Name: Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans lorganisation nucléaire 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Apprenez à combiner immunofluorescence et FISH ADN pour détecter simultanément les modifications chromatiniennes et les séquences d'ADN dans des noyaux préservés en 3D. Cette méthode avancée permet d'étudier l'organisation nucléaire et la dynamique de la chromatine.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Skok, surtout Susannah Hewitt, de discussions et de commentaires. Ce travail est soutenu par l&#39;Institut national de la santé subventions R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS est une leucémie et érudit Lymphoma Society. JC est un Fellow Irvington Institut de la recherche sur le cancer Institut. MM est soutenu par une éducation National Science Foundation Grant universitaire intégré et des stages de recherche (NSF IGERT 0333389).

1. Étiquetage sonde d&#39;ADN avec des fluorophores: Nick Translation (~ 6 h) <ol><li> Propre ADN de BAC (préparé par maxi-prep) ou des plasmides ou des produits de PCR, tous remis en suspension dans H 2 O, peut être utilisé pour le marquage. Notez que pour un signal FISH robuste, sondes doivent couvrir au moins 10 kb. </li><li> Incuber ADN dans RNase A pendant 30 min à 37 ° C (Tous les réactifs sont énumérées dans le tableau 1). </li><li> Incuber la réaction translation de coupure pendant 2 heures à 16 ° C (voir les tableaux 2 et 3). D&#39;autres méthodes de marquage direct peut être utilisé (Exemple: Tag FISH, Invitrogen). </li><li> Inactiver la réaction pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C. </li><li> Déterminer la taille de la sonde sur un gel d&#39;agarose à 2%. Le frottis doit être comprise entre 100 et 1000 pb, avec la majorité, à environ 300-500 pb (Notez que le frottis de Cy5-sondes n&#39;est pas visible). Si l&#39;ADN est digéré pas assez, plus l&#39;ADN Pol I etDNase I peut être ajouté au mélange réactionnel et on incube pendant deux heures plus à 16 ° C. </li><li> Purifier sondes sur 0,025 mm de filtres deux béchers litres remplis de H 2 0 pendant deux heures dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter facteurs de blocage des sondes comme suit: 10 pg d&#39;ADN Cot-1, 10 pg d&#39;ADN Hybloc et 100 pg de sperme de saumon pour 10 pg de sondes d&#39;ADN. Des sondes d&#39;ADN conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. Sonde de précipitation / dénaturation / pré-recuit (h 3-4) <ol><li> Entre 0,3 pg et 1 pg de sonde d&#39;ADN est utilisé par lamelle. Sondes mélanger avec 0,1 volume de 3M NaAc (pH 5,2) et 2,5 volumes d&#39;éthanol à 100%, incuber pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C et centrifuger à 13000 rpm à 4 ° C pendant 30 min. A noter que la quantité de sonde d&#39;ADN peut être ajustée en fonction de la qualité de l&#39;ADN et la région nucléaire de l&#39;hybridation. D&#39;autres méthodes de marquage direct peut permettre l&#39;utilisation de quantités réduites desonde. Pour la détection de multiples signaux FISH ADN sur une diapositive, les différentes sondes peuvent être précipités ensemble (à l&#39;exception des sondes qui ne doit pas être pré-recuit, comme des séquences répétées). Sondes pour plusieurs expériences réalisées dans le même temps peut également être précipité en même temps. Pellets doivent être légèrement colorés selon les fluorophores utilisés (si de petites quantités de sondes sont précipités, le culot peut ne pas être visible). </li><li> Granulés secs et les remettre en suspension dans 15 ul de tampon d&#39;hybridation (voir tableau 4) par lamelle avec agitation (à l&#39;aide d&#39;un thermomixer Eppendorf) dans l&#39;obscurité à 37-45 ° C (pendant environ 20 mn). </li><li> Sondes dénaturer pendant 5 min à 75-95 ° C. </li><li> Pré-recuit sondes à 37 ° C pendant 30-60 min. Longueur de pré-recuit peut être ajustée en fonction de la complexité et de la qualité des sondes. </li><li> Appliquer des sondes pour les lamelles d&#39;hybridation pendant la nuit (voir la section 3). </li></ol> 3. 