Name: Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des myofibres uniques avec leurs cellules satellites du muscle EDL de souris adultes. Cette méthode préserve l'association myofibre/cellule souche pour étudier l'activation et la différenciation des cellules satellites dans leur niche physiologique.

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Nous tenons à remercier Sarah Dick pour fournir des lectures critiques et commentaires. MAR titulaire de la Chaire de recherche du Canada en génétique moléculaire et est un chercheur-boursier international du Howard Hughes Medical Institute. Ce travail a été soutenu par des subventions à MAR de la National Institutes of Health, le Howard Hughes Medical Institute, les Instituts de recherche en santé, la Muscular Dystrophy Association et le Programme canadien Chaire de recherche.

Toutes les expériences ont été traitées selon l&#39;Université d&#39;Ottawa de la réglementation des soins aux animaux et de manutention. Voir le tableau 1 pour une vue d&#39;ensemble du protocole. 1. Avant de commencer l&#39;isolement <ol><li> Préparer les solutions suivantes: Type de collagénase 0,2% I dans du DMEM (Dulbecco modifié Eagle moyen; taux élevé de glucose, L-glutamine avec 110 mg / ml de pyruvate de sodium). Pendant deux muscles EDL préparer 2 ml de Collagenease 0,2% dans du DMEM. Filtrer la solution à travers filtre de 0,22 um. 10 min avant l&#39;isolement, préchauffer à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Aliquotes supplémentaires de la collagénase non dilué peut être congelé à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Remarque: l&#39;utilisation du DMEM avec du pyruvate de sodium pendant toute la procédure. Fibres ne survivent pas en sodium pyruvate du milieu exempt. <ul><li> Médias à laver (utiliser pour effectuer tous les lavages). Supplément DMEM avec 1% de pénicilline / streptomycine. Filtre à 00,22 um filtre avant de l&#39;utiliser. </li><li> Milieux de culture myofibrille. Supplément DMEM avec 20% de FBS, extrait d&#39;embryon de poulet 1% et 1% de pénicilline / streptomycine. Filtrer à travers filtre de 0,22 um avant utilisation. </li><li> Matrigel plats revêtus. Pour les fibres de la culture pour la période de temps prolongée, nous vous recommandons d&#39;utiliser comme substrat Matrigel revêtement. Pour préparer des plats revêtus de Matrigel, décongeler une aliquote de Matrigel à 4 ° C pendant une nuit. Le lendemain, diluer Matrigel 1:10 dans du DMEM. Gardez Matrigel à 4 ° C en tout temps et éviter les changements brusques de température car cela va créer des cristaux microscopiques dans la solution de Matrigel résultant de revêtement irrégulier. Placez les plats à revêtir sur glace. Manteau de plats avec un volume juste assez pour couvrir la surface. Laissez-le reposer pendant 1 min. Supprimer complètement le Matrigel restes. Laissez la vaisselle sécher à 37 ° C pendant au moins 3 heures avant de l&#39;utiliser ou de la nuit. </li></ul> Remarque: aliquotes de Matrigel diluée peut être réutilisée plusieurs fois à des fins de revêtement si elle est conservée à 4 et deg; C. </li><li> Enfin, n&#39;oubliez pas de nettoyer la station de microscope et des outils de dissection avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Pendant deux isolements EDL (une souris) préparer cinq boîtes de Pétri en plastique (60 * 15mm) comme suit: <ul><li> Quatre plats pour l&#39;isolement (1 pour le muscle de dissociation, 3 pour les lavages en série). Tous les plats doivent être enduites de sérum de cheval (HS) pour éviter de se fixer aux fibres musculaires en plastique. Pour manteau, pipette 3 ml de sérum de cheval dans chaque boîte, tourbillon pour permettre même revêtement, enlever le sérum de cheval et laissez-le sécher le plat pendant au moins 30 min. Ajouter 4 ml de DMEM à chaque plat. Garder la vaisselle à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur avant de l&#39;utiliser. </li></ul> Note: le sérum de cheval peut être réutilisée plusieurs fois, si maintenue stérile. En variante, une solution de HS 10% dans du DMEM peut être utilisée pour enrober des plats. Utilisez de la vaisselle SH enduits à travers l&#39;ensemble du protocole et de la culture des fibres musculaires lorsque des conditions variables. <ul><li> Un plat sera utilisé pour fibres musculaires après l&#39;isolement de la culture. Alttailles de paraboles ernative ou formats peuvent être utilisés pour la culture finale des fibres musculaires en fonction des applications en aval. Cependant, nous ne suggérons pas tailles de paraboles de plus de 60 * 15mm. Myofibres peut être maintenu en suspension pendant plus de 96 heures avant la contraction se produit hyper. Pour les temps de culture plus longues, nous recommandons l&#39;utilisation de Matrigel plats revêtus ou plaques. </li></ul></li><li> Pour une isolation en fibre (2 EDL), préparer deux stériles Pipettes