Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des fibres vivantes uniques et leurs cellules souches associées à partir du muscle EDL de souris adultes. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’EDL à l’aide d’une procédure de dissection de tendon à tendon qui n’endommage pas les fibres. Ensuite, une digestion musculaire est effectuée pour dégrouper les fibres tout en préservant l’association de cellules souches de myofibres, ce qui est une étape unique à ce protocole.

Dans la dernière étape, les myofibres individuelles sont doucement séparées les unes des autres tandis que les débris ou les fibres hyper contractées sont éliminés par des lavages séquentiels. En fin de compte, les myofibres isolées par cette technique peuvent soit être maintenues dans un état semi-reposant avec des stimuli d’activation minimaux, soit être cultivées dans un milieu sérique élevé pour l’étude de l’activation et de la différenciation des cellules satellites. Ces dernières années, l’utilisation de fibres de tourbière cultivées a été une approche très puissante pour étudier l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules satellites dans une niche physiologique pertinente.

Cette approche nous a vraiment permis de faire de grands progrès dans la compréhension de la fonction de ces cellules au niveau moléculaire et cellulaire. Pour chaque souris chez laquelle les EDL sont isolés, préparez cinq boîtes de Pétri en plastique de 60 millimètres avec une couche de pipette de sérum de cheval, quatre millimètres de sérum de cheval sur un plat et faites-le tourner pour un enrobage uniforme. Retirez ensuite le sérum de cheval en aspirant tout sérum restant et laissez sécher le plat pendant au moins 30 minutes.

Au bout d’une demi-heure, ajoutez quatre millilitres de produit de lavage à quatre plats. Étiquetez la vaisselle comme suit, muscle après digestion, lavez-en un, lavez-en deux et lavez-en trois. Ajoutez quatre millilitres de milieu de culture de fibres dans le plat de culture de fibres restant.

Conservez les plats à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone avant utilisation. Ensuite, pour l’isolement d’une fibre, préparez deux pipettes stériles au microscope. Fabriquez une pipette de gros calibre en coupant une pipette de petit calibre avec un stylo diamanté de sorte que l’ouverture soit suffisamment grande pour que tout le muscle puisse être rincé.

La deuxième pipette est une pipette de petit calibre pour la manipulation MyFi. Allumez maintenant la flamme des pipettes pour lisser les bords et pour la stérilisation en utilisant la courbe de flamme, la pointe de la pipette de petit calibre. Cela aidera à gérer les fibres uniques pendant l’isolation.

Enduisez ensuite les deux pipettes de sérum de cheval. Enfin, assurez-vous de nettoyer la station de microscope et les outils de dissection avec de l’éthanol à 70 %. Pour cette démonstration, des souris transgéniques SV 1 29 âgées de huit semaines.

Ont été euthanasiés. Vaporisez les membres postérieurs avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, épinglez l’animal à une planche de support face vers le haut.

Ceci est nécessaire pour fournir une meilleure compréhension des membres postérieurs. Ensuite, coupez toute la longueur du membre et exposez le muscle sous-jacent. Retirez la peau ainsi que les poils ou la fourrure.

À l’aide de ciseaux fins, coupez le mince fascia qui entoure le muscle sans endommager les tissus sous-jacents. Exposez les tendons distaux TA et EDL à l’aide de Vana cohan pointu. Ciseaux à ressort.

Coupez les tendons distaux EDL et TA. Ensuite, à l’aide d’une pince, tenez les muscles TA et EDL par leurs tendons et tirez délicatement les muscles vers le haut vers l’extrémité proximale. À ce stade, vous devriez être en mesure de voir clairement le muscle EDL juste en dessous du muscle TA.

Séparez maintenant l’EDL du muscle TA en tirant les deux tendons dans des directions opposées. Évitez d’étirer le muscle EDL pendant que vous effectuez cette opération. Comme cela endommagerait les fibres myo.

Exposez le tendon EDL. À ce stade, il peut être utile d’enlever le muscle TA pour mieux visualiser le tendon proximal. Il peut également être utile de couper une partie du tissu conjonctif autour du genou.

Une fois que le tendon est clairement visible, utilisez des ciseaux à ressort cohan pointus pour libérer le muscle EDL. Si la procédure a été effectuée correctement, si EDL devrait être capable de maintenir sa forme allongée, une fois retiré du membre, en maintenant le muscle EDL à travers ses tendons, transférez-le dans une solution préchauffée de collagénase de deux millilitres et incubez dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Répétez le processus pour isoler le deuxième EDL et le transférer dans le même tube de collagénase pour une digestion inégale.

