Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine humaine comme source de fer
7 février 2013
Nous décrivons ici un test de croissance pour Staphylococcus aureus En utilisant l'hémoglobine comme la seule source de fer nutritif disponible. Ce test établit le rôle des facteurs bactériens impliqués dans l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer.
Cette expérience teste la capacité du staphylocoque doré à utiliser l’hémoglobine humaine comme seule source de fer. Tout d’abord, isolez les globules rouges du sang humain frais. Purifier l’hémoglobine par chromatographie liquide à haute performance pour assurer l’intégrité de l’hémoglobine.
Ajoutez maintenant de l’hémoglobine dans un milieu appauvri en fer pour fournir le fer sous forme d’hémoglobine Culture suivante. S reus. En présence d’hémoglobine et mesurer sa capacité à utiliser l’hémoglobine comme source de fer.
Les résultats montrent que le reus prolifère en présence d’hémoglobine comme seule source de fer. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la question de savoir si un agent pathogène peut utiliser les protéines de l’hôte comme sources de fer, et quels mécanismes sont nécessaires pour utiliser le fer à l’aide de ce processus. Ainsi, cette méthode peut donner un aperçu de l’acquisition de fer du staphylocoque à partir de l’hémoglobine.
Il peut également être appliqué à l’étude d’autres bactéries et à la façon dont elles utilisent les protéines contenant du fer de l’hôte. GLA Ani et Catherine Haley de mon laboratoire feront la démonstration de cette technique. Tout d’abord, prélevez du sang humain fraîchement isolé, complété par un anticoagulant et maintenez à quatre degrés Celsius tout au long de la purification Pellet les globules rouges par centrifugation pendant 20 minutes à 15 000 Gs.Aspirez soigneusement le snat et remettez doucement en suspension le granulé dans une solution de chlorure de sodium glacée à 0,9 % Après trois lavages, ressus, suspendez le granulé dans un volume de triss glacé 10 millimolaires, HCL pour lyre les globules rouges par pression osmotique.
Ajoutez ensuite du toluène à 20 % du volume final et incubez à quatre degrés Celsius sur un rotateur pendant la nuit. Centrifugeuse suivante. Le lysat à 20 000 Gs par heure.
Recueillir la fraction moyenne de l’hémolysat, en laissant la couche supérieure de toluène et la pastille intactes. Passez l’hémolysat à travers un filtre à seringue de 0,44 micromètre. Si la solution contient des particules et ne peut pas passer à travers le filtre, répétez la centrifugation à grande vitesse.
Purifiez maintenant l’hémoglobine avec une colonne d’échange d’anions par chromatographie liquide à haute performance. Utilisez une phase A mobile de 10 millimolaires de 10 millimolaires, HCL, et une phase mobile B de 10 millimolaires, HCL plus 0,5 molaire de chlorure de sodium. Exécutez un gradient de 0 % à 100 % de solvant B pendant deux minutes à un débit de deux millilitres par minute.
Surveiller l’élution sur la base de l’absorption à 410 nanomètres et 280 nanomètres. Collectez la fraction caractérisée par une couleur rouge vif et un pic d’absorption proéminent. Dialyser l’élution contre une solution saline tamponnée au phosphate pendant environ 16 heures.
Pour stériliser l’échantillon, passez-le à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre pour déterminer la concentration d’hémoglobine. Préparez les solutions standard HP dans PBS. Mélangez maintenant les solutions étalons ou les solutions d’échantillon avec deux réactifs xra kins dans un rapport de un à un dans des plaques à 96 puits après une incubation de 15 minutes d’absorbance mesurée à 540 nanomètres.
Tracez une courbe standard et déterminez la concentration en HP des échantillons de cinq à 15 milligrammes par millilitre. Les rendements sont des aliquotes typiques de 15 à 20 microgrammes d’échantillon d’hémoglobine purifiée sur deux gels de page STS à 15 %. Colorez l’un des gels et transférez les protéines d’un autre gel sur une membrane de nitrocellulose pour immuno-éponger pour l’hémoglobine, gelez et stockez un millilitre d’aliquotes de l’hémoglobine isolée dans de l’azote liquide à partir d’une traînée de stock congelée S aureus sur un triptyque, une gélose de soja, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures.