3Dimensions FISH ADN - Premier Jour (~ 3 h) <ol><li> Les cellules non adhérentes sont concentrés dans un petit volume de PBS 1x (~ 2x10 5 cellules à 5-10 pl de PBS 1x par lamelle) et tombe sur le centre d&#39;une lamelle couvre-poly-L-lysine enrobée. Les cellules adhérentes doivent être cultivées sur des lamelles pendant au moins 24 heures (~ 70% de confluence) (lamelles peuvent être revêtus de gélatine à 0,1%). Lamelles carrées 18x18 mm à 24-24 sont placées dans des plaques 6 puits, et tout au long du protocole, deux ml de chaque solution est utilisée par puits (alternativement rondes 1,5 mm lamelles peuvent être placés dans des plaques 12/24-well). </li><li> Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x, pH 7 à 7,4, pendant 10 min à température ambiante (4% des stocks PFA peut être aliquotés, stocké à -20 ° C). Paraformaldéhyde peuvent être achetés en solution (16%), ou des solutions mères 4% peut être préparé à partir de poudre / granulés. Paraformaldéhyde en poudre est dissoute dans du PBS 1x à&gt; 60 ° C (pH peut être augmenté à 8-9 pour faciliter la dissolution), refroidie sur la glace, réglezà pH 7 à 7,4 ed, filtré, aliquoté dans des faucons et stockées pendant des semaines à -20 ° C. </li><li> Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS pendant 5 min sur la glace. Longueur de perméabilisation peut être ajustée en fonction de la cellule de type NB:. Si FISH ADN est combiné avec l&#39;immunofluorescence, l&#39;immunomarquage doit être effectuée à ce stade (voir la section 4). </li><li> Après trois rinçages dans PBS 1x, incuber les cellules avec 0,1 ug / ul RNase A en 1x PBS pendant une heure à 37 ° C. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince. Si une résistance est rencontrée, lamelles doivent être inondé de 1x PBS afin d&#39;éviter d&#39;endommager les cellules. </li><li> Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,7% de Triton-X-100 HCl / 0,1 M pendant 10 min sur la glace. </li><li> Après trois rinçages in 1x PBS, les cellules dénaturer dans HCl 1,9 M pendant 30 min à température ambiante. Alternativement, les cellules peuvent être dénaturées dans 50% de formamide / 2x SSC à 75-80 ° C pendant au moins 30 min. Noter que la longueur d&#39;hybridation (et de la température) peut être optimisée en fonction de la cellule-type. </li><li> Après trois rinçages dans de la glace-froid 1x PBS, les cellules s&#39;hybrider avec des sondes nuit à 37 ° C dans une chambre sombre et humide. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 15 pl de sonde sur une diapositive, et scellé avec du ciment de caoutchouc. </li></ol> 4. 3-dimensionnelle d&#39;immuno-FISH - Premier jour (~ 6-7 h) <ol><li> Pour combiner immunofluorescence / DNA FISH, l&#39;immuno-marquage doit être effectué après la perméabilisation de 0,4% de Triton-X-100 (étape 3.3). </li><li> Incuber les cellules dans une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante (2,5% de sérumalbumine bovine (BSA), sérum de chèvre normal à 10%, 0,1% Tween-20). La solution de blocage est filtré, aliquoté dans eppendorfs de 1,5 ml et stocké pour mois à -20 ° C. </li><li> Incuber les cellules avec l&#39;anticorps primaire dirigé contre la protéine ou la modification d&#39;histone d&#39;intérêt dilué dans une solution de blocage, pendant une heure à température ambiante en chambre humide. Ici, nous montrons l&#39;exemple d&#39;un anticorps contre phosphorylés sérine-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, voir le tableau 5 pour plus de détails). Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince (inondé de PBS 1x, si nécessaire). Notez que la dilution et la durée d&#39;incubation peut être ajustée en fonction de la qualité de l&#39;anticorps et de cellules-types. </li><li> Laver les cellules dans 0,2% de BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation. </li><li> Incuber les cellules avec le cas échéant un fluorophore conjugué anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide. Ici, nous montrons un exemple de détection d&#39;unsecondaire de chèvre anti-anticorps de souris (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Voir le tableau 5 pour plus de détails). Haptène-anticorps secondaires conjugués (biotine, la digoxigénine, etc) peuvent également être utilisés. Dans ce cas, une étape supplémentaire pour la détection approprié (streptavidine, anti-dig, etc) peut être effectuée avant ou après pendant la nuit ADN-FISH hybridation. </li><li> Rincer les cellules dans 0,1% de Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation dans l&#39;obscurité. </li><li> Post-fix cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x pendant 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Continuer FISH ADN comme ci-dessus à partir d&#39;incubation de la RNase A (étape 3.4). </li></ol> 5. 