L’isolement du deuxième PC Plus doit être terminé dans les cinq minutes suivant l’isolement. Le premier temps d’incubation EDL peut devoir être ajusté en fonction de l’activité collagène, de la taille des muscles, de l’âge de l’animal ou de l’état musculaire. Par exemple, un muscle avec beaucoup de tissu fibreux peut nécessiter un temps d’incubation plus long.

Notez également qu’il a été démontré que l’agitation pendant cette période active les cellules S Pendant le temps de digestion, vérifiez régulièrement le muscle pour éviter une digestion excessive. Arrêtez la digestion lorsque les muscles commencent à se détendre et que les myofibres deviennent visibles. À l’aide de la pipette de gros calibre, transférez soigneusement les deux muscles dans une boîte de Pétri préchauffée.

Avec quatre millilitres de produit de lavage, la surdigestion doit être évitée car elle entraîne des fibres myo hyper contractées. Pour libérer les fibres myo, utilisez la pipette à verres de grand calibre pour rincer le muscle avec un milieu chaud jusqu’à ce que les fibres commencent naturellement à être libérées. Ne tritrate pas le muscle car cela entraînera inévitablement des fibres dommageables.

Continuez à libérer les fibres myo jusqu’à ce que le nombre souhaité soit atteint. Ne laissez pas le plat à température ambiante pendant plus de 10 minutes. Remettez-le dans l’incubateur pendant cinq minutes pour le rééquilibrer avant de travailler plus longtemps avec.

La culture contient actuellement un mélange de myofibres simples vivantes, qui sont des structures tubulaires longues et brillantes, de fibres hyper contractées, qui sont sombres et courtes et de débris. Maintenant, à l’aide de la pipette de petite taille, transférez les fibres MYOP simples vivantes dans une nouvelle boîte pré-vermifugée. Manipulez chaque fibre myop individuellement.

Au lieu de transférer la majeure partie des myofibres d’un seul coup, si nécessaire, remettez la boîte dans un incubateur pendant 10 à 15 minutes pour rééquilibrer le milieu. Transférez les fibres myop simples deux fois de plus pour éliminer toutes les fibres myo mortes et les débris à la fin d’au moins trois lavages consécutifs. Seules les fibres myo vivantes doivent rester dans la boîte pour la culture ou l’analyse en aval.

Les fibres vivantes ont une morphologie longue. Au contraire, les fibres hyper contractées sont plus courtes et plus épaisses. Maintenant, incubez les myofibres isolées dans un milieu de lavage pendant au moins une heure avant de passer au milieu de culture.

Dans une nouvelle parabole, un milieu élevé permettra l’activation des cellules satellites pour les cultures longues. Le matrigel pourrait convenir quel que soit le support choisi. Changez-le tous les deux jours au moment de l’isolement.

Les cellules satellites de chaque MyFi apparaissent comme de minuscules protubérances à la surface des myofibres lorsqu’elles sont observées au microscope optique. Si les myofibres sont maintenues dans un milieu riche en sérum pendant de longues périodes, des myotubes entièrement différenciés sont principalement observés dans la culture. Les souches de souris rapporteures telles que la gamme MIFF cinq Cree Rosa YFP sont des outils optimaux pour étudier le processus de régénération musculaire.

Les tubes Myo dérivés d’une culture de fibres Miff five Cree Rosa YFP exprimaient le MIFF five reporter YFP. Cela suggère que la régénération musculaire nécessite l’activation de Miff cinq. La souche de souris tomate PAX seven Cree TD est une autre lignée de journalistes.

Le signal de fluorescence de la tomate TD n’est détecté que par les cellules satellites, tandis que les noyaux myON sont clairement négatifs. Cela suggère que le facteur de transcription PAX seven est exprimé uniquement par les cellules souches musculaires et non par leur descendance différenciée. Les fibres myo et leurs cellules satellites associées peuvent être fixées pour l’aval.

Les cellules satellites positives myo D sont classiquement considérées comme des progéniteurs musculaires engagés prolifératifs. Ils compléteront soit le programme de différenciation en régulant à la baisse PAC sept tout en maintenant mon expression OD, soit retourneront au repos en régulant négativement mon OD et en maintenant l’expression de PAC sept. La technique d’isolement d’une seule fibre a la particularité unique de préserver l’association physiologique des cellules satellites de myofibres.

L’étape la plus critique de cette procédure est la dissection du muscle EDL de tendon à tendon. Une manipulation minimale de la fibre permet également de préserver l’intégrité et la viabilité de la fibre. L’isolement réussi des fibres myopes uniques dépend de plusieurs facteurs tels que l’activité collagène, l’état musculaire ou l’âge.

Plus important encore, l’isolation du muscle d’un tendon à l’autre permet de maintenir l’intégrité des fibres. De plus, une manipulation minimale des fibres tout au long de la procédure permet un taux de survie plus élevé.