Pasteur: une pipette de grand calibre pour la manipulation des muscles et une pipette de petit calibre pour la manipulation myofibrille. Utiliser un stylet de diamant pour couper chaque pipette en verre à la longueur souhaitée et polir la chaleur pour lisser les bords de la pipette. À l&#39;aide de la flamme, la courbe de la pointe de la pipette de petit calibre. Cela aidera à la manipulation des fibres simples. Flamme à stériliser. Enrober chaque pipette avec HS avant utilisation. </li></ol> 2. Dissection des muscles et la digestion <ol><li> Aux fins de ces expériences, âgées de 8 semaines SV129, Pax7 creer CKLR; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) et Myf5-Cre; Rosa26YFP ont été utilisés. </li><li> Vaporiser membres postérieurs avec de l&#39;éthanol à 70%. Pin de l&#39;animal (le visage) pour une plaque de support pour avoir une meilleure idée de la patte arrière au cours de la procédure. </li><li> À l&#39;aide de ciseaux, couper à travers toute la longueur de la branche et exposer le muscle sous-jacent. Retirez la peau ainsi que les cheveux ou la fourrure (figure 1A). </li><li> Avec une paire de ciseaux fins, couper à travers l&#39;aponévrose mince sans endommager les muscles sous-jacents. Visuellement localiser l&#39;EDL. L&#39;EDL se trouve dans la loge antérieure de la patte arrière juste en dessous du muscle tibial antérieur (TA) du muscle. </li><li> Avec l&#39;aide de deux pinces, exposer les tendons distaux. </li><li> Couper les tendons distaux (à la fois de la TA et EDL) avec de fortes ciseaux à ressort Cohann-Vannas. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;une pince tenir à la fois l&#39;assistance technique et les muscles EDL par leurs tendons et les muscles tirez délicatement jusqu&#39;à vers l&#39;extrémité proximale. À ce stade, vous devriez être en mesure de voir clairementle muscle EDL juste en dessous du muscle TA. Maintenant, séparez les EDL dans le muscle TA en tirant les deux tendons dans des directions opposées (figure 1B). Évitez d&#39;étirer le muscle EDL lors de cette opération car cela pourrait endommager les fibres musculaires. </li><li> Exposer le tendon EDL. Pour mieux visualiser le tendon proximal il peut être utile à ce stade d&#39;enlever le muscle TA. Il peut également aider à couper un peu de tissu conjonctif autour du genou (figure 1C). </li><li> Couper le tendon proximal et retirez délicatement l&#39;EDL (figure 1D). </li><li> En maintenant le muscle par ses tendons, de le transférer à 2 ml de solution de collagénase préalablement préparé. Incuber à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Remarque: pour l&#39;isolation en fibre de succès, il est important d&#39;isoler l&#39;EDL à partir de tendon au tendon afin que l&#39;intégrité myofibrille est maintenue. Étapes de 2,3 à 2,9 peut être réalisée sous un microscope à dissection. Alternativement, l&#39;utilisation d&#39;un magnification verre peut également aider à avoir une meilleure vue sur les muscles. </li><li> Répétez les étapes 2,3 à 2,9 pour isoler l&#39;EDL seconde. Transfert de l&#39;EDL deuxième dans le même tube. Pour éviter la digestion inégale, l&#39;isolement de l&#39;EDL seconde devrait être terminé au plus 5 minutes après le premier. Note 1: temps d&#39;incubation peut être nécessaire d&#39;ajuster en fonction de l&#39;activité de la collagénase. D&#39;incubation plus ou moins long peut être nécessaire en fonction de la taille, l&#39;âge et / ou la fonction musculaire (par exemple, les muscles ont besoin de temps fibrotiques plus digestion). Note 2: Si l&#39;examen par satellite comportement des cellules dans des conditions de quiescence, l&#39;agitation pendant le temps de digestion musculaire peut activer les cellules satellites 10. </li><li> Pendant le temps de la digestion, de vérifier régulièrement le muscle pour éviter de digestion. Arrêtez la digestion lorsque les muscles commencent à se détendre et fibres musculaires sont visibles. Pour arrêter la digestion, transférez les deux muscles dans un plat préchauffé Petri avec 4 ml de DMEM (dissociatisur le plat). Utiliser la pipette taille de gros calibre pour effectuer cette opération. Remarque: éviter de digestion excessive du muscle car cela entraîne inévitablement l&#39;isolement des fibres musculaires contractées hyper. </li></ol> 3. Seule fibre musculaire de dissociation et de la Culture <ol><li> Pour libérer myofibrilles, utilisez la pipette en verre de grand diamètre pour rincer le muscle avec un milieu chaud jusqu&#39;à ce que les fibres naturellement commencent à être libéré. Ne pas triturer le muscle car cela entraînera inévitablement des fibres nuisibles. Effectuer cette opération et les étapes suivantes sous un microscope à dissection. </li><li> Continuer jusqu&#39;à ce que la libération myofibres le nombre désiré est atteint. Si la capsule est tenue à la température ambiante pendant plus de 10 min permettre un min 5 (minimum) d&#39;incubation à 37 ° C, 5% CO 2 à rééquilibrer le milieu. Remarque: si le fluide atteint des températures inférieures physiologique (37 ° C) pendant une période prolongée fibres musculaires mourront. </li><li> En utilisant la taille de petit calibre pipette, transfer vivent fibres musculaires simples à un nouveau plat préchauffé (premier des trois lavages consécutifs). Tenez chaque myofibrille individuellement au lieu de transférer en vrac des fibres musculaires à la fois. Si nécessaire, incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 10-15 min à rééquilibrer le milieu. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.3 pour 2 ou plusieurs fois jusqu&#39;à ce que toutes les fibres musculaires mortes et les débris sont enlevés. Nous recommandons au moins trois lavages consécutifs pour bon nettoyage. Remarque: myofibres morts apparaissent le plus court et hyper contracté sous la lumière du microscope. </li><li> Incuber fibres musculaires simples à 37 ° C, 5% CO 2 dans le plat dernier lavage (DMEM uniquement) pendant au moins une heure avant de passer au milieu de culture. Ceci permet de s&#39;adapter aux fibres musculaires les conditions in vitro en l&#39;absence de sérum. Nous avons constaté que la culture immédiate des fibres musculaires dans un milieu riche sérique augmente rétrécissement de la fibre. </li><li> Après une heure, le transfert fibres musculaires à un nouveau plat préchauffé ou au format de culture appropriéen fonction de la demande en aval. Fibres Culture en milieu sérique élevé pour permettre l&#39;activation des cellules satellites. En variante, différentes concentrations de sérum ou d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet peuvent également être utilisés. Changer le milieu tous les deux jours. </li></ol> 4. Applications en aval <ol><li> Immunomarquage. Myofibres Live peuvent être fixées et colorées à aucun moment au cours de l&#39;isolement. Immunofluorescence peut être effectuée à la fois sur myofibres flottantes et le substrat attenante. Si la coloration fibres musculaires flottants, utiliser une pipette en verre de petit diamètre pour transférer des fibres musculaires d&#39;une solution à l&#39;autre. Alternativement, il est possible de garder fibres musculaires dans le même puits pendant toute la procédure et ajouter / supprimer des solutions à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. Éviter l&#39;aspiration standard comme cela se traduira par la suppression des fibres musculaires ainsi. En bref, supprimer complètement milieu de culture; myofibres fixes dans du paraformaldéhyde à 4% préchauffé (PFA) pendant 5 min. Largement laver à plusieurs reprises PBS. Incubationmyofibres te de 1% de glycine dans du PBS ou d&#39;autres solutions de trempe classiques pour minimiser la coloration de fond PFA. Si nécessaire, perméabiliser myofibrilles avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min suivi d&#39;un lavage de 5 min dans du PBS. Incuber fibres dans une solution de blocage (10% de sérum de cheval, 0,1% de Triton X-100 à 1% NaN) pendant 1 heure à la température ambiante ou de préférence une nuit à 4 ° C. D&#39;autres solutions de blocage peuvent être utilisés, en fonction de l&#39;anticorps d&#39;intérêt. Laver une fois dans du PBS pendant 5 min. Incuber avec l&#39;anticorps approprié primaire dilué dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Laver fibres 3 fois à 5 min par lavage dans du PBS pour éliminer tout anticorps non lié. Incuber avec l&#39;anticorps secondaire approprié pendant 45 min à 1 h à température ambiante. Laver 3 fois à 5 min par lavage dans du PBS. Contre les noyaux avec 1 mg / ml DAPI. Si la coloration des fibres flottantes, transférer chaque fibre à une lame de verre convenable pour la microscopie. Enlevez l&#39;excès de PBS ou moyen terme. Appliquer de montage medieuh, puis ajouter la lamelle. Procédez de visualiser myofibres sous un microscope à fluorescence. Voir la figure 4 pour immunofluorescence représentant myofibres EDL. Procédures de coloration alternatives utilisant fortes fixateurs sont décrits dans Verma, M. et al. 11 et Wosniak, AC et al. 12. </li><li> Oligonucléotide ou un plasmide transfection transitoire. Myofibres Live peuvent être transfectées avec le siRNA plasmide ou gène spécifique / s d&#39;intérêt. Lors de l&#39;utilisation de siRNA, transfection double est recommandée pour les inactivation génique efficace. Nous vous suggérons de réaliser la transfection première fois après 8 heures de l&#39;isolement. Six heures après la transfection, remplacez-le par du milieu frais. Pour transfection de siRNA, nous vous suggérons de départ en utilisant une concentration finale de 50 nM. Knockdown l&#39;expression des gènes peut être analysé par extraction de l&#39;ARN ou de préférence par immunomarquage. </li><li> L&#39;infection virale. Infection des