Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l'organisation nucléaire 3D

L’objectif global de cette procédure est de détecter simultanément les modifications de la chromatine et les séquences d’ADN à l’aide de la microscopie confocale 3D, d’abord générer des sondes d’ADN spécifiques. Pendant ce temps, les cellules expérimentales sont fixées et immuno-colorées. Pour les marqueurs d’histones d’intérêt.

Les cellules sont alors dénaturées et une fluorescence nocturne est à l’intérieur de vous. L’hybridation ou poisson est réalisée à l’aide d’une ou plusieurs sondes d’ADN. Enfin, les cellules sont lavées et montées pour la fluorescence 3D.

L’analyse microscopique des images résultantes révèle la localisation nucléaire des loci d’intérêt et l’association avec des modifications spécifiques de ses pierres. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine la visualisation des protéines nucléaires, y compris les pierres avec des loci génomiques dans les noyaux préservés en 3D, et peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’organisation nucléaire épigénétique de la chromatine ou de la régulation des gènes. Pour cette procédure, des plasmides de dos ou des produits PCR peuvent être utilisés pour le marquage.

Ceux-ci doivent être préparés comme décrit dans le texte d’accompagnement. Notez que pour un signal de poisson robuste, les sondes doivent dépenser au moins 10 kilobases la paire. Commencez cette procédure en combinant un microgramme d’ADN et 0,17 microgramme d’ARN A dans un microtube à centrifuger.

Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, inactivez brièvement les ARN A sur de la glace et ajoutez la quantité appropriée de traduction de Nick. Mélangez l’incubation pendant deux heures à 16 degrés Celsius dans un bain-marie réfrigéré ou un bloc froid pour inactiver la réaction.

Placez les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure ou à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, déterminez la taille de la sonde sur un gel agros à 2 %. Le frottis doit être compris entre 101 000 paires de bases, la majorité étant d’environ 300 à 500 paires de bases.

Notez que la tache des sondes de science-fiction n’est pas visible. Une fois la taille déterminée, purifier les sondes par dialyse à 0,02. Filtres de cinq millimètres dans des béchers de deux litres remplis d’eau.

Pipetez doucement 200 microgrammes de sonde au centre de chaque filtre flottant, puis incubez pendant deux heures dans l’obscurité. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette, transférez délicatement la sonde des filtres vers un nouveau tube de micro-centrifugation. Ensuite, ajoutez des facteurs de blocage aux sondes comme suit.

Un microgramme de CO 1D NA. Un microgramme d’ADN à haut bloc et 10 microgrammes de sperme de saumon pour un microgramme de sonde d’ADN et de mélange stockent les sondes d’ADN à moins 20 degrés Celsius. Le jour de la procédure de pêche, les sondes sont précipitées et préparées pour l’utilisation. Notez que les étapes décrites dans cette section de la vidéo doivent être effectuées en parallèle avec les étapes de la section suivante.

Pour précipiter les sondes, suivez-les et combinez-les avec 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires à pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % incuber pendant une heure à moins 80 degrés Celsius. Après l’incubation, faites tourner les sondes à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’essorage, jetez le surnageant et faites sécher les granulés à l’air libre dans l’obscurité.

Selon la quantité et la couleur des sondes, la pastille peut être visible ou non. Suspendez la pastille dans 15 microlitres de tampon d’hybridation par condition d’essai et agitez à l’aide d’un mélangeur thermique einor dans l’obscurité à 37 à 45 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Ensuite, pour dénaturer les sondes, incubez-les pendant cinq minutes à 75 à 95 degrés Celsius.

Ensuite, pour pré-sondes, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes sur le mélangeur thermique. Immédiatement après l’incubation, les sondes seront appliquées sur les cellules sur des lamelles de recouvrement, comme décrit dans la section suivante de la vidéo. Notez que pour les étapes suivantes, les temps d’incubation doivent être modifiés au besoin pour les anticorps et les cellules utilisés.

Les étapes décrites dans cette section de la vidéo doivent être effectuées en parallèle avec les étapes de la section précédente, comme décrit dans le texte d’accompagnement. Déposez les cellules non adhérentes sur des lamelles recouvertes de polylysine dans des puits de six plaques de puits et laissez-les se fixer pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite délicatement deux millilitres d’aldéhyde paraforme à 2 % dans du PBS et incubez pendant 10 minutes à température ambiante après l’incubation.

Rincez bien chaque fois avec du PB S3 puis pour perméer les cellules, ajoutez deux millilitres de glace froide, 0,4 % Triton X 100 dans du PBS et incubez pendant cinq minutes sur de la glace. Après avoir aspiré la solution perméable si l’ADN du poisson doit être combiné avec l’immunofluorescence, procédez comme suit. Pipette d’abord 100 microlitres de solution bloquante sur param dans une chambre humidifiée.

Placez la lamelle côté cellule vers le bas sur la solution de blocage et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez. Le couvercle se glisse en gouttes de 100 microlitres de l’anticorps primaire dilué dans une solution bloquante.

Ici, l’anticorps utilisé reconnaît le syrien phosphorylé 1 39 de H deux A x ou gamma H deux A x. Incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, utilisez une pince pour retirer soigneusement les lamelles.