3-dimensions ADN FISH / Immuno-FISH - Deuxième jour (~ 2 h) <ol><li> Retirez délicatement la colle de caoutchouc, des lamelles crues avec 2x SSC, retirer délicatement avec une pince et placez-les dans des puits contenant la solution de lavage. </li><li> Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;obscurité sous agitation.</li><li> Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité sous agitation. </li><li> Laver les cellules en 1x SSC pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité sous agitation à noter que dans le cas de la dénaturation de formamide, lavages doit être remplacé par le texte suivant:. Lavage 3 en lavages formamide / 2x SSC et 3 50% en 2x SSC, 5 min chacun, à 37 ° C. </li><li> Monter les cellules dans ProLong moyen de montage d&#39;or contenant 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) pour la contre de l&#39;ADN total. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 10-15 ul de milieu de montage sur une lame et scellé avec du vernis à ongles. Les lames sont conservées pendant plusieurs mois à -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopie 3D et d&#39;analyse <ol><li> Images en 3D peuvent être acquises avec des systèmes différents microscope. Dans nos expériences, des sections optiques séparées par 0,3 um sont recueillies sur un système Leica SP5 AOBS confocale (acousto-optique Beam Splitter). Notez que la séparation entre opticaavions l peut être réglée en fonction du type d&#39;analyse. </li><li> Piles d&#39;images 3D peuvent être analysées à l&#39;aide du logiciel et des outils différents. Nous utilisons le logiciel Image J pour évaluer les mesures de distance entre les loci d&#39;intérêt et d&#39;analyser les différents types d&#39;associations des loci d&#39;intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines. </li><li> Toutes les analyses statistiques sont effectuées pour comparer les deux (ou plus) différentes conditions biologiques de paires évaluation (s) d&#39;importance: comparaison entre les différents types de cellules ou de stades, la comparaison entre les différents loci d&#39;intérêt. Dans tous les tests statistiques, les valeurs P ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) sont considérées comme significatives (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * significatif; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * très significative, p &lt;1,00 E-3 *** très important). </li></ol> L&#39;analyse statistique des distributions entières de distances entre deux allèles. Nous avons d&#39;abord construct cumulatifs courbes de fréquence de distribution sur toute la plage de distances mesurées entre les deux alleles.To évaluer l&#39;importance des différences entre les distributions empiriques des inter-distances alléliques nous utilisons le test non paramétrique de deux échantillons de Kolmogorov-Smirnov (KS) 13,14 essai. L&#39;analyse statistique de près association (association par exemple) à l&#39;aide de deux allèles à une distance optimale de coupure. Afin d&#39;identifier la gamme de la plupart des différences dans les distances robustes entre deux allèles ou loci, nous utilisons une série de deux-tail test exact de Fisher 15 s. Plus précisément, à chaque distance mesurée nous tester si une condition est nettement surreprésentés à des distances plus courtes entre les deux échantillons. Le minimum de la distribution des valeurs de p indique la plage de distances qui doivent être considérées comme une coupure de près association (c.-à-appariement) des deux allèles. Par la suite le test de Fisher bilatéral exact est utilisé to évaluer l&#39;importance de l&#39;appariement de deux allèles identifiés à la valeur seuil 15. Corrections de tests multiples sont appliqués pour tenir compte du nombre total de tests de Fisher effectué 16. L&#39;analyse statistique de l&#39;association du locus d&#39;intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines. Le test bilatéral exact de Fisher-est utilisée pour analyser l&#39;importance de l&#39;association du locus d&#39;intérêt avec différents compartiments ou des protéines 15.

