Name: Vivez limagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de la pénétration des médicaments et des réponses thérapeutiques dans les tumeurs mammaires murines. Cette méthode par microscopie confocale à disque rotatif permet d'analyser les interactions tumorales à résolution cellulaire.

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Nous remercions J. et J. Cappellani Qiu pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des fonds de l&#39;Institut national du cancer (U01 CA141451), le cancer du Consortium Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Marche Île Jour 2 de lutte contre le cancer du sein, de la Coalition des femmes contre la Manhasset cancer du sein ME, et un pré-doctoral du Programme de recherche sur le cancer du sein dirigé par le Congrès, États-Unis à ESNESN est également le destinataire de la rapide et Leslie C. William Randolph Hearst Bourses de la Fondation de l&#39;École des sciences biologiques Watson. AHA a été soutenue par des fonds du Conseil norvégien de la recherche (160698/V40 et 151 882), et du Sud-Est Regional Health Authorities (2007060).

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés IACUC.

Les réponses des tumeurs aux traitements systémiques in vivo peut être considérablement différents de ceux des cellules cancéreuses in vitro, comme le micro-environnement influence à la fois la réponse aiguë et la rechute 5. Un des plus grands obstacles à l&#39;expliciter dans les voies de chimiorésistance in vivo est la complexité des interactions entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. En particulier, parce que les tumeurs solides ont établi un équilibre entre le cancer et les cellules stromales, des perturbations de l&#39;une des composantes, telles que la mort cellulaire qui se produit pendant le traitement anti-cancéreux, peut entraîner des effets dramatiques sur l&#39;organisation des tissus. La technique d&#39;imagerie intravitale fournie ici permet la visualisation directe des cellules cancéreuses-stroma interactions au sein des tumeurs de souris anesthésiées en direct, pendant le traitement avec des médicaments anticancéreux. Nous utilisons la microscopie confocale disque rotatif, qui a une profondeur de pénétration relativement limitée (voir 17 </sup&gt;), mais nos techniques chirurgicales et l&#39;étiquetage peut être utilisé avec d&#39;autres types de microscopie. Films acquises à partir de ces expériences peuvent être utilisés pour suivre les processus qui tient compte des fluctuations de l&#39;intensité de fluorescence (par exemple due à l&#39;infiltration d&#39;une population marquée ou l&#39;induction de la mort cellulaire), la motilité cellulaire, la distribution de produits injectables (par exemple pour suivre les fuites vasculaires), et co- localisation des signaux fluorescents 5,12,17,20. Nous souris d&#39;image systématiquement depuis plus de 6 heures et d&#39;imagerie également effectué pendant plus de 18 heures. Cela nécessite de maintenir en permanence les souris sous anesthésie pour ces longues périodes de temps. Avec une anesthésie adéquate, plus de 90% de nos animaux survivent à 6 heures, et environ 80% survivent plus de 18 heures. Détails sur la façon d&#39;effectuer une anesthésie à long terme ont déjà été publiés 19. Dans notre expérience, cinq facteurs sont essentiels: éviter l&#39;hypothermie, évitant la déshydratation, le maintien des taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, uchanter gaz porteur humidifié pour l&#39;isoflurane, et en gardant les animaux au plus bas niveau de l&#39;anesthésie au cours de laquelle ils ne montrent pas de signes de douleur. Pour maintenir la température du corps, nous gardons souris sous une couverture chauffante (à 38 ° C). Pour éviter la déshydratation, on injecte de petites quantités de solution saline ip tout au long de la procédure d&#39;imagerie. Afin de maintenir les taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, nous commençons avec 21% d&#39;oxygène dans le gaz porteur (plutôt que le couramment utilisé à 100%). Cela nous permet d&#39;augmenter les niveaux d&#39;oxygène en inhalation si une souris - heures dans une expérience - montre une diminution de la saturation en oxygène du sang. D&#39;après notre expérience, ce qui augmente les niveaux d&#39;oxygène inhalé au moment (par exemple 30-40%) presque toujours se stabilisera l&#39;animal permettant des heures d&#39;imagerie complémentaire. Le niveau optimal de l&#39;anesthésie est pour la plupart des souris obtenus avec 1-1,5% isoflurane et les résultats des taux de respiration et le pouls 60-65/min de 