Name: Lanalyse de laccessibilité au solvant des résidus de cystéine sur Cueilleur rayado fino virus Virus-like particles produits dans Nicotiana benthamiana Plantes et réticulation des peptides à VLP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez l'analyse de l'accessibilité des cystéines sur les particules pseudo-virales du virus Maize rayado fino produites dans Nicotiana benthamiana. Cette méthode permet la réticulation de peptides pour des applications en nanotechnologie.

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1. Inoculation et purification de virus VLP de plantes de Nicotiana benthamiana <ol><li> Produire plafonnées T7-ARN transcrits à partir de pommes de terre du virus X (PVX) à base de plasmides vecteurs transportant MRFV de type sauvage (wt) et protéine d&#39;enveloppe Cys-muté (CP) des gènes 12, en utilisant Ambion de T7-mMessage mMachine Kit. </li><li> Pour chaque réaction transcription T7, inoculer deux feuilles complètement développées de N. benthamiana avec 10 pi de réactions et incuber les plantes pendant 10 jours en serre à 60% d&#39;humidité pendant 16 heures avec de la lumière (25.000-30.000 lux) à 25 ° C et 8 h obscurité à 20 ° C. </li><li> Harves t N. benthamiana infectées par le virus laisse 10 jours après l&#39;inoculation (dpi), peser le tissu végétal (50 grammes) et le placer sur la glace. </li><li> Homogénéiser la matière végétale dans un malaxeur en présence de 100 ml d&#39;une solution glacée de 0,5 M Na-citrate, pH 5,5 (utilisation 2 ml de tampon par gramme de tissu végétal). </li><li> Filtrez homogénat par 3 couches de cheeseclOTH et de clarifier par centrifugation à 27.000 xg pendant 30 min. Transférer le surnageant dans une éprouvette graduée froide, mesurer le volume, puis transvaser dans un bécher stérile réfrigéré. Jeter le culot. </li><li> Traiter le surnageant par addition de polyéthylène glycol 10% 8.000 (PEG 8.000), sous agitation pendant 15 min à 4 ° C, et incuber pendant encore 45 min à 4 ° C pour précipiter les particules de type virus (VLP)-PEG matrice. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 27.000 xg pendant 20 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. </li><li> Traiter la pastille en ajoutant 8 ml de 0,05 M citrate de Na-tampon, 5,5 contenant 2% de Triton X-100 pH. Swirl tubes à centrifuger le bien de libérer le culot. Transférer le culot et le tampon dans un bécher stérile réfrigéré. Rincer immédiatement les tubes de 2 ml du même tampon et ajouter dans le bécher. Agiter la suspension à 4 ° C jusqu&#39;à ce que les granules sont dissous (en général 1 heure). </li><li> Clarifier par centrifugation pendant 5 min à 27.000 xg, jeter le culot, et processus le surnageant par centrifugation à 140.000 xg pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml 0,05 M Na-citrate, pH 5,5, et de placer la suspension sur un gradient de saccharose 10-40% réalisés dans 0,05 M de Na-citrate, pH 5,5. </li><li> Centrifuger le gradient pendant 3 heures à 140.000 xg à 4 ° C. </li><li> Rayonner une lumière sur le dessus du tube de centrifugation et recueillir la bande de diffusion de lumière supérieure à 4 cm de la partie supérieure du tube, diluer avec 0,05 M Na-citrate, pH 5,5, et centrifuger pendant 3 heures à 140.000 xg à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot dans 0,5 ml d&#39;eau stérile et conserver à 4 ° C pendant un maximum de six mois. </li><li> Quantifier la concentration VLP en effectuant un dosage de protéine de Bradford. Le rendement de VLP est comprise entre 1 et 3 mg / g de tissu végétal. </li></ol> 2. Fluorescéine-5-maléimide-étiquetage Réactions des VLP <ol><li> Préparer une solution de 1 mM de fluorescéine-5-maléimide (427,37 g / mol) dans 50 mM de sodium phosphate tampon, pH 7,0; 1 mM EDTA. Mélanger à l&#39;aide du vortex et vérifier dissolution complète. Protéger le tube de la lumière en utilisant du papier d&#39;aluminium. </li><li> Ajouter fluorescéine-5-maléimide à VLP produites à l&#39;étape 1 et mélanger. Utiliser un excès 25-fois molaire de fluorescéine-5-maléimide de la quantité molaire de groupes sulfhydryle. En règle générale, l&#39;utilisation de VLP 30 pi à la concentration de 1 pg / pl et 60 ul de la solution de fluorescéine-5-maléimide produit des résultats