Vivez l'imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

L’objectif global de cette procédure est de suivre en temps réel la pénétration d’un médicament et la réponse thérapeutique à l’administration d’un médicament thérapeutique. Ceci est accompli en traitant d’abord l’animal avec le médicament. Ensuite, la glande mammaire inguinale contenant la tumeur est exposée en créant un lambeau de peau.

Ensuite, la souris est transférée au stade microscopique et la saturation en oxygène du sang et le pouls sont mesurés et une ligne à demeure pour l’administration de liquide et de médicament ou de colorant est insérée. Enfin, des images en accéléré sont acquises pour des analyses ultérieures. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des changements dans la mort cellulaire ou les interactions du stroma tumoral en réponse à un médicament grâce à la microscopie confocale à disque rotatif en direct de tumeurs mammaires de souris.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que la façon dont les différents composants du stroma d’une tumeur influencent la réponse au traitement. Avant de commencer, consultez le protocole écrit pour les calendriers typiques d’administration des médicaments et d’imagerie. Allumez un stérilisateur à billes chaudes et laissez-le atteindre au moins 200 degrés Celsius.

Après avoir lavé les outils chirurgicaux à l’eau et au savon, y compris une paire de pinces à dents, une paire de pinces dentelées et deux paires de ciseaux, utilisez le stérilisateur à billes chaudes pour les stériliser pendant au moins 30 secondes. Ensuite, laissez-les. Refroidir. Placez un trempage de laboratoire sur le couvercle en polystyrène qui servira de plate-forme chirurgicale.

Utilisez du ruban de laboratoire pour fixer un cône de nez avec une ligne au système d’anesthésie au trempage de laboratoire et une aiguille de calibre 18 sur un pouce et demi à travers le ruban dans le couvercle en polystyrène de chaque côté du cône de nez pour maintenir le cône de nez bien en place. Réservez la gaze stérile de bétadine. Deux lingettes isopropanol à 70 %, une lame de microscope, de la super colle et quatre morceaux de ruban de laboratoire d’un demi-pouce de large.

Après avoir anesthésié l’animal dans une chambre d’induction, lorsqu’il respire profondément et lentement, transférez la souris sur la plate-forme chirurgicale, face ventrale vers le haut. Pour éviter une pression élevée, ouvrez la ligne d’anesthésie à la plate-forme chirurgicale, puis fermez la ligne d’anesthésie à la chambre d’induction. Réduire la concentration d’isoflurane de 4 % à 2,5 %Vérifiez que la profondeur de l’anesthésie est suffisante pour la chirurgie en effectuant un pincement des coussinets plantaires.

Si l’animal ne réagit pas, utilisez quatre morceaux de ruban adhésif de laboratoire pour fixer ses membres à la plate-forme chirurgicale et utilisez un rasoir électrique pour retirer les poils de la surface ventrale. Utilisez des lingettes isopropanol à 70 %, suivies de bétadine appliquée sur de la gaze stérile pour désinfecter la surface ventrale de l’animal à l’aide de ciseaux et de pinces à dents. Faites une incision sous-cutanée de la ligne médiane ventrale à partir d’environ trois millimètres au-dessus de l’urètre jusqu’à l’apophyse xiphoïde.

Prenez soin d’éviter de perforer ou de couper le péritoine avec les ciseaux et la pince dentée. Détaché doucement la peau de la cavité péritonéale avec la glande mammaire inguinale contenant la tumeur à imager Toujours attachée. Positionnez une lame de microscope en verre contre le rabat cutané de sorte que la majeure partie de la tumeur repose à plat une fois que la souris est placée sur la scène, et qu’elle ne soit pas obstruée par les membres postérieurs.

Une fois que la lame de microscope a été correctement positionnée, utilisez de la super colle pour fixer la lame à la surface externe de la peau. Retirez le ruban de laboratoire qui fixe les membres de l’animal. Ouvrez la ligne d’anesthésie à la platine du microscope, puis fermez la ligne d’anesthésie à la plate-forme chirurgicale.

Une fois que l’animal a été transféré, positionnez et fixez la ligne d’anesthésie et le cône nasal pour vous assurer que la souris reste anesthésiée et est dans une position confortable. Réduisez la concentration d’isoflurane à 1,5 %Exposez la tumeur de manière à ce qu’elle soit positionnée sur le dessus et au centre de l’un des ports d’imagerie recouverts de verre sur la platine du microscope. Insérez la ligne intrapéritonéale à demeure avec le dispositif de perfusion ailé attaché à la seringue d’un millilitre contenant une solution saline PBS stérile ou une solution saline avec de l’iodure de propidium.

Lorsque la ligne intrapéritonéale est insérée, injectez à l’animal 100 microlitres de solution saline avec de l’iodure de propidium et continuez à injecter 50 microlitres de solution saline avec de l’iodure de propidium toutes les heures jusqu’à ce que la séance d’imagerie soit terminée. À l’aide des oculaires, vérifiez que la tumeur est correctement positionnée et doucement collée sur la lame de microscope et la ligne intrapéritonéale. La lame doit être fixée suffisamment lâchement pour que le flux sanguin vers les tissus ne soit pas obstrué.

Le ruban adhésif de la lame de microscope permet de minimiser les artefacts d’imagerie introduits par la respiration de l’animal pour acquérir des images en accéléré. Utilisez le logiciel open source micromanager, compilez et analysez les données brutes à l’aide d’IRIS ou d’un autre logiciel d’analyse d’images. Les brins DExT conjugués par fluorescence peuvent être utilisés comme marqueur de substitution pour l’administration de médicaments dans les tissus.

On voit ici l’arrivée de deux mégadaltons de dextran IV conjugués à une souris exprimant une protéine fluorescente bleue dans des cellules cancéreuses du sein. Après l’arrivée du médicament dans la tumeur, l’extravasation et la diffusion peuvent être imagées pour déterminer la demi-vie intravasculaire et la distribution du médicament. Ici, l’extravasation et la distribution de 10 kilodaltons de dextran IV conjugués à LOR injectés dans une souris exprimant une protéine fluorescente bleue dans les cellules cancéreuses du sein et une protéine fluorescente verte dans les cellules myéloïdes sont montrées.

L’imagerie peut fournir des informations sur le type de mort cellulaire subie par les cellules cancéreuses. Ici, des changements nucléaires structurels indiquant une nécrose ou une apoptose sont observés chez une souris exprimant une protéine fluorescente verte conjuguée à son deux b. Après un traitement à la doxorubicine, la mort des cellules cancéreuses induite par la chimiothérapie entraîne souvent un recrutement réactif des cellules immunitaires dans les tumeurs.

Voici un exemple de cette réponse stromale à un traitement aigu par la doxorubicine chez une souris exprimant des protéines fluorescentes bleues et vertes dans le cancer du sein et les cellules myéloïdes respectivement. En plus de visualiser la réponse stromale globale à la chimiothérapie, des réponses stromales spécialisées peuvent également être visualisées ici. La phagocytose du matériel cellulaire nécrotique par une cellule voisine est mise en évidence une fois maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée en 30 à 60 minutes et les animaux peuvent être imagés pendant 12 à 40 heures si elle est exécutée correctement.