fibres musculaires vivantes est possible, bien que l&#39;incidence de la cellulela mort est plus élevée qu&#39;avec la transfection oligo et l&#39;efficacité d&#39;infection peut être variable en fonction des conditions de muscle et de l&#39;âge. Par exemple, intactes myofibrilles musculaires adultes sont particulièrement sensibles non à une infection virale due à la présence de la lame basale qui a été montré pour fournir une barrière protectrice contre l&#39;infection hôte 13, 14. Les vecteurs lentiviraux sont préférables aux vecteurs rétroviraux car ils peuvent infecter des cellules quiescentes (non mitotique). En cas d&#39;infection virale, il est conseillé de fibres culture sur un plat recouvert de Matrigel ou une plaque et laisser myofibres s&#39;adapter aux conditions médias pour les 24 premières heures. </li><li> Vivez l&#39;imagerie. Vivez l&#39;imagerie des fibres musculaires est particulièrement fastidieux et nécessite un microscope équipé d&#39;un 37 ° C, 5% CO 2 chambre. Il est utile pour évaluer le comportement des cellules satellites uniques. Les travaux effectués à l&#39;aide de cette technique a été déterminant pour la découverte de l&#39;hétérogénéité des cellules satellites et d&#39;étudier leur comporVior sur les fibres (15 et 16). </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts.

L&#39;isolement et la culture des fibres musculaires simples de muscles intacts fournit un excellent modèle in vitro pour étudier le processus de régénération musculaire. Une caractéristique unique de ce système est la préservation des cellules satellites dans leur environnement physiologique sous la lame basale. Plus important encore, cette technique peut être utilisée pour étudier le comportement des cellules souches musculaires à la fois repos et les états activés. Au cours des 20 dernières années, le système de culture myofibres a fourni des indications utiles sur la biologie de la population des cellules satellites par rapport aux deux déterminants intrinsèques et extrinsèques. Par myofibres individuels culture, l&#39;hétérogénéité des cellules satellites par rapport aux fibres musculaires de type musculaire ou potentiel de régénération a été adressée 15. Elaborer des études utilisant l&#39;imagerie en direct de simples fibres cultivées ont permis de gagner des informations sur la migration cellulaire par satellite modèle 16. L&#39;acquisition de données quantitatives est unlso possible. Bien que beaucoup de temps, il fournit des informations importantes sur la distribution et la survenance d&#39;événements spécifiques (cellules souches rapport de division asymétrique, la prolifération et la différenciation, etc.) Ainsi que les applications décrites précédemment, les protéines ou l&#39;extraction d&#39;ARN à partir de fibres individuelles est également possible, bien que l&#39;isolement de la population pure de cellules satellites par FACS ou par d&#39;autres moyens peuvent fournir une meilleure plate-forme pour étudier les changements d&#39;expression des protéines ou des gènes au niveau moléculaire. Dans notre expérience, l&#39;étape la plus critique pour l&#39;isolation en fibre de succès est le &quot;tendon tendon&quot; isolement (étapes 2,5 à 2,9 dans le texte du protocole). Cela garantit que, après la digestion du muscle, les fibres sont libérées de l&#39;EDL avec des dommages minimaux ou pas ce qui accroît leurs performances dans les étapes suivantes.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif / Matériel </td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Préparer frais tout temps pour des résultats optimaux. Aliquotes supplémentaires de la collagénase non dilué peut être conservé à -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM + glycémie élevée NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Ajout de Pen / Strep est nécessaire de minimiser les contaminations aériennes </td></tr><tr><td> Caractérisé sérum de veau fœtal </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Extrait d&#39;embryon de poulet </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, lot B7035010 </td><td> Évitez de congélation-décongélation cycles. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Boutique aliquotes à -20 ° C. Évitez de congélation-décongélation cycles. Stocker des aliquotes diluées à 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas ciseaux printemps 6mm Lames-Straight-Sharp </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Extra-Mince Iris Ciseaux-10.5cm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris Pince courbé </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamant Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm boîte de Pétri </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre de 0,22 um Acrodisc </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Une source lumineuse supplémentaire peut être nécessaire d&#39;avoir une vue de mieux se concentrer </td></tr></tbody></table>

isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

La régénération musculaire chez l&#39;adulte est effectué par des cellules souches résidentes appelées cellules satellites. Les cellules satellites sont définis par leur position entre la lame basale et le sarcolemme de chaque myofibrille. Les connaissances actuelles sur leur comportement repose en grande partie sur l&#39;utilisation du protocole d&#39;isolement fibre musculaire unique. En 1985, Bischoff décrit un protocole pour isoler simples fibres en direct de la Brevis fléchisseur des orteils (FDB) de rats adultes dans le but de créer un système in vitro dans lequel l&#39;association physique entre les fibres musculaires et de ses cellules souches sont conservées 1. En 1995, le protocole Rosenblattmodified Bischoff telles que les fibres musculaires sont pris séparément et traités séparément après digestion par la collagénase au lieu d&#39;être isolé par 2 sédimentation par gravité, 3. Le Rosenblatt ou Bischoff protocole a depuis été adapté à différents muscles, l&#39;âge ou les conditions 3-6. La technique myofibres isolation simple est un élément indispensableoutil en raison de ses avantages uniques. Tout d&#39;abord, dans le seul protocole fibre musculaire, les cellules satellites sont maintenus sous la lame basale. Il s&#39;agit d&#39;une caractéristique unique du protocole que d&#39;autres techniques telles que le tri cellulaire activé par fluorescence nécessitent chimiques et des tissus dissociation mécanique 7. Bien que le système de culture myofibres peut pas se substituer à des études in vivo, elle offre une excellente plate-forme pour aborder certaines propriétés biologiques des cellules souches musculaires. Myofibres simples peuvent être cultivées dans des conditions de placage standard ou dans des conditions variables. Les cellules satellites sur fibres musculaires flottants sont soumis à pratiquement aucune influence autre que l&#39;environnement myofibrille. Rigidité substrat et le revêtement ont été montré pour influer sur la capacité des cellules satellites des muscles à se régénérer 8, 9 afin d&#39;être en mesure de contrôler chacun de ces facteurs permet indépendamment discrimination entre les créneaux dépendantes et indépendantes de réponses. Différentes concentrations de sérum ontégalement été montré pour avoir un effet sur la transition de repos à l&#39;activation. Afin de préserver l&#39;état de quiescence des cellules satellites ses associés, les fibres doivent être conservés dans un milieu sérique bas 1-3. Ceci est particulièrement utile lors de l&#39;étude des gènes impliqués dans l&#39;état de quiescence. En milieu riche sérum, les cellules satellites activer rapidement, proliférer, migrer et de se différencier, imitant ainsi le processus de régénération in vivo 1-3. Le système peut être utilisé pour effectuer une variété de tests tels que le test d&#39;inhibiteurs chimiques; l&#39;expression ectopique de gènes par le virus de la livraison; oligonucléotide fondée sur les gènes knock-down ou imagerie en temps réel. Cet article décrit le protocole vidéo actuellement utilisée dans notre laboratoire pour isoler les fibres musculaires simples de l&#39;extenseur commun des orteils (EDL) du muscle de souris adultes (6-8 semaines).

Ici, nous avons décrit l&#39;isolement des fibres musculaires individuelles du muscle EDL de souris adultes. Myofibres succès rendement dépendent de plusieurs facteurs, tels que l&#39;activité de la collagénase ou affections musculaires ou de l&#39;âge. Plus important encore, l&#39;isolement du muscle du tendon tendon résultats en longues fibres musculaires intactes de muscle EDL. Figure 1 montre étape par étape la représentation graphique du &quot;tendon tendon&quot; isolement. Une fois que le muscle est complètement digéré, myofibrilles sont libérés en appliquant une légère pression sur le muscle. Figure 2A montre une image représentative d&#39;une expérience d&#39;isolement fibres musculaires après le premier lavage. A ce stade, la culture contient un mélange de faisceaux de fibres musculaires simples qui apparaissent comme de longues et brillantes structures tubulaires, hyper contracté fibres musculaires qui sont sombres et courts et les débris du processus de digestion. À la fin d&#39;au moins trois lavages consécutifs, seuls célibataires myofibres vivants doit rester dans le dish pour la culture ou l&#39;analyse en aval (figure 2B). Figure 2C montre une longue fibre active par rapport à une fibre hyper contracté (C &#39;). Au moment de l&#39;isolement, les cellules satellites apparaissent comme des protubérances minuscules sur la surface myofibres (figure 3A). Si maintenues dans un milieu riche en sérum, les cellules satellites activer, proliférer, migrer et finalement fusionner en myotubes (B). Après 15 jours de culture, les