acceptables. </li><li> Incuber la réaction pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Mettre fin à la réaction par addition de dithiothreitol (DTT) à une concentration finale de 50 mM. </li><li> Retirer n&#39;ayant pas réagi fluorescéine en utilisant une colonne spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) et centrifugation pendant 2 min à 1500 xg à température ambiante. </li><li> Pour analyse SDS-PAGE, ajouter 10 ul de 2 x SDS-PAGE tampon échantillon de Laemmli à 10 pl de chaque réaction. Rangez la protéine marquée abri de la lumière à 4 ° C pendant un mois ouà usage unique aliquots à -20 ° C jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> 3. Réaction de marquage et de détermination de constitution biotine <ol><li> Utilisez les colonnes de spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) pour effectuer un échange de tampon de l&#39;eau de tampon phosphate salin (PBS), pH 7,0 des VLP produites à l&#39;étape 1. </li><li> Préparer une solution mère à 20 mM de maléimide PEG2-biotine en ajoutant ul 190 de PBS Non-Weigh-maléimide PEG2-biotine et mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Ajouter maléimide PEG2-biotine pour les VLP et mélanger. Utiliser un excès 10-fois molaire de réactif de solutions VLP ≤ 2 mg / ml. </li><li> Incuber la réaction à température ambiante pendant 4 h. </li><li> Retirer n&#39;ayant pas réagi maléimide PEG2-biotine en utilisant une colonne spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) et centrifugation pendant 2 min à 1500 xg à température ambiante. </li><li> Déterminer le nombre de moles de biotine par mole de VLP en utilisant la biotine Pierce Quantification Kit (Thermo Scientific) et following instructions du fabricant. </li></ol> 4. La réticulation de Cys 2-VLP et F Peptide <ol><li> VLP qui conduit à des résidus de cystéine disponibles pour la réticulation de l&#39;étape 2 (Cys 2-VLP) sont utilisés dans l&#39;étape suivante. Préparer une solution mère fraîche de réticulation (28,63 mM) en dissolvant 10 mg de NHS-PEG4-maléimide de réticulation en 680 ul de diméthylsulfoxyde. </li><li> Dissoudre un 17 (F)-amino peptide acide long (LLPNMOKDKEACAKAPL) dans 50 ul de tampon de conjugaison (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) à une concentration de 0,1 mM. </li><li> Ajouter 4 pl de réticulation à 50 ul du peptide dissous (protéine-NH2) à 1 mM concentration finale (qui est un excès de 10 fois molaire de 0,1 mM de solution de peptide). </li><li> Incuber la réaction pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Purifier réticulé peptide en utilisant une colonne de dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) équilibrée avec du tampon de conjugaison (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) par centrifugation à 1500 xgpendant 1 min à température ambiante. </li><li> Créer un mélange réactionnel combinant VLP (-protéine SH) et réticulé peptidiques (protéine-NH2) dans un rapport molaire déterminée par le nombre de thiols et amines activées intervenant dans la réaction et la différence de poids moléculaire entre VLP et peptidiques. </li><li> Incuber le mélange réactionnel à température ambiante pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Pour l&#39;analyse par Western blot, mélanger le produit conjugué résultant 1:1 avec du tampon Laemmli, faire bouillir pendant 10 minutes, et de procéder à SDS-PAGE sur un casting de pré-10-20% Tris-Glycine gel (Invitrogen), suivie par un électrotransfert sur une membrane de nitrocellulose (Invitrogen). Bloquer les membranes avec 1 x PBS, pH 7,2 contenant 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) et 5% de poudre de lait écrémé et de la sonde avec le peptide anticorps spécifiques suivies par la phosphatase approprié anticorps secondaire marqué. </li></ol>

<ol><li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconj.+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li>
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<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

La mention de noms commerciaux des produits commerciaux de la publication est uniquement dans le but de fournir des informations précises et n&#39;implique pas de recommandation ou une approbation par le Département américain de l&#39;Agriculture.