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<li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Les techniques décrites ci-dessus ont été utilisées dans notre laboratoire pour analyser la réglementation de V (D) J de l&#39;immunoglobuline et TCRA / j loci dans le développement des lymphocytes 30,31. Nous sommes convaincus que cette technique peut être adaptée pour la détection de diverses protéines nucléaires, des compartiments nucléaires et les lieux, dans différents types cellulaires. Modifications du protocole peut être nécessaire, et dans ce cas les étapes majeures de se concentrer...

Épigénétique mise en place de mécanismes de déclenchement et l&#39;héritage de développement et d&#39;un type de cellule spécifique profils transcriptionnels. À un certain niveau, cela implique la modulation de empaquetage de la chromatine qui définit des régions génomiques actifs ou silencieux. À plus grande échelle, l&#39;organisation mondiale de la 3D et de l&#39;architecture du génome nucléaire jouent également un rôle dans le contrôle des motifs de la transcription. Ainsi, la dissection de ces caractéristiques épigénomiques est essentielle pour une compréhension complète de la façon dont les gènes sont régulés 6-11. Combiné FISH ADN immunofluorescence et 3D offrent une occasion unique de compléter les analyses moléculaires et biochimiques en évaluant les interactions spécifiques / associations de séquences d&#39;ADN et / ou de protéines dans le noyau. En outre, alors que l&#39;ensemble du génome techniques à haut débit tels que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) ou la conformation de capture chromosome couplé avec le séquençage profond (4C-seq, 5C, Salut-C) fournir dat mondialeun sur 12 populations de cellules, les techniques d&#39;immunofluorescence POISSON / ADN permettre des analyses au niveau de la cellule unique. Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d&#39;ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D et des analyses (3D immuno-FISH). L&#39;avantage de ce protocole est la visualisation combinée de l&#39;ADN et la préservation de la structure des protéines. Notre expérience dans ce domaine nous a permis d&#39;améliorer et de simplifier les protocoles existants. Bien que nous ayons utilisé ce protocole pour détecter l&#39;ADN des cassures double brin dans les lymphocytes subissent une recombinaison, cette méthode peut être appliquée à d&#39;autres protéines et d&#39;autres types de cellules.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pêcheur </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 à C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 ou Cy5 dUTP </td><td> Pêcheur </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> ADN Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 filtres pm </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> ADN Cot-1 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc ADN 1 mg / ml </td><td> Applied Genetics </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> De sperme de saumon </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> poudre pour être remises en suspension à 10 mg / ml dans du H 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (acétate de sodium, pH 5,2, solution tampon) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grade) </td><td> Pêcheur </td><td> N ° 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) </td><td> Pêcheur </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Poudre de sulfate de dextrane </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> PESS (Saline-phosphate de sodium-EDTA) solution 20x </td&gt; <td> Pêcheur </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Pêcheur </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> Pêcheur </td><td> N ° 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Diapositives </td><td> Pêcheur </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 6 puits </td><td> Pêcheur </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pêcheur </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> La poly-L-lysine solution </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde, granulés, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol qualité </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Fraction BSA (Bovine Serum Albumin) V </td><td> Pêcheur </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum normal de chèvre </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol qualité </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrate de sodium salin) 20x solution </td><td> Pêcheur </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong réactif antifade Or </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Meilleur essai un ciment enveloppe en caoutchouc </td><td> Magasins de fournitures d&#39;art ou de bureau </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs spécifiques et du petit matériel. </td></tr></tbody></table>

immunofluorescence combinés et fish adn sur 3d préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3d