Inoculer des colonies individuelles dans cinq millilitres de RPMI contenant E-D-D-H-A et cultiver à 37 degrés Celsius avec agitation à 180 RP M pendant la nuit. Granulez les bactéries par centrifugation pendant cinq minutes à 7 500 G, puis Resus, suspendez les bactéries dans un RPMI contenant 0,5 millimolaire E-D-D-H-A, et normalisez à un OD 600 d’environ trois. Ensuite, préparez N-R-P-M-I contenant 2,5 microgrammes par millilitre, HB et 0,1 à un millimolaire E-D-D-H-A pour chélater le fer libre.
Maintenant, la sous-culture de 10 microlitres de suspension bactérienne dans un millilitre de N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus HP incube les cultures à 37 degrés Celsius jusqu’à 48 heures avec agitation à 180 RRP M toutes les six à 12 heures. Retirez 50 microlitres du mélange de culture avec 150 microlitres de PBS dans des plaques à 96 puits et prenez des lectures OD 600. Dans cette purification HPLC de l’hémoglobine humaine à partir de l’hémolysat, l’absorbence de l’éluat aux longueurs d’onde de 280 et 410 nanomètres est mesurée avec la fraction cinq contenant l’hémoglobine.
En règle générale, des rendements de cinq à 15 milligrammes d’hémoglobine par millilitre sont obtenus par préparation. L’hémoglobine purifiée a été analysée par la page SDS en double, et les gels ont été soit supports pour les protéines, soit transférés sur de la nitrocellulose et immuno blotted. Ensuite, l’hémoglobine humaine purifiée a été testée pour sa capacité à soutenir la croissance de l’asus de type sauvage et de l’ASUS qui n’a pas le récepteur de l’hémoglobine requis pour l’acquisition du fer dérivé de l’hémoglobine.
L’augmentation de la densité optique des cultures au fil du temps indique que dans N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus hb, le type sauvage ASUS prolifère, mais pas le mutant. En revanche, la capacité d’utiliser du fer libre supplémenté est identique dans les souches de type sauvage et mutantes, ni l’une ni l’autre ne prolifère en l’absence d’une source. Dans cette comparaison de milieux complétés par de l’hémoglobine purifiée à partir de sang frais ou de l’hémoglobine lyophilisée, l’hémoglobine purifiée à partir du sang nécessite l’ISDB pour sa croissance.
Alors que l’hémoglobine lyophilisée permet la prolifération du mutant ISDB Une fois maîtrisée, une bonne purification de l’hémoglobine peut être réalisée en quelques heures. N’oubliez pas que les donneurs sont des porteurs potentiels d’agents pathogènes transmissibles par le sang, alors traitez le sang humain comme une matière biologique dangereuse.
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Aperçu
Cette étude examine la capacité de Staphylococcus aureus à utiliser l'hémoglobine humaine comme unique source de fer. Le test de croissance mis au point met en évidence les facteurs bactériens impliqués dans l'acquisition du fer dérivé de l'hémoglobine.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie des agents pathogènes
- Mécanismes d'acquisition du fer
Contexte
- Staphylococcus aureus est un pathogène humain important.
- Le fer est essentiel à la croissance et au métabolisme bactériens.
- L'hémoglobine peut servir de source de fer pour les bactéries.
- Comprendre l'acquisition du fer peut orienter les stratégies thérapeutiques.
Objectif de l'étude
- Évaluer la capacité de S. aureus à utiliser l'hémoglobine.
- Identifier les facteurs bactériens impliqués dans l'acquisition de fer à partir de l'hémoglobine.
- Mettre en place un test de croissance pour l'étude du métabolisme du fer.
Méthodes utilisées
- Isolation de globules rouges à partir de sang humain frais.
- Purification de l'hémoglobine par chromatographie liquide à haute performance.
- Préparation d'un milieu dépourvu de fer supplémenté en hémoglobine.
- Culture de S. aureus en présence d'hémoglobine.
Résultats principaux
- S. aureus a utilisé avec succès l'hémoglobine comme source de fer.
- Le test a démontré l'efficacité de l'acquisition du fer dérivé de l'hémoglobine.
- Les facteurs bactériens essentiels à ce processus ont été identifiés.
- Les résultats contribuent à la compréhension du métabolisme bactérien du fer.
Conclusions
- Le test de croissance est efficace pour étudier l'acquisition du fer chez S. aureus.