myotubes exprimer la Myf5 journaliste (C) YFP ce qui suggère que la régénération musculaire chez l&#39;adulte est effectuée par des cellules qui à un moment donné au cours de leur développement avaient exprimé le facteur déterminant myogénique Myf5. Toutes les cellules satellites expriment le facteur de transcription paired box Pax7 17. La lignée de souris journaliste Pax7Cre-TdTomato peut être utilisé pour tracer les cellules satellites par l&#39;intermédiaire de l&#39;expression de la TdTomato signal fluorescent (figures 3D et E). Figure 4 montre une immu représentantnofluorescence de double Pax7 + / cellules satellites Myod. Classiquement deux Pax7 + / + Myod cellules satellites sont considérés prolifération des progéniteurs musculaires engagés qui soit complètent le programme de différenciation par le bas tout en maintenant la régulation Pax7 expression Myod ou de retour à la quiétude par régulation négative Myod et le maintien expression de Pax7 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Isolement muscle EDL de la souris membres postérieurs. Un des membres postérieurs. D&#39;une souris adulte âgé 8 semaines. Les flèches indiquent la partie distale (genou) et le tendon proximal (pied) tendon. B. Position anatomique de la tibial antérieur (TA) et le muscle extenseur commun des orteils (EDL) du muscle. C. En maintenant l&#39;EDL à travers le tendon proximal, le muscle est tiré vers le genou pour exposer le tendon distal. D. Le tendon distal estcouper et l&#39;EDL est libéré. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Les résultats représentatifs d&#39;une expérience d&#39;isolement fibre musculaire unique. Une image. Fond clair d&#39;une expérience d&#39;isolement fibres musculaires à la première étape de lavage. La flèche rouge indique myofibres en direct, flèche blanche indique hyper fibres musculaires contractées et flèche jaune indique les cellules, fibres musculaires ou des débris ECM. B. Après lavages successifs dans du DMEM, seuls restent vivants myofibres. C et C &#39;. L&#39;image représente une longue intact direct myofibrille (C) et une hyper court contracté myofibrille (C &#39;). Bar 10 um. Les photos ont été prises avec un microscope Zeiss Axio Observer Z1 équipé AxioCam RH. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figur<html> e 3. Les résultats représentatifs d&#39;une expérience de culture myofibres unique. Une image. Fond clair d&#39;une seule fibre musculaire en direct avec sa cellule satellite associé (flèche) juste après l&#39;isolement (temps 0). B. Myofibres simples ont été étalées sur Matrigel et cultivées dans un milieu riche en sérum pendant 15 jours. Flèche blanche indique myotubes différenciés par rapport aux cellules simples (flèche jaune) C. Myofibres individuelle à partir d&#39;une Myf5Cre; RosaYFP souris ont été cultivées comme dans B. La flèche indique Myf5 myotubes dérivés. D et E. Myofibres individuelle à partir Pax7Cre; TdTomato ont été isolés et fixé tout de suite après. Les flèches indiquent les cellules positives Pax7 satellite repos (E, rouge). Les noyaux ont été contre-colorées avec du DAPI (D). Bar: 50 pm. Les photos ont été prises avec un microscope Zeiss Axio Observer Z1 équipé AxioCam RH. moyens &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Exemple de marquage en immunofluorescence sur des cellules satellites fibres musculaires. Myofibres uniques ont été isolées et cultivées pendant 72 heures dans des conditions variables. Les cellules satellites sur myofibrilles ont été colorées pour le satellite Pax7 cellule marqueur spécifique (B, rouge) et le Myod facteur myogénique la réglementation (C, vert). Les noyaux ont été contre-colorées avec du DAPI (A). Bars: 50 pm. Les photos ont été prises avec un microscope Zeiss Axio Observer Z1 équipé AxioCam RH. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Dissection des muscles (5 min chaque muscle) </td><td><ul><li> Tendon tendon à l&#39;isolement </li><li> Outils tranchants </li><li> Lésion musculaire minime </li></ul></td></tr><tr><td> Digestion musculaire (30-45 min) </td><td><ul><li> Températuresensible </li><li> Évitez de digestion excessive </li></ul></td></tr><tr><td> Isolation en fibre </td><td><ul><li> Évitez de trop manipulation des fibres </li><li> Éliminer les débris avec plusieurs lavages </li></ul></td></tr><tr><td> Culture de fibres (jusqu&#39;à 3-4 semaines) </td><td><ul><li> Format: aucune </li><li> Revêtement: sérum de cheval, Matrigel </li><li> Moyen: basale ou sérique élevée </li></ul></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Vue d&#39;ensemble du protocole d&#39;isolement myofibrille. L&#39;protocole d&#39;isolement myofibrille est composée de 4 grandes étapes. Pour chaque étape, le temps approximatif et les principaux points critiques sont discutées. Pour une discussion détaillée de chaque étape, reportez-vous au texte du protocole.