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Hybridation fluorescente in situ utilisant des sondes ADN sur le 3-dimensions noyaux conservés suivie par microscopie confocale 3D (FISH ADN 3D) représente le moyen le plus direct pour visualiser l&#39;emplacement des loci de gènes, chromosomes sous-régions ou des territoires entiers dans des cellules individuelles. Ce type d&#39;analyse permet de mieux comprendre l&#39;architecture globale du noyau ainsi que le comportement des loci génomiques spécifiques et des régions dans l&#39;espace nucléaire. Immunofluorescence, d&#39;autre part, permet la détection des protéines nucléaires (histones modifiées, variants d&#39;histones et des modificateurs, des machines et des facteurs de transcription nucléaires, sous-compartiments, etc.) Le problème majeur en combinant FISH ADN immunofluorescence et 3D est, d&#39;une part, de préserver l&#39;épitope détecté par l&#39;anticorps, ainsi que l&#39;architecture 3D du noyau, et d&#39;autre part, pour permettre la pénétration de la sonde d&#39;ADN pour détecter loci chromosomiques ou territoires 1-5. Ici, nous fournissons un protocole qui combine la visualisation des modifications de la chromatine avec loci génomiques conservées dans les noyaux 3D.

ADN et immuno-FISH sont utilisés dans le laboratoire Skok pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire associés au processus de V (D) J du locus récepteurs des antigènes au cours du développement des lymphocytes B et T. Les techniques décrites ci-dessus nous permettent de mesurer des distances i) entre les deux extrémités d&#39;un locus (contraction) ii) mesurer les distances entre les allèles ou loci (appariement), iii) analyser l&#39;endommagement de l&#39;ADN survenant dans les lieux, iv) déterminer...

Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d&#39;ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).

Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

L’objectif global de cette procédure est de détecter simultanément les modifications de la chromatine et les séquences d’ADN à l’aide de la microscopie confocale 3D, d’abord générer des sondes d’ADN spécifiques. Pendant ce temps, les cellules expérimentales sont fixées et immuno-colorées. Pour les marqueurs d’histones d’intérêt.Les cellules sont alors dénaturées et une fluorescence nocturne est à l’intérieur de vous. L’hybridation ou poisson est réalisée à l’aide d’une ou plusieurs sondes d’ADN. Enfin, les cellules sont lavées et montées pour la fluorescence 3D.L’analyse microscopique des images résultantes révèle la localisation nucléaire des loci d’intérêt et l’association avec des modifications spécifiques de ses pierres. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine la visualisation des protéines nucléaires, y compris les pierres avec des loci génomiques dans les noyaux préservés en 3D, et peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’organisation nucléaire épigénétique de la chromatine ou de la régulation des gènes. Pour cette procédure, des plasmides de dos ou des produits PCR peuvent être utilisés pour le marquage.Ceux-ci doivent être préparés comme décrit dans le texte d’accompagnement. Notez que pour un signal de poisson robuste, les sondes doivent dépenser au moins 10 kilobases la paire. Commencez cette procédure en combinant un microgramme d’ADN et 0,17 microgramme d’ARN A dans un microtube à centrifuger.Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, inactivez brièvement les ARN A sur de la glace et ajoutez la quantité appropriée de traduction de Nick. Mélangez l’incubation pendant deux heures à 16 degrés Celsius dans un bain-marie réfrigéré ou un bloc froid pour inactiver la réaction.Placez les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure ou à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, déterminez la taille de la sonde sur un gel agros à 2 %. Le frottis doit être compris entre 101 000 paires de bases, la majorité étant d’environ 300 à 500 paires de bases.Notez que la tache des sondes de science-fiction n’est pas visible. Une fois la taille déterminée, purifier les sondes par dialyse à 0,02. Filtres de cinq millimètres dans des béchers de deux litres remplis d’eau.Pipetez doucement 200 microgrammes de sonde au centre de chaque filtre flottant, puis incubez pendant deux heures dans l’obscurité. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette, transférez délicatement la sonde des filtres vers un nouveau tube de micro-centrifugation. Ensuite, ajoutez des facteurs de blocage aux sondes comme suit.Un microgramme de CO 1D NA. Un microgramme d’ADN à haut bloc et 10 microgrammes de sperme de saumon pour un microgramme de sonde d’ADN et de mélange stockent les sondes d’ADN à moins 20 degrés Celsius. Le jour de la procédure de pêche, les sondes sont précipitées et préparées pour l’utilisation. Notez que les étapes décrites dans cette section de la vidéo doivent être effectuées en parallèle avec les étapes de la section suivante.Pour précipiter les sondes, suivez-les et combinez-les avec 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires à pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % incuber pendant une heure à moins 80 degrés Celsius. Après l’incubation, faites tourner les sondes à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’essorage, jetez le surnageant et faites sécher les granulés à l’air libre dans l’obscurité.Selon la quantité et la couleur des sondes, la pastille peut être visible ou non. Suspendez la pastille dans 15 microlitres de tampon d’hybridation par condition d’essai et agitez à l’aide d’un mélangeur thermique einor dans l’obscurité à 37 à 45 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Ensuite, pour dénaturer les sondes, incubez-les pendant cinq minutes à 75 à 95 degrés Celsius.Ensuite, pour pré-sondes, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes sur le mélangeur thermique. Immédiatement après l’incubation, les sondes seront appliquées sur les cellules sur des lamelles de recouvrement, comme décrit dans la section suivante de la vidéo. Notez que pour les étapes suivantes, les temps d’incubation doivent être modifiés au besoin pour les anticorps et les cellules utilisés.Les étapes décrites dans cette section de la vidéo doivent être effectuées en parallèle avec les étapes de la section précédente, comme décrit dans le texte d’accompagnement. Déposez les cellules non adhérentes sur des lamelles recouvertes de polylysine dans des puits de six plaques de puits et laissez-les se fixer pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite délicatement deux millilitres d’aldéhyde paraforme à 2 % dans du PBS et incubez pendant 10 minutes à température ambiante après l’incubation.Rincez bien chaque fois avec du PB S3 puis pour perméer les cellules, ajoutez deux millilitres de glace froide, 0,4 % Triton X 100 dans du PBS et incubez pendant cinq minutes sur de la glace. Après avoir aspiré la solution perméable si l’ADN du poisson doit être combiné avec l’immunofluorescence, procédez comme suit. Pipette d’abord 100 microlitres de solution bloquante sur param dans une chambre humidifiée.Placez la lamelle côté cellule vers le bas sur la solution de blocage et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez. Le couvercle se glisse en gouttes de 100 microlitres de l’anticorps primaire dilué dans une solution bloquante.Ici, l’anticorps utilisé reconnaît le syrien phosphorylé 1 39 de H deux A x ou gamma H deux A x. Incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, utilisez une pince pour retirer soigneusement les lamelles.Si les capots sont difficiles à ramasser, inondez avec PBS et réessayez. Transférez chaque lame dans un puits de six. Plaque à puits contenant deux millilitres de 0,2 % BSA 0,1 % entre 20 po de PBS : laver les lamelles de couverture dans cette solution trois fois pendant cinq minutes à température ambiante en agitant, puis incuber les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié dilué dans une solution bloquante pendant une heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide le param.Comme avant après