400-450/min. Dans nos expériences d&#39;imagerie, nous utilisons principalement le modèle de souris transgéniques (MMTV-C3 et PyMT [1]-Tag), dans laquelle les tumeurs sont multifocales, ce qui permet l&#39;imagerie des lésions multiples à différents stades de progression de la tumeur en parallèle à x, Y positions multiples au cours d&#39;une session de formation d&#39;image unique. Cela diminue préoccupations concernant la souris à la souris variation par rapport à des expériences visant à identifier dépendent du stade de réponses thérapeutiques et de réduire le nombre d&#39;animaux nécessaires pour l&#39;imagerie. Le modèle MMTV-PyMT (et d&#39;autres modèles de cancer spontané) passer par les étapes progressives histopathologiques qui peuvent être reconnus lors de l&#39;imagerie intravitale, bien que la mise en scène pathologique des lésions tumorales qui peuvent être faites lors de l&#39;imagerie intravitale est différent, et moins détaillé que celui de coupes histologiques 5,17. En revanche, les modèles de transplantation ont tendance à refléter les tumeurs à un stade avancé de mieux, que les cellules cancéreuses sont généralement isolés de tumeurs avancées. Ces modèles sont donc plus propice à l&#39;étude des tumeurs du stromainteractions des tumeurs à un stade avancé que les différences de ces interactions entre les différentes étapes. Nous montrons des exemples de la façon d&#39;images nucléaires changements structurels qui se produisent après la mort cellulaire induite par le traitement. En l&#39;absence de traitement anti-cancéreux, cette stratégie étiquetage peut être utilisé à la place de l&#39;image de la division cellulaire in situ, élucider, par exemple, comment la prolifération cellulaire et la dormance est influencé par le microenvironnement. À l&#39;avenir, le marquage fluorescent des composants mitochondriaux, il peut être possible de l&#39;image change mitochondriales qui se produisent pendant la mort cellulaire par apoptose. Dans ce protocole, nous avons également montré des exemples de la façon d&#39;images interactions cellulaires de cancer des cellules immunitaires après une thérapie, mais d&#39;autres composants du micro-environnement peuvent également être visualisés et imagée. Lignes existantes reporter transgéniques pour les composants du stroma comprennent ceux des fibroblastes (p. ex., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) ou les cellules du système vasculaire (par exemple Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravitale imagerie permet de visualiser en temps réel des interactions et des processus qui se déroulent dans l&#39;administration in vivo suivant la chimiothérapie. Avec la technologie actuellement disponible, nous avons fait de grands progrès dans la compréhension de la façon dont les cellules myéloïdes influencer la réponse thérapeutique, mais parce que le microenvironnement de la tumeur est si complexe, les progrès importants sont encore nécessaires pour commencer à creuser mécaniquement dans les processus sous-jacents à l&#39;environnement induite par la résistance aux médicaments. L&#39;un des progrès les plus importants restent nécessaires est l&#39;identification des meilleurs marqueurs de populations cellulaires spécifiques. L&#39;importance des meilleurs marqueurs est bien illustré avec deux des composantes les plus importantes de cellules stromales de la microenvironnement de la tumeur du sein, les fibroblastes et les cellules immunitaires. muscle lisse α-actine (αSMA) est fréquemment utilisé pour identifierfibroblastes, mais la protéine est également exprimée par les cellules musculaires lisses et les cellules myoépithéliales 24. Ainsi, bien que les souris journaliste αSMA-GFP existent, déterminer le type de cellule spécifique étant ci-après au cours d&#39;une expérience d&#39;imagerie intravitale est difficile. De même, un seul marqueur fluorescent tel que EGFP exprimée sous le promoteur de c-fms identifiera souvent multiples sous-populations de cellules immunitaires 12,17. Ainsi, bien que l&#39;on souhaiterait idéalement utiliser un marqueur unique pour identifier un type de cellule spécifique la complexité de la biologie sous-jacente constitue un défi majeur dans l&#39;utilisation de cette approche. Une solution partielle à ce problème est d&#39;utiliser des étiquettes injectables afin de mieux différencier les sous-populations de cellules exprimant le même journaliste fluorescent. Par exemple, les dextranes fluorescents sont prises par les macrophages et peuvent être utilisées pour marquer les sous-populations de macrophages qui sont marqués