Isolement et culture des fibres musculaires est l&#39;étalon-or<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier la transition des cellules satellites par le repos, l&#39;activation et la différenciation. Surtout, le système de fibres musculaires seule culture préserve l&#39;association cellule myofibres / tige, qui est une composante essentielle de la niche de cellules souches musculaires.

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des fibres vivantes uniques et leurs cellules souches associées à partir du muscle EDL de souris adultes. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’EDL à l’aide d’une procédure de dissection de tendon à tendon qui n’endommage pas les fibres. Ensuite, une digestion musculaire est effectuée pour dégrouper les fibres tout en préservant l’association de cellules souches de myofibres, ce qui est une étape unique à ce protocole.Dans la dernière étape, les myofibres individuelles sont doucement séparées les unes des autres tandis que les débris ou les fibres hyper contractées sont éliminés par des lavages séquentiels. En fin de compte, les myofibres isolées par cette technique peuvent soit être maintenues dans un état semi-reposant avec des stimuli d’activation minimaux, soit être cultivées dans un milieu sérique élevé pour l’étude de l’activation et de la différenciation des cellules satellites. Ces dernières années, l’utilisation de fibres de tourbière cultivées a été une approche très puissante pour étudier l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules satellites dans une niche physiologique pertinente.Cette approche nous a vraiment permis de faire de grands progrès dans la compréhension de la fonction de ces cellules au niveau moléculaire et cellulaire. Pour chaque souris chez laquelle les EDL sont isolés, préparez cinq boîtes de Pétri en plastique de 60 millimètres avec une couche de pipette de sérum de cheval, quatre millimètres de sérum de cheval sur un plat et faites-le tourner pour un enrobage uniforme. Retirez ensuite le sérum de cheval en aspirant tout sérum restant et laissez sécher le plat pendant au moins 30 minutes.Au bout d’une demi-heure, ajoutez quatre millilitres de produit de lavage à quatre plats. Étiquetez la vaisselle comme suit, muscle après digestion, lavez-en un, lavez-en deux et lavez-en trois. Ajoutez quatre millilitres de milieu de culture de fibres dans le plat de culture de fibres restant.Conservez les plats à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone avant utilisation. Ensuite, pour l’isolement d’une fibre, préparez deux pipettes stériles au microscope. Fabriquez une pipette de gros calibre en coupant une pipette de petit calibre avec un stylo diamanté de sorte que l’ouverture soit suffisamment grande pour que tout le muscle puisse être rincé.La deuxième pipette est une pipette de petit calibre pour la manipulation MyFi. Allumez maintenant la flamme des pipettes pour lisser les bords et pour la stérilisation en utilisant la courbe de flamme, la pointe de la pipette de petit calibre. Cela aidera à gérer les fibres uniques pendant l’isolation.Enduisez ensuite les deux pipettes de sérum de cheval. Enfin, assurez-vous de nettoyer la station de microscope et les outils de dissection avec de l’éthanol à 70 %. Pour cette démonstration, des souris transgéniques SV 1 29 âgées de huit semaines.Ont été euthanasiés. Vaporisez les membres postérieurs avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, épinglez l’animal à une planche de support face vers le haut.Ceci est nécessaire pour fournir une meilleure compréhension des membres postérieurs. Ensuite, coupez toute la longueur du membre et exposez le muscle sous-jacent. Retirez la peau ainsi que les poils ou la fourrure.À l’aide de ciseaux fins, coupez le mince fascia qui entoure le muscle sans endommager les tissus sous-jacents. Exposez les tendons distaux TA et EDL à l’aide de Vana cohan pointu. Ciseaux à ressort.Coupez les tendons distaux EDL et TA. Ensuite, à l’aide d’une pince, tenez les muscles TA et EDL par leurs tendons et tirez délicatement les muscles vers le haut vers l’extrémité proximale. À ce stade, vous devriez être en mesure de voir clairement le muscle EDL juste en dessous du muscle TA.Séparez maintenant l’EDL du muscle TA en tirant les deux tendons dans des directions opposées. Évitez d’étirer le muscle EDL pendant que vous effectuez cette opération. Comme cela endommagerait les fibres myo.Exposez le tendon EDL. À ce stade, il peut être utile d’enlever le muscle TA pour mieux visualiser le tendon proximal. Il peut également être utile de couper une partie du tissu conjonctif autour du genou.Une fois que le tendon est clairement visible, utilisez des ciseaux à ressort cohan pointus pour libérer le muscle EDL. Si la procédure a été effectuée correctement, si EDL devrait être capable de maintenir sa forme allongée, une fois retiré du membre, en maintenant le muscle EDL à travers ses tendons, transférez-le dans une solution préchauffée de collagénase de deux millilitres et incubez dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Répétez le processus pour isoler