélium sain empêche extravasation du colorant dans les tissus vascularisés voisins. Organes ayant une perméabilité accrue montrera nettement augmenté par rapport à coloration bleue des organes avec endothélium intact. Le niveau de perméabilité vasculaire peut être évaluée par simple visualisation ou par mesure quantitative du colorant constituée par milligramme de tissu de contrôle par rapport à des animaux d&#39;expérimentation / tissu. Deux PoweRFUL aspects de ce test sont sa simplicité et caractéristiques quantitatives. Colorant bleu Evans peut être extrait à partir de tissus en incubant une quantité spécifique d&#39;un tissu en le formamide. Maximale d&#39;absorbance Evans Blue est à 620 nm et un minimum d&#39;absorption est à 740 nm. À l&#39;aide d&#39;une courbe d&#39;étalonnage pour le bleu Evans, mesures de densité optique peut être transformé en colorant milligramme capturé par milligramme de tissu. L&#39;analyse statistique doit être utilisée pour évaluer des différences significatives dans la perméabilité vasculaire.

Nous avons utilisé un test de perméabilité in vivo pour tester les fuites navire dans des souris âgées de 8-12 semaines. Ce test est utile pour comparer la perméabilité relative vasculaire entre les animaux de fond génétique différent ou dans une seule souche de souris soumises à des traitements qui affectent le système vasculaire. Nos résultats montrent que la souche de souris génétiquement modifiées, nous avons créé dans notre laboratoire dispose d&#39;un endothélium plus perméable par rapport aux so...

Nous présentons une<em&gt; In vivo</em&gt; Test afin de tester la perméabilité des vaisseaux sanguins. Ce test est basé sur l&#39;injection intraveineuse d&#39;un colorant et visualisation ultérieure de sa diffusion dans les espaces interstitiels.

Un<em&gt; In vivo</emTest&gt; Tester la perméabilité des vaisseaux sanguins

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Cette vidéo présente un test in vivo pour évaluer la perméabilité des vaisseaux sanguins. Chez la souris, les cellules endothéliales tapissent les vaisseaux sanguins et forment une barrière semi-perméable. Dans des conditions physiologiques, l'endothélium est imperméable à la plupart des protéines, ce qui les confine à la circulation sanguine.Dans les conditions pathologiques qui favorisent une perméabilité vasculaire accrue, les cellules endothéliales perdent partiellement le contact entre elles. L’endothélium devient perméable aux petites protéines telles que l’albumine. Dans ce dosage, nous injectons par voie intraveineuse un colorant bleu qui se lie à l’albumine en cas de perméabilité endothéliale augmentée.Le D franchit la barrière endothéliale et diffuse dans l'espace interstitiel. Cela entraîne finalement une coloration bleuâtre du tissu affecté avant le début de l'expérience. Préparez tous les matériaux nécessaires, le pipetage et les embouts stériles.Évans bleu, spatule stérile, PBS stérile, seringue stérile et aiguilles. Souris, dispositif de contention pour souris, instruments de dissection, plateau de dissection et épingles. Balance de laboratoire, bloc chauffant pour b

an-in-vivo-assay-to-test-blood-vessel-permeability

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Cette vidéo décrit un test de perméabilité permettant d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique in vitro à l’aide de molécules de fluorescéine sodique.

Essai de perméabilité mimétique de la barrière hémato-encéphalique : un essai in vitro pour évaluer la perméabilité de l’imitation de la BHE aux molécules traceurs

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Le maintien de la couverture de la barrière hémato-encéphalique est la clé de l'homéostasie du système nerveux central. Ce protocole décrit des techniques in vitro pour délimiter les processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture de la barrière hémato-encéphalique.

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Nous présentons ici un protocole visant à mesurer la perméabilité vasculaire induite par l’administration intradermique des agents favorisant la perméabilité dans la peau de souris. Cette technique peut servir à déterminer la capacité des molécules à promouvoir ou à inhiber une fuite vasculaire ou d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la perméabilité vasculaire.

Évaluation vasculaires hyperperméabilité inducteurs enzymatiques de la peau avec le test de Miles

L’accès des nutriments, de métabolites de la microbiote et de médicaments pour la circulation est contrôlée par la barrière intestinale-(GBB). Nous décrivons une méthode directe pour mesurer le GBB perméabilité in vivo, qui, contrairement aux méthodes indirectes couramment utilisés, n’est pratiquement pas affecté par les fonctions hépatiques et rénales.

Une méthode In Vivo pour l’évaluation de la barrière intestinale-sang et le métabolisme hépatique du microbiote produits

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Ce protocole illustre un test in vitro de transcytose des cellules endothéliales comme modèle pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne en mesurant la capacité des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines à transporter la peroxydase de raifort à travers les cellules dans les processus de transport transcellulaire médiés par les cavéoles.

Essai de transcytose cellulaire endothéliale comme modèle in vitro pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne

Dans le présent protocole, la fonction de barrière endothéliale de la glande sous-maxillaire (SMG) a été évaluée en injectant différents traceurs fluorescents pondérés moléculairement dans les veines angulaires de modèles animaux testés in vivo sous un microscope à balayage laser à deux photons.

In vivo Détection de perméabilité vasculaire dans la glande sous-maxillaire de souris

La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.

Essai de bouchon de gel matriciel in vivo modifié pour les études d’angiogenèse

Apprenez à tester la perméabilité vasculaire in vivo chez la souris en utilisant un colorant bleu lié à l'albumine. Cette méthode permet d'évaluer l'intégrité des cellules endothéliales et de visualiser la diffusion tissulaire.

Un

Explorer plus de vidéos