par le c-fms-EGFP et FSP1-EGFP souris transgéniques journaliste <sup&gt; 17. Anticorps conjugués à des sondes fluorescentes ont également été utilisés pour identifier les sous-populations spécifiques (par exemple, la population Gr1 positive des cellules myéloïdes marqués par le journaliste c-fms-EGFP 17). Contrairement aux courbes de réponse tumorale générés par étrier de mesure, qui ne fournissent que peu d&#39;informations sur la façon mécaniste ou pourquoi les tumeurs répondre à la thérapeutique administrée, ou d&#39;une série histologique provenant de tissus prélevés à différents moments qui nécessitent de grandes cohortes d&#39;animaux, notre technique permet une information directe et quantifiable sur la dynamique de la mort cellulaire et sur les interactions entre les cellules stromales de cellules cancéreuses dans de petites cohortes. Ainsi, l&#39;avantage d&#39;utiliser la procédure indiquée ici est qu&#39;il fournit des informations dynamiques sur les réactions aux médicaments dans le contexte d&#39;un microenvironnement de la tumeur intacte en temps réel. Ces informations peuvent conduire à des indications importantes sur les processus sous-jacents qui déterminent les réponses thérapeutiques 5 &lt;/ Sup&gt;.

Les tumeurs solides sont constituées de deux compartiments principaux: les cellules cancéreuses et les constituants du stroma (cellulaires et non cellulaires) qui aident à maintenir un environnement approprié pour la croissance tumorale 1. Ces constituants stromales jouent un rôle essentiel dans le développement, la progression et les métastases de nombreux types de cancers, y compris ceux de l&#39;2-5 du sein. Le milieu stromal influence également les réponses thérapeutiques 2,4,5. Ainsi, pour déterminer comment les cellules cancéreuses répondent pas aux thérapies conventionnelles et nouvelles dans le cadre du micro-environnement intact est important pour approfondir notre compréhension de la biologie du cancer et l&#39;amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles. En outre, la définition de la façon dont le cancer des cellules du stroma interactions changer à la suite de l&#39;administration de la thérapie est essentielle pour la compréhension de la biologie de récidive de la tumeur. Organotypiques systèmes de co-culture ont été utiles pour l&#39;étude des interactions stroma tumoral <sup&gt; 6, mais il est évident que les méthodes actuellement disponibles ne parvient pas à récapituler le microenvironnement de la tumeur intacte in vitro, en particulier en ce qui concerne la fonction vasculaire et le recrutement des cellules immunitaires. En effet, les réponses des cellules cancéreuses à des thérapies qui sont observés in vitro sont souvent très différentes de celles observées in vivo, où le micro-environnement est intact 5. Ainsi, dans des modèles in vivo pour l&#39;étude des interactions stroma tumoral et leur impact sur ​​la réponse thérapeutique peut mieux refléter les mécanismes cliniquement pertinentes 7. Les moyens primaires de l&#39;étude des réponses à la thérapie anticancéreuse in vivo ont été par des mesures de taille de la tumeur et l&#39;évaluation histologique des tissus provenant d&#39;animaux traités ou des patients. Cependant, les progrès de la microscopie et rapporteurs fluorescents au cours des deux dernières décennies ont permis la visualisation des processus inter-et intracellulaireà haute résolution dans les vivants, les animaux anesthésiés (intravitale imagerie) 8. Ces technologies de microscopie intravitale se sont avérés particulièrement précieux pour disséquer spatialement et temporellement dans la dynamique de l&#39;in vivo de tumeurs du stroma-interactions à résolution cellulaire et sub-cellulaire 8,9. Les processus qui ont été démêlé par imagerie intravitale comprennent une cytotoxicité anti-tumorale des cellules T 10,11, les interactions entre les cellules T et les cellules myéloïdes 12, la dynamique des changements dans la composition du collagène et de l&#39;organisation suite à un traitement thérapeutique 13, macrophages dépendant intravasation cellules cancéreuses et les métastases 14, 15 et la perméabilité vasculaire. Il ya trois exigences majeures pour l&#39;imagerie intravitale. Il s&#39;agit notamment de la préparation appropriée et l&#39;exposition des tissus pour l&#39;imagerie, le marquage fluorescent des composants du tissu d&#39;intérêt, et une paire de microscopie caméra système capable d&#39;acquérir des images 16. Les stratégies les plus couramment utilisées pour répondre à ces exigences comprennent: 1) les préparations hétérotopiques (par