Name: Croissance Staphylococcus aureus en utilisant lhémoglobine humaine comme source de fer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Découvrez comment Staphylococcus aureus utilise l'hémoglobine humaine comme source de fer unique. Cette méthode d'acquisition du fer révèle les mécanismes bactériens essentiels pour la croissance pathogène.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette recherche a été financée par des subventions publiques aux États-Unis des services de santé et AI073843 AI69233 de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses. EPS est un Fellow Burroughs Wellcome dans la pathogenèse des maladies infectieuses. KPH a été financé par le cellulaire et moléculaire Microbiologie Subvention de formation Programme 5 T32 A107611-10.

1. Purification de l&#39;hémoglobine à partir de sang frais <ol><li> Acquérir le sang frais humain additionné d&#39;un anticoagulant. Gardez le sang sur la glace ou à 4 ° C tout au long de la purification. </li><li> Centrifuger le sang pendant 20 min à 1500 x g. Les globules rouges (GR) est au fond du tube. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans une solution glacée de NaCl 0,9% (p / v). Répétez la centrifugation et laver 3 fois. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 volume de glace-froid 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0). Cela induire la lyse des globules rouges en raison de la pression osmotique. Ajouter le toluène à ~ volume final de 20%. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant la nuit sur une rôtissoire. </li><li> Centrifuger le lysat à 20.000 xg pendant 1 heure. Recueillir la fraction hémolysat milieu en laissant intacte l&#39;toluène (flottant au-dessus) et le culot. Utiliser une pipette long cou pour recueillir la fraction intermédiaire. </li><li> Traverser 0,44 um filtre seringue. Si la solution contient des particulesla matière et ne peut pas être passé à travers le filtre, répéter l&#39;étape 1,5. </li><li> Purifier l&#39;hémoglobine (Hb) par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) colonne échangeuse d&#39;anions (Varian, PL-SAX 1000 A 8 um, 150 mm x 4,6 mm). A la phase mobile est de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et la phase mobile B est 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Un gradient de 0% -100% de solvant B est géré de plus de 2 minutes avec une fréquence du débit de 2,0 ml / min. L&#39;élution est suivie basé sur l&#39;absorption (λ: 410 nm et 280 nm). Recueillir la fraction seulement caractérisée par une couleur rouge vif et un pic d&#39;absorption importante (figure 1). </li><li> Dialyser contre l&#39;élution du tampon phosphate salin (PBS) pendant une nuit, puis pendant quelques heures encore. Stériliser par passage à travers un filtre de 0,22 um seringue. </li><li> Pour mesurer la concentration d&#39;hémoglobine, de préparer des solutions étalons de concentrations connues d&#39;hémoglobine dans du PBS. Déterminer la concentration de l&#39;hémoglobine dans l&#39;échantillon en mélangeant les solutions standard (voir la table avec des réactifs noused) ou la solution d&#39;échantillon avec le réactif de Drabkin 2x (préparé à partir de poudre) dans un rapport 1:1. Par exemple, mélanger 100 ul de solution de réactif Hb 100 pi 2x Drabkin dans des plaques 