- L'hémoglobine constitue une source de fer viable pour la croissance bactérienne.
- Les connaissances acquises pourraient aider au développement de stratégies thérapeutiques contre les infections à S. aureus.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mise en place de tests de croissance dépendants de l'hémoglobine permet de réduire les risques mécanistiques liés aux cibles d'acquisition du fer chez Staphylococcus aureus, un pathogène prioritaire dans le développement d'agents antimicrobiens. Cette méthode soutient la validation des cibles en reliant les déterminants génétiques à l'utilisation phénotypique du fer, orientant ainsi les décisions précoces de découverte. Elle fournit un système pertinent sur le plan pathologique pour évaluer les inhibiteurs du système Isd, en accord avec les efforts précliniques visant à perturber les mécanismes de virulence.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en testant si la liaison de l'hémoglobine et l'extraction de l'hème sont nécessaires à la croissance en conditions de restriction en fer.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle des composants du système Isd grâce à des tests de complémentation de croissance dans un milieu défini pauvre en fer.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en distinguant les phénotypes de croissance dépendants de l'hémoglobine et ceux indépendants du fer chez des souches mutantes.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi pour les tests : Produit une hémoglobine standardisée et purifiée à partir de sang frais pour une supplémentation cohérente dans les essais de croissance microbiologique.
- Résultats quantitatifs : Génère des paramètres de croissance basés sur l'OD600 reflétant l'efficacité de l'importation de l'hème et de sa dégradation cytoplasmique.
- Reproductibilité : Réduit au minimum les variations dues au fer libre contaminant et à l'instabilité de l'hémoglobine grâce à une préparation et une conservation contrôlées.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Imiter l'environnement pauvre en fer rencontré par S. aureus pendant l'infection, ce qui améliore la fidélité de la traduction.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Préciser la contribution de l'acquisition de fer dérivé de l'hémoglobine à la virulence, afin d'orienter la priorisation des cibles.
- Continuité préclinique : Relier les phénotypes de croissance in vitro à des modèles d'infection in vivo dans lesquels le système Isd est essentiel.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cet essai s'inscrit dans la continuité de la découverte précoce, en soutenant la vérification d'hypothèses lors de la validation de cibles et en permettant le criblage reproductible de composés contre les voies d'acquisition du fer.
- Biologie de la découverte : Évalue si des perturbations génétiques dans les récepteurs de l'hémoglobine ou les transporteurs d'hème suppriment la croissance utilisant l'hémoglobine comme seule source de fer.
- Tri : Fournit des mesures quantitatives de croissance permettant d'analyser l'effet de composés sur la prolifération dépendante de l'hémoglobine, avec une compatibilité élevée en format.
- Analytique : Fournit des mesures d'absorbance à 600 nm au cours du temps afin d'évaluer les différences cinétiques d'efficacité dans l'acquisition du fer entre souches.
- Recherche translationnelle : S'inscrit en cohérence avec les modèles précliniques démontrant la dépendance au système Isd pour la survie dans des hôtes vertébrés.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un protocole standardisé de préparation de l'hémoglobine applicable à plusieurs études sur des staphylocoques et autres bactéries pathogènes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en isolant la croissance dépendante de l'hémoglobine de la contamination par le fer ambiant.
- Valeur opérationnelle : Assure la cohérence des réactifs grâce à une hémoglobine purifiée par HPLC et stockée dans de l'azote liquide, minimisant ainsi la variabilité entre lots.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en confirmant l'interaction avec la cible par des tests de sauvetage phénotypique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression des composés ciblant l'absorption de l'hème ou la dégradation cytoplasmique de l'hème, ajustée au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans la manipulation du sang, la purification des protéines et les techniques microbiologiques anaérobies.
- Dépend de l'accès à du sang humain frais, à des systèmes de chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) et à un stockage à basse température pour assurer la stabilité de l'hémoglobine.
- Nécessite une standardisation entre laboratoires afin de contrôler les variations liées à la préparation de l'hémoglobine et à l'efficacité des chélateurs de fer.
- Doit tenir compte de la toxicité potentielle des chélateurs de fer comme l'EDDHA lors de l'optimisation des formulations de milieux.
- Se limite aux pathogènes possédant des systèmes caractérisés d'absorption de l'hémoglobine/hème ; n'est pas applicable aux organismes dépourvus de voies homologues.