La méthode présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de cystéines réactives présentes sur la surface de particules de type viral de plantes produites ainsi que tous les autres complexes protéiques. Maléimides sont thiol-spécifique des réactifs, qui réagissent avec sulfhydryle libres des molécules contenant de former des liaisons thioéther stable. Cette méthode s&#39;appuie sur la spécificité des maléimides à réagir avec des groupes sulfhydryle pas impliqués dans les interactions avec d&#39;autres acides a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Thinwall, Ultra-Clear Tubes </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 Kit </td><td> Tecnologies vie </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescéine-5-maléimide </td><td> Thermo Scientific Technologies de la vie </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 est hors de substitution afin d&#39;F150 </td></tr><tr><td> Kit de quantification Pierce biotine </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotine, Non-Weigh Format </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Réticulants </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% de Tris-Glycine gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon Laemmli </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine SDS Exécution tampon </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine transfert Tampon </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Membrane de nitrocellulose papier filtre Sandwich </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Affinity phosphatase marqué anticorps purifiés à IgG de lapin </td><td> Kirkegaard et Perry Laboratories </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> Substrat de la phosphatase NBT / BCIP </td><td> Kirkegaard et Perry Laboratories </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; cueilleur rayado fino virus</em&gt; virus-like particles produits dans<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; plantes et réticulation des peptides à vlp

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Imitant et l&#39;exploitation de propriétés du virus et les caractéristiques physico-chimiques et physiques promet d&#39;apporter des solutions à certains des défis les plus urgents de la planète. La multitude et les types de virus associés à leurs propriétés intrigantes potentiellement donner des possibilités infinies pour les applications dans les technologies à base de virus. Les virus ont la capacité de s&#39;auto-assembler en particules de forme discrète et la taille, la spécificité de symétrie, la polyvalence, et des propriétés stables dans une large gamme de conditions de température et de pH. Sans surprise, avec une gamme remarquable de propriétés, les virus sont proposés pour être utilisés dans les biomatériaux 9, 14, 15 vaccins, du matériel électronique, des outils et des produits chimiques, l&#39;électronique moléculaire conteneurs 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12. Afin d&#39;utiliser les virus dans les nanotechnologies, elles doivent être modifiées de leurs formes naturelles pour donner de nouvelles fonctions. Ce défi processus peut être réalisée par plusieurs mécanismes comprenant la modification génétique du génome viral et la fixation chimique des molécules étrangères ou souhaitée pour les groupes réactifs des particules virales 8. La possibilité de modifier un virus dépend essentiellement des propriétés physico-chimiques et physiques du virus. En outre, les modifications génétiques ou physico-chimique doivent être effectuées sans affecter la structure du virus indigène et le fonctionnement du virus. Protéines de maïs rayado fino virus manteau (MRFV) s&#39;auto-assembler dans Escherichia coli produisant des VLP stables et vides qui sont stabilisées par protéine-protéine interactions et qui peut être utilisé dans les applications des technologies à base de virus 8. VLP produites dans des plants de tabac ont été examinés comme un échafaudage sur lequel une variété de peptides peuvent être affichés de manière covalente 13. Ici, nous décrivons les étapes 1) à déterminer lequel des cystéines accessibles au solvant dans une capside du virus sont disponibles pour les modification, et 2) Bioconjugate peptides modifiés pour les capsides. En utilisant indigènes ou par mutation-inséré résidus d&#39;acides aminés et des standards des technologies de couplage, une grande variété de matériaux ont été affichées sur la surface des virus de plantes tels que le virus de la mosaïque de Brome 3, virus de la panachure Carnation 12, niébé virus de la marbrure chlorotique 6, la mosaïque du tabac virus 17, virus de la mosaïque jaune navet 1, et MRFV 13.