Si les capots sont difficiles à ramasser, inondez avec PBS et réessayez. Transférez chaque lame dans un puits de six. Plaque à puits contenant deux millilitres de 0,2 % BSA 0,1 % entre 20 po de PBS : laver les lamelles de couverture dans cette solution trois fois pendant cinq minutes à température ambiante en agitant, puis incuber les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié dilué dans une solution bloquante pendant une heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide le param.

Comme avant après l’incubation, rincez les cellules à 0,1 % entre 20 dans du PB S3 fois pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité pour postfixer les cellules, immergez-les dans deux millilitres de para formaldéhyde à 2 % dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Une fois que les cellules ont été colorées ou si elles ne le sont pas, continuez l’ADN du poisson en rinçant les lamelles trois fois dans du PBS. Placez ensuite les glissières de couvercle côté cellule vers le bas sur une goutte de 100 microlitres de 0,1 milligramme par millilitre.

Les ARN sur param dans une chambre humidifiée et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, rincez trois fois les lamelles de couverture dans du PBS puis perméez les cellules dans de l’acide chlorhydrique 0,1 molaire froid pendant 10 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Après trois rinçages au PBS, dénaturez les cellules dans de l’acide chlorhydrique 1,9 molaire pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité et lavez-les trois fois de plus dans du PBS glacé pour hybrider les cellules avec les sondes.

Placez les cales de couverture, côté cellule vers le bas, sur une goutte de 15 microlitres de sonde préparée dans la section précédente de cette vidéo sur une lame de microscope, scellez la lame avec de la colle de caoutchouc et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans une chambre sombre et humidifiée. Le lendemain, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement le ciment en caoutchouc des lames. Ensuite, faites pousser les lamelles avec deux actes SSC et utilisez des pinces pour retirer soigneusement les lamelles avec les cellules.

Ensuite, placez-les dans des puits contenant une solution de lavage. Ensuite, effectuez les lavages suivants en secouant dans l’obscurité deux XSSC pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, deux XSSC pendant 30 minutes à température ambiante et un XSSC pendant 30 minutes à température ambiante pour monter les diapositives, placez les glissières de couverture côté cellule vers le bas sur une goutte de 10 à 15 microlitres de support de montage en or prolongé contenant 1,5 milligramme par millilitre de joint DPI avec vernis à ongles. Les lames peuvent être stockées pendant des mois à moins 20 degrés Celsius.

Une fois les lames prêtes, collectez des images 3D avec des sections optiques séparées de 0,3 micron et analysez comme décrit dans le document d’accompagnement pour déterminer si les changements d’association des deux allèles des loci du récepteur de l’antigène sont liés à la régulation du processus de recombinaison des VDJ au cours du développement des lymphocytes, les cellules de type sauvage et mutantes déficientes en protéine de recombinase ont été utilisées pour examiner un locus d’intérêt à l’aide d’un ADN Sonde de poisson générée à partir d’un dos qui s’étend sur une paire d’environ 200 kilobases englobant la région génomique. Les distances entre les allèles ont été mesurées entre le centre de masse de chaque signal arrière dans des piles d’images 3D, des cercles pointillés, des formes de noyau. Les barres d’échelle montrées sont des courbes de distribution de fréquence cumulée d’un micron, puis générées pour montrer toute la gamme de distances entre les deux allèles mesurés dans les cellules de type sauvage et mutantes.

Le test KS non paramétrique à deux échantillons a ensuite été utilisé pour évaluer la signification des différences entre les deux distributions. L’étendue des différences les plus marquées dans les distances interalléliques a été évaluée à l’aide d’une série de deux tests exacts de Fisher à queue indiqués par les points bleus. Les valeurs P les plus robustes indiquées par les points les plus élevés ont été trouvées pour les distances autour d’un micron.

Ainsi, la limite pour l’association ou l’appariement étroit des deux allèles a été fixée à un micron. Les courbes de fréquence cumulatives présentées ici indiquent la gamme de distances pour l’association étroite des deux allèles de zéro à 1,5 micron dans les deux conditions biologiques différentes. La signification de l’appariement des deux allèles a été évaluée à l’aide du test exact de Fisher à deux queues pour une coupure à un micron.

Ce graphique montre que dans la condition mutante, les deux allèles ne sont pas associés à une fréquence élevée comme dans le type sauvage. Ainsi, la protéine manquante est impliquée dans l’appariement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner l’immunofluorescence et l’ADN des poissons.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en donnant un aperçu des changements globaux de l’architecture nucléaire, du comportement de loci génomiques et de régions spécifiques dans l’espace nucléaire et de l’association de protéines nucléaires spécifiques dans ces régions. Et cela aide à comprendre les mécanismes sous-jacents aux différentes maladies après cette procédure. D’autres méthodes telles que les techniques de débit de glace à l’échelle du génome telles que la chromatine, les immunoprécipitations, la recherche de puces ou la confirmation de la capture de chromosomes couplée à un séquençage profond comme le front five C ou IC, peuvent être effectuées pour fournir des données globales sur les populations cellulaires.