96 puits. Incuber pendant 15 min et mesurer l&#39;absorbance à 540 nm. Tracer une courbe d&#39;étalonnage et déterminer la concentration d&#39;hémoglobine dans l&#39;échantillon. Cinq à quinze mg / ml rendements sont typiques. </li><li> Exécuter mg 15-20 hémoglobine purifiée sur un 15% SDS-PAGE en double exemplaire. Tacher une des gels; transférer les protéines d&#39;une autre gel sur une membrane de nitrocellulose et immunoblot de l&#39;hémoglobine (Figure 2). </li><li> Congeler et stocker des aliquotes de 1 ml d&#39;hémoglobine dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Médias de croissance Préparation de fer appauvrissent <ol><li> Préparer Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de bouillon en dissolvant la poudre dans de l&#39;eau RPMI, ajouter du bicarbonate de sodium tel que recommandé par le fabricant et 1% d&#39;acides cassamino (CA) (w / v). Stériliser par passage à travers un filtre de 0,2 um et stocker frigoaccélérées. </li><li> Préparer appauvri en métal RPMI (NRPMI) en ajoutant 7% (p / v) Chelex 100 et le mélange pendant une nuit sur une plaque d&#39;agitation. Retirer Chelex 100 en passant à travers un filtre 0,2 um et stocker au réfrigérateur. Supplément médias essentiels métaux non ferreux: 25 uM 2 ZnCl, 25 pM MnCl 2, 100 mM de CaCl 2 et MgCl 2 1 mM préparé à l&#39;avance comme un stérile 1000 x solution. Utilisez des contenants en plastique jetables pour cette étape pour éviter la contamination de fer de fournitures réutilisables. </li></ol> 3. Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l&#39;hémoglobine comme source de fer Sole <ol><li> Série S. aureus pour l&#39;isolement sur ​​gélose TSA (TSA) à partir d&#39;un stock congelé. Incuber à 37 ° C pendant 20-24 heures. </li><li> Remettre en suspension l&#39;acide éthylènediamine-N, N&#39;-bis (2-hydroxyphénylacétique) (EDDHA) dans de l&#39;éthanol anhydre à 100 mM. EDDHA ne pas en solution, mais est stérilisé par l&#39;éthanol. </li><li> Ajouter EDDHA de RPMI à une concentration finale de 0,5 mM. PermettreEDDHA pour dissoudre au moins 30 min avant de procéder à l&#39;étape suivante. En raison de lot à lot variation, concentration finale EDDHA peut-être besoin d&#39;être abaissé à 0,25 mM pour permettre la croissance bactérienne. </li><li> Inoculer des colonies isolées de S. aureus dans 5 ml de RPMI contenant EDDHA dans 15 ml à bouchon à vis des tubes coniques. Incuber à 37 ° C sous agitation à 180 tours par minute (tpm) pendant 16-20 h. </li><li> Centrifuger les cultures d&#39;une nuit pendant 5 min à 7500 xg et remettre en suspension le culot dans NRPMI contenant 0,5 mM EDDHA. Normaliser OD 600 à ~ 3. </li><li> Préparer NRPMI contenant 2,5 ug par ml Hb et 0,1-1,0 mM EDDHA. Due à la variation entre les lots, la concentration EDDHA nécessaire pour chélater le fer libre dans NRPMI peuvent varier. </li><li> Subculture 10 ul de suspension bactérienne à partir de l&#39;étape 3.5 dans 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb dans un 15 ml à bouchon à vis tube conique. </li><li> Incuber les cultures à 37 ° C pendant 48 h pour en agitant à 180 tours par minute ou sur un tambour de roulage. </li><li&gt; Chaque hr 6-12 prendre DO 600 lectures en éliminant 50 pi de la culture et de la mélanger avec 150 pi de PBS dans des plaques 96 puits. </li></ol>