L&#39;expression transitoire de mutants MRFV manteau de protéines (CP) des gènes dans N. benthamiana dans un vecteur PVX VLP à base produisant est décrit dans la figure 1. Le gène modifié MRFV protéine d&#39;enveloppe est amplifié par PCR puis placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteur subgénomique CP dupliqué dans un vecteur PVX-base, pP2C2S 2, (un cadeau de D. Baulcombe, Laboratoires Sainsbury, Norwich, Angleterre). En vitro transcription de l&#39;ARN produit de ...

Procédé pour analyser l&#39;accessibilité au solvant du groupe thiol de résidus cystéine de<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; (MRFV)-particules de type virus (VLP) suivi d&#39;un peptide réaction de réticulation est décrit. La méthode tire parti de la disponibilité de plusieurs groupes chimiques à la surface des particules de type viral qui peuvent être les cibles de réactions spécifiques.

L&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; Virus-like particles produits dans<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantes et réticulation des peptides à VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser une analyse de l'accessibilité au solvant des résidus de cystéine à la surface de particules pseudo-virales, ou VLP, suivie d'une réticulation de peptides sur les cystéines des particules pseudo-virales. Cette approche consiste d'abord à cloner la protéine de capside du virus Maize rayado fino, ou MRFV, dans un vecteur viral dérivé du virus X de la pomme de terre. Ensuite, des plantes de N. benthamiana sont inoculées avec le virus modifié, et les VLP de MRFV, formées à partir de la protéine de capside, sont purifiées. Enfin, les VLP et les peptides sont réticulés à l'aide d'ammoniac-PEG4-maleimide et détectés par immunobuvardage. Les résultats obtenus permettent d'identifier la production de complexes VLP-peptides par analyse en immunobuvardage. Cette technique élargit les connaissances sur la modification chimique de la surface des virus et des particules pseudo-virales afin de produire de nouveaux matériaux pour la nanotechnologie. Après avoir produit des ARN transcendants coiffés par T7 à partir de plasmides vecteurs dérivés du virus X de la pomme de terre portant les gènes de la protéine de capside MRFV de type sauvage et mutés au niveau de la cystéine, utilisez deux aliquotes de 10 microlitres chacune pour inoculer deux feuilles de N. benthamiana. Incubez les plantes pendant 10 jours dans une serre à 60 % d'humidité, avec un photopériode de 16 heures de lumière à 25 degrés Celsius et huit heures d'obscurité à 20 degrés Celsius. À la fin de l'incubation, récoltez les feuilles infectées par le virus, pesez le tissu végétal et placez-le sur de la glace. Après purification des particules pseudo-virales selon le protocole décrit, préparez une solution de fluorescéine-5-maléimide à une concentration de un millimolaire dans un tampon phosphate de sodium 50 millimolaire, pH 7,0, contenant 1 millimolaire de EDTA. Vortexez pour dissoudre complètement et protégez la solution de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Mélangez environ 30 microlitres de VLPs à une concentration d’un microgramme par microlitre avec 60 microlitres de fluorescéine-5-maléimide, puis incubez pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Arrêtez la réaction en ajoutant du DTT à une concentration finale de 50 millimolaire. À l’aide d’une colonne de désalinisation par centrifugation, éliminez la fluorescéine non réactive. Pour visualiser les VLPs possédant des résidus de cystéine disponibles pour le réticulation, réalisez une analyse par électrophorèse SDS-PAGE en ajoutant 10 microlitres de tampon d’échantillonnage 2x à 10 microlitres de chaque réaction. Conservez la protéine marquée à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant un mois maximum, ou en aliquotes monodose à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu’à trois mois.Préparez une solution mère fraîche de réactif de réticulation en dissolvant 10 milligrammes de réactif de réticulation NHS-PEG4-maleimide dans 680 microlitres de diméthylsulfoxyde. Dissolvez un peptide de 17 (F) acides aminés