le deuxième EDL et le transférer dans le même tube de collagénase pour une digestion inégale.L’isolement du deuxième PC Plus doit être terminé dans les cinq minutes suivant l’isolement. Le premier temps d’incubation EDL peut devoir être ajusté en fonction de l’activité collagène, de la taille des muscles, de l’âge de l’animal ou de l’état musculaire. Par exemple, un muscle avec beaucoup de tissu fibreux peut nécessiter un temps d’incubation plus long.Notez également qu’il a été démontré que l’agitation pendant cette période active les cellules S Pendant le temps de digestion, vérifiez régulièrement le muscle pour éviter une digestion excessive. Arrêtez la digestion lorsque les muscles commencent à se détendre et que les myofibres deviennent visibles. À l’aide de la pipette de gros calibre, transférez soigneusement les deux muscles dans une boîte de Pétri préchauffée.Avec quatre millilitres de produit de lavage, la surdigestion doit être évitée car elle entraîne des fibres myo hyper contractées. Pour libérer les fibres myo, utilisez la pipette à verres de grand calibre pour rincer le muscle avec un milieu chaud jusqu’à ce que les fibres commencent naturellement à être libérées. Ne tritrate pas le muscle car cela entraînera inévitablement des fibres dommageables.Continuez à libérer les fibres myo jusqu’à ce que le nombre souhaité soit atteint. Ne laissez pas le plat à température ambiante pendant plus de 10 minutes. Remettez-le dans l’incubateur pendant cinq minutes pour le rééquilibrer avant de travailler plus longtemps avec.La culture contient actuellement un mélange de myofibres simples vivantes, qui sont des structures tubulaires longues et brillantes, de fibres hyper contractées, qui sont sombres et courtes et de débris. Maintenant, à l’aide de la pipette de petite taille, transférez les fibres MYOP simples vivantes dans une nouvelle boîte pré-vermifugée. Manipulez chaque fibre myop individuellement.Au lieu de transférer la majeure partie des myofibres d’un seul coup, si nécessaire, remettez la boîte dans un incubateur pendant 10 à 15 minutes pour rééquilibrer le milieu. Transférez les fibres myop simples deux fois de plus pour éliminer toutes les fibres myo mortes et les débris à la fin d’au moins trois lavages consécutifs. Seules les fibres myo vivantes doivent rester dans la boîte pour la culture ou l’analyse en aval.Les fibres vivantes ont une morphologie longue. Au contraire, les fibres hyper contractées sont plus courtes et plus épaisses. Maintenant, incubez les myofibres isolées dans un milieu de lavage pendant au moins une heure avant de passer au milieu de culture.Dans une nouvelle parabole, un milieu élevé permettra l’activation des cellules satellites pour les cultures longues. Le matrigel pourrait convenir quel que soit le support choisi. Changez-le tous les deux jours au moment de l’isolement.Les cellules satellites de chaque MyFi apparaissent comme de minuscules protubérances à la surface des myofibres lorsqu’elles sont observées au microscope optique. Si les myofibres sont maintenues dans un milieu riche en sérum pendant de longues périodes, des myotubes entièrement différenciés sont principalement observés dans la culture. Les souches de souris rapporteures telles que la gamme MIFF cinq Cree Rosa YFP sont des outils optimaux pour étudier le processus de régénération musculaire.Les tubes Myo dérivés d’une culture de fibres Miff five Cree Rosa YFP exprimaient le MIFF five reporter YFP. Cela suggère que la régénération musculaire nécessite l’activation de Miff cinq. La souche de souris tomate PAX seven Cree TD est une autre lignée de journalistes.Le signal de fluorescence de la tomate TD n’est détecté que par les cellules satellites, tandis que les noyaux myON sont clairement négatifs. Cela suggère que le facteur de transcription PAX seven est exprimé uniquement par les cellules souches musculaires et non par leur descendance différenciée. Les fibres myo et leurs cellules satellites associées peuvent être fixées pour l’aval.Les cellules satellites positives myo D sont classiquement considérées comme des progéniteurs musculaires engagés prolifératifs. Ils compléteront soit le programme de différenciation en régulant à la baisse PAC sept tout en maintenant mon expression OD, soit retourneront au repos en régulant négativement mon OD et en maintenant l’expression de PAC sept. La technique d’isolement d’une seule fibre a la particularité unique de préserver l’association physiologique des cellules satellites de myofibres.L’étape la plus critique de cette procédure est la dissection du muscle EDL de tendon à tendon. Une manipulation minimale de la fibre permet également de préserver l’intégrité et la viabilité de la fibre. L’isolement réussi des fibres myopes uniques dépend de plusieurs facteurs tels que l’activité collagène, l’état musculaire ou l’âge.Plus important encore, l’isolation du muscle d’un tendon à l’autre permet de maintenir l’intégrité des fibres. De plus, une manipulation minimale des fibres tout au long de la procédure permet un taux de survie plus élevé.

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