<ol><li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li>
<li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+for+blood%3A+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).</li>
<li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+battle+for+iron%3A+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection.+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li>
<li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22IsdH.+The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li>
<li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li>
<li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li>
<li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li>
<li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li>
<li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li>
<li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li>
<li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li>
<li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).</li>
<li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li>
<li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li>
<li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA%2C+IsdB%2C+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Fems.+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li>
<li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li>
<li>Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li>
<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
<li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li>
<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
<li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli%3A+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li>
<li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à déclarer.

Le fer est un nutriment essentiel requis par les organismes de tous les royaumes de la vie 15. Chez les vertébrés, le fer est séquestré à éviter la toxicité provoquée par cet élément. Cette séquestration dissimule aussi le fer de microbes envahisseurs dans un processus connu sous le nom immunité nutritionnel 16. En réponse, les agents pathogènes ont développé des stratégies permettant de contourner l&#39;immunité nutritionnel. Un tel mécanisme repose sur l&#39;hémoglobine, qui est la source la plus...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Colonne HPLC d&#39;échange d&#39;anions </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif de Drabkin </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> Norme hémoglobine </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Forme Chelex sodium 100 </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> Normes de LGC GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hémoglobine un anticorps </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Gélose TSA </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

croissance staphylococcus aureus en utilisant l&#39;hémoglobine humaine comme source de fer

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus est une bactérie pathogène qui nécessite de fer pour mener à bien les fonctions vitales du métabolisme et causer des maladies. Le réservoir le plus abondant de fer à l&#39;intérieur de l&#39;hôte humain est l&#39;hème, qui est le cofacteur de l&#39;hémoglobine. Pour acquérir le fer de l&#39;hémoglobine, S. aureus utilise un système complexe connu sous le déterminant de surface régulée par le fer (Isd) système 1. Composants du premier système d&#39;hémoglobine Isd hôte bind, puis extraire et importer l&#39;hème, et enfin libérer de fer de l&#39;hème dans le cytoplasme bactérien 2,3. Cette voie a été disséqué par de nombreuses études in vitro 4-9. En outre, la contribution du système Isd à l&#39;infection a été maintes fois démontrée dans des modèles de souris 8,10-14. Instituant la contribution du système Isd à l&#39;hémoglobine dérivée de l&#39;acquisition du fer et de la croissance s&#39;est avérée plus difficile. Essais de croissance en utilisant l&#39;hémoglobine en tant que source de fer unique sont compliquées by l&#39;instabilité de l&#39;hémoglobine disponible dans le commerce, contaminant fer libre dans le milieu de croissance, et la toxicité associée à des chélateurs du fer. Nous présentons ici une méthode qui permet de surmonter ces limitations. D&#39;hémoglobine de qualité est préparé à partir du sang frais et conservés dans l&#39;azote liquide. L&#39;hémoglobine purifiée est complétée en fer épuiser milieu simulant le milieu pauvre en fer rencontrées par les agents pathogènes à l&#39;intérieur de l&#39;hôte vertébré. En affamant S. aureus de fer libre et en complétant un formulaire de manipulation minimale de l&#39;hémoglobine nous induire la croissance d&#39;une manière qui dépend entièrement de la capacité de lier l&#39;hémoglobine, d&#39;extraire l&#39;hème, l&#39;hème passer à travers l&#39;enveloppe cellulaire bactérienne et de dégrader l&#39;hème dans le cytoplasme. Ce test sera utile pour les chercheurs qui cherchent à élucider les mécanismes de l&#39;acquisition du fer hemoglobin-/heme-derived dans S. aureus et éventuellement d&#39;autres agents pathogènes bactériens.

Nous avons purifié l&#39;hémoglobine humaine à partir hémolysat par HPLC (étape Protocole de 1,7). Figure 1 montre enregistrées absorbance de l&#39;éluat à 280 nm et 410 longueurs d&#39;onde. Fraction 5 a été recueilli et autres fractions ont été rejetées. Les rendements de cinq à quinze milligrammes d&#39;hémoglobine par millilitre d&#39;éluat sont généralement acquises. D&#39;hémoglobine purifiée a été analysée par SDS-PAGE en double et les gels ont été soit colorés pour des protéines ou transférées s...

Nous décrivons ici un test de croissance pour<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; En utilisant l&#39;hémoglobine comme la seule source de fer nutritif disponible. Ce test établit le rôle des facteurs bactériens impliqués dans l&#39;hémoglobine dérivée de l&#39;acquisition du fer.

Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l&#39;hémoglobine humaine comme source de fer

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Cette expérience teste la capacité du staphylocoque doré à utiliser l’hémoglobine humaine comme seule source de fer. Tout d’abord, isolez les globules rouges du sang humain frais. Purifier l’hémoglobine par chromatographie liquide à haute performance pour assurer l’intégrité de l’hémoglobine.Ajoutez maintenant de l’hémoglobine dans un milieu appauvri en fer pour fournir le fer sous forme d’hémoglobine Culture suivante. S reus. En présence d’hémoglobine et mesurer sa capacité à utiliser l’hémoglobine comme source de fer.Les résultats montrent que le reus prolifère en présence d’hémoglobine comme seule source de fer. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la question de savoir si un agent pathogène peut utiliser les protéines de l’hôte comme sources de fer, et quels mécanismes sont nécessaires pour utiliser le fer à l’aide de ce processus. Ainsi, cette méthode peut donner un aperçu de l’acquisition de fer du staphylocoque à partir de l’hémoglobine.Il peut également être appliqué à l’étude d’autres bactéries et à la façon dont elles utilisent les protéines contenant du fer de l’hôte. GLA Ani et Catherine Haley de mon la

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un protocole général pour l'étude de l'invasion des cellules hôtes par une bactérie pathogène, en se concentrant...

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Source : Gupta, S., et al. Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure de culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer pour induire un stress en fer et favoriser la sécrétion de sidérophores qui favorisent la survie bactérienne.

Culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer

Source : Maurakis, S., et al. Croissance limitée en métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux à partir de ligands hôtes. J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo présente un test de croissance bactérienne limité aux métaux pour étudier le rôle des gènes sensibles aux métaux. Les bactéries de type sauvage et mutantes cultivées dans un milieu appauvri en métal sont incubées avec des ligands métalliques, et leur croissance est...

Essai de croissance bactérienne limitée aux métaux pour étudier le rôle des gènes sensibles aux métaux

Source : Behera, R.K. et al., Une méthode basée sur la fluorescence pour étudier la régulation génétique bactérienne dans les tissus infectés. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la préparation de cultures hémolytiques de Staphylococcus aureus pour standardiser la croissance bactérienne et obtenir une synchronisation métabolique pour les études d’interaction hôte-pathogène.

Préparation d’une culture hémolytique de Staphylococcus aureus pour des études d’interaction hôte-pathogène

Dans cette vidéo, nous démontrons un test permettant de détecter la cytotoxicité de souches virulentes et moins virulentes de Staphylococcus aureus contre des neutrophiles humains après phagocytose à l’aide de la cytométrie en flux.

Dosage de la cytotoxicité des souches de Staphylococcus aureus sur les neutrophiles après phagocytose

Nous décrivons ici un protocole pour l'extraction des métabolites à partir de Staphylococcus aureus et leur analyse ultérieure par Chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l&#39;analyse des Métabolite<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Nous décrivons ici une méthode pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae dans le milieu liquide métal-restreint pour faciliter l’expression des gènes pour l’apaisement de métal. Nous dénoncions également des expériences en aval pour caractériser le phénotype des gonocoques cultivés dans ces conditions. Ces méthodes peuvent être adaptées pour être adaptées à la caractérisation des gènes sensibles au métal chez d’autres bactéries.

Croissance limitée des métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux auprès de l’hôte Ligands

Ce protocole vise à décrire comment étudier l’étendue de l’internalisation de Staphylococcus aureus et sa capacité à survivre à l’intérieur de la cellule hôte humaine, ainsi que l’efficacité intracellulaire des composés antimicrobiens.

Essai de protection enzymatique amélioré pour étudier l’internalisation de Staphylococcus aureus et l’efficacité intracellulaire des composés antimicrobiens

Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole complet pour évaluer la survie aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, en transformant les plasmides en P. aeruginosa et S. aureus pour créer des souches rapporteures et visualiser des variantes phénotypiques, telles que les persistants, par microscopie à épifluorescence time-lapse.

Imagerie par microscopie à épifluorescence time-lapse de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus Phénotypes hétérogènes

Découvrez comment Staphylococcus aureus utilise l'hémoglobine humaine comme source de fer unique. Cette méthode d'acquisition du fer révèle les mécanismes bactériens essentiels pour la croissance pathogène.

Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine humaine comme source de fer

Explorer plus de vidéos