de longueur dans 50 microlitres de tampon de conjuguaison à une concentration de 0,1 millimolaire. Ajoutez quatre microlitres de réactif de réticulation à 50 microlitres du peptide dissous pour obtenir une concentration finale de un millimolaire. Incubez la réaction pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez une colonne de désalinisation pour purifier la réaction. À l’aide de VLPs possédant des résidus de cystéine disponibles pour la réticulation et du peptide réticulé, préparez un mélange réactionnel selon un rapport molaire déterminé par le nombre de groupements thiols et d’amines activées impliqués dans la réaction, ainsi que par la différence de masse moléculaire entre les VLPs et le peptide. Après avoir incubé la réaction pendant deux heures à température ambiante, utilisez-la pour réaliser une électrophorèse SDS-PAGE et un immunoblotting selon le protocole décrit dans le texte.Un exemple d'acides aminés réactifs de la protéine de capside du MRFV est présenté ici. Chaque acide aminé sélectionné peut être utilisé pour fixer des groupements si celui-ci est exposé à la surface. Les techniques chimiques incluent des stratégies classiques de bio-conjugaison telles que l'acylation du groupe amino de la lysine, l'alkylation du groupe sulfhydryle de la cystéine, ainsi que l'activation des résidus d'acide carboxylique et leur couplage avec des amines ajoutées.En outre, les groupes aromatiques de la tyrosine et du tryptophane peuvent constituer des cibles intéressantes pour la bioconjugaison par diazotation et alkylation. On illustre ici l'accessibilité au solvant des résidus de cystéine des VLP aux réactifs spécifiques des groupes thiols. Les VLP de type sauvage purifiées et les mutants cys-VLP portant des résidus de cystéine aux positions 107 à 111 et 192 à 194 du gène de la protéine de capside ne réagissent pas dans des conditions natives avec un réactif spécifique des thiols. Le fluorescéine-5-maléimide confère une fluorescence orangée uniquement au mutant cys-VLP portant des résidus de cystéine aux positions 125 à 129 du gène de la protéine de capside. Ce résultat montre que les VLP présentes dans la piste deux possèdent une disposition géométrique des résidus de cystéine conduisant à des groupes thiols libres exposés au solvant, tandis que les résidus de cystéine des échantillons des pistes une et trois sont probablement impliqués dans des ponts disulfure lors du repliement de la protéine de capside. Les réactions de marquage avec le maléimide-PEG2-biotine suivies d'un dosage biotinylation représentent un autre exemple d'analyse de l'accessibilité au solvant des résidus cys. Étant donné que la biotine est une molécule relativement petite, elle peut être conjuguée en plusieurs exemplaires sur les VLP, chacune s'associant à une molécule d'avidine comme indiqué ici. Le taux de biotinylation, 84,74 moles de biotine par mole de protéine, indique le nombre de molécules de biotine fixées sur les VLP, et par conséquent le nombre de ligands pouvant être exposés à la surface extérieure. En raison de la présence de plusieurs groupes thiols sur les VLP, des peptides peuvent être greffés par des réactions de réticulation avec le NHS-PEG4-maléimide.Ce réactif est un agent de réticulation hétérobifonctionnel, contenant des extrémités réactives telles que la N-hydroxysuccinimide ou l'ester NHS et des groupes maléimides, permettant la conjugaison covalente de molécules portant des amines et des groupes sulfhydryles. Dans cet exemple, l'ester NHS réagit avec les amines primaires pour former des liaisons amides, tandis que le maléimide réagit avec les groupes sulfhydryles pour former des liaisons thioesters stables. Comme on le voit ici, les réactions de réticulation produisent des complexes VLP-peptides qui sont immunoréactifs avec les anticorps spécifiques en immunobuvardage (western blot).Ce développement montre aux chercheurs dans le domaine de la virologie comment exploiter les particules virales comme support pour l'attachement d'une grande variété de ligands selon un réseau géométrique régulier, pour de nombreuses applications.

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