l’incubation, rincez les cellules à 0,1 % entre 20 dans du PB S3 fois pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité pour postfixer les cellules, immergez-les dans deux millilitres de para formaldéhyde à 2 % dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Une fois que les cellules ont été colorées ou si elles ne le sont pas, continuez l’ADN du poisson en rinçant les lamelles trois fois dans du PBS. Placez ensuite les glissières de couvercle côté cellule vers le bas sur une goutte de 100 microlitres de 0,1 milligramme par millilitre.Les ARN sur param dans une chambre humidifiée et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, rincez trois fois les lamelles de couverture dans du PBS puis perméez les cellules dans de l’acide chlorhydrique 0,1 molaire froid pendant 10 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Après trois rinçages au PBS, dénaturez les cellules dans de l’acide chlorhydrique 1,9 molaire pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité et lavez-les trois fois de plus dans du PBS glacé pour hybrider les cellules avec les sondes.Placez les cales de couverture, côté cellule vers le bas, sur une goutte de 15 microlitres de sonde préparée dans la section précédente de cette vidéo sur une lame de microscope, scellez la lame avec de la colle de caoutchouc et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans une chambre sombre et humidifiée. Le lendemain, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement le ciment en caoutchouc des lames. Ensuite, faites pousser les lamelles avec deux actes SSC et utilisez des pinces pour retirer soigneusement les lamelles avec les cellules.Ensuite, placez-les dans des puits contenant une solution de lavage. Ensuite, effectuez les lavages suivants en secouant dans l’obscurité deux XSSC pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, deux XSSC pendant 30 minutes à température ambiante et un XSSC pendant 30 minutes à température ambiante pour monter les diapositives, placez les glissières de couverture côté cellule vers le bas sur une goutte de 10 à 15 microlitres de support de montage en or prolongé contenant 1,5 milligramme par millilitre de joint DPI avec vernis à ongles. Les lames peuvent être stockées pendant des mois à moins 20 degrés Celsius.Une fois les lames prêtes, collectez des images 3D avec des sections optiques séparées de 0,3 micron et analysez comme décrit dans le document d’accompagnement pour déterminer si les changements d’association des deux allèles des loci du récepteur de l’antigène sont liés à la régulation du processus de recombinaison des VDJ au cours du développement des lymphocytes, les cellules de type sauvage et mutantes déficientes en protéine de recombinase ont été utilisées pour examiner un locus d’intérêt à l’aide d’un ADN Sonde de poisson générée à partir d’un dos qui s’étend sur une paire d’environ 200 kilobases englobant la région génomique. Les distances entre les allèles ont été mesurées entre le centre de masse de chaque signal arrière dans des piles d’images 3D, des cercles pointillés, des formes de noyau. Les barres d’échelle montrées sont des courbes de distribution de fréquence cumulée d’un micron, puis générées pour montrer toute la gamme de distances entre les deux allèles mesurés dans les cellules de type sauvage et mutantes.Le test KS non paramétrique à deux échantillons a ensuite été utilisé pour évaluer la signification des différences entre les deux distributions. L’étendue des différences les plus marquées dans les distances interalléliques a été évaluée à l’aide d’une série de deux tests exacts de Fisher à queue indiqués par les points bleus. Les valeurs P les plus robustes indiquées par les points les plus élevés ont été trouvées pour les distances autour d’un micron.Ainsi, la limite pour l’association ou l’appariement étroit des deux allèles a été fixée à un micron. Les courbes de fréquence cumulatives présentées ici indiquent la gamme de distances pour l’association étroite des deux allèles de zéro à 1,5 micron dans les deux conditions biologiques différentes. La signification de l’appariement des deux allèles a été évaluée à l’aide du test exact de Fisher à deux queues pour une coupure à un micron.Ce graphique montre que dans la condition mutante, les deux allèles ne sont pas associés à une fréquence élevée comme dans le type sauvage. Ainsi, la protéine manquante est impliquée dans l’appariement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner l’immunofluorescence et l’ADN des poissons.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en donnant un aperçu des changements globaux de l’architecture nucléaire, du comportement de loci génomiques et de régions spécifiques dans l’espace nucléaire et de l’association de protéines nucléaires spécifiques dans ces régions. Et cela aide à comprendre les mécanismes sous-jacents aux différentes maladies après cette procédure. D’autres méthodes telles que les techniques de débit de glace à l’échelle du génome telles que la chromatine, les immunoprécipitations, la recherche de puces ou la confirmation de la capture de chromosomes couplée à un séquençage profond comme le front five C ou IC, peuvent être effectuées pour fournir des données globales sur les populations cellulaires.

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Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Cet article décrit la sélection des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliquées au diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) dans un contexte clinique.

FISH pour le diagnostic préimplantatoire génétique

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode d’immunofluorescence pour visualiser la localisation des protéines de réparation de l’ADN γH2AX et 53BP1 aux sites de cassures d’ADN double brin dans les noyaux cellulaires irradiés.

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Nous décrivons un protocole robuste et polyvalent pour l'analyse de l'architecture nucléaire par FISH d'ADN 3D à l'aide de sondes fluorescentes directement marqués.

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Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.

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