exemple, l&#39;inoculation de l&#39;orbitale oreille ou l&#39;œil), l&#39;imagerie permanente fenêtres, ou des préparations extériorisés (par exemple, lambeau de peau dorsale), 2) transgéniques fluorescents et des journalistes.. injectables fluorescentes pour étiqueter les composants tissulaires et 3) systèmes de microscopie confocale multiphotonique ou jumelé avec des tubes photomultiplicateurs ou Charge-Coupled Device (CCD), respectivement 9. Nous utilisons un modèle de peau chirurgicalement préparé rabat pour exposer la glande mammaire inguinale pour l&#39;imagerie chez les animaux anesthésiés qui expriment des transgènes codant rapporteurs fluorescents. Les images sont obtenues sur une période de 12 à 40 heures en utilisant un CCD intensifié (ICCD) couplé à une caméra quatre-système de disque laser microscope confocal filage 17. Imagerie de cette manière nous a permis d&#39;étudier des processus tels que la distribution de médicaments in vivo, le stade dépendant chemotherapeutic réponses, le type de mort cellulaire induite par la chimiothérapie, et le comportement des cellules myéloïdes 5. Nous fournissons un protocole pour l&#39;imagerie intravitale des réponses des cellules cancéreuses à la thérapie anticancéreuse et du stroma tumoral interactions dans les modèles murins de cancer du sein. Ce protocole peut être utilisé pour suivre les comportements et la mort des cellules cancéreuses deux et les composants du stroma avec une grande variété de transgéniques et injectables marqueurs fluorescents dans les deux modèles transgéniques et la transplantation pour des périodes allant jusqu&#39;à 40 heures en une seule séance d&#39;imagerie.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Fait maison </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, conjugué à la fluorescéine </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O (4 mg / ml, conserver à -20 ° C); diluer à 1 mg / ml dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Dextran 10 kD, Alexa Fluor 647-conjugué </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O (4 mg / ml, conserver à -20 ° C); diluer à 1 mg / ml dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de doxorubicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O et conserver à 4 ° C; diluer dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurane) </td><td> Alimentation Butler santé animale </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> L&#39;iodure de propidium </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; dilué 1:15 dans PBS x 1 </td></tr><tr><td> Azote </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxygène </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;aiguille conique régulière </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Les logiciels libres </td></tr><tr><td> Tampon imbibé d&#39;alcool </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% des tampons d&#39;alcool isopropylique </td></tr><tr><td> Système d&#39;anesthésie </td><td> Produits d&#39;imagerie moléculaire, Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Couverture en verre </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, 24x50 mm; désinfecter avec 70% d&#39;isopropanol lingettes </td></tr><tr><td> Éponges de gaze stérile (Curity) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Prénettoyé, sinon pré-nettoyage, désinfecter avec de l&#39;isopropanol 70% lingettes </td></tr><tr><td> Trempé ciseaux fins </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14090-11 </td><td> 2 paires; acier inoxydable, pointu pointus conseils, pointe droite, 26 mm de pointe, 11 cm de longueur </td></tr><tr><td> Couverture chauffante </td><td> Industries Gaymar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot stérilisateur à billes </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18000-45 </td><td> Mettez environ 30 min avant utilisation; stériliser les outils à&gt; 200 ° C pendant 30 secondes </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer Produits </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Bande de laboratoire (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bande de laboratoire (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Couvercle àune glacière en styromousse expédition </td><td></td><td></td><td> Il sera utilisé comme plate-forme chirurgicale </td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 dents, courbe légère, 0,8 mm de largeur pointe, 4 &quot;de longueur </td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dentelé, légère courbe, 0,8 mm Largeur de pointe; 4 &quot;Longueur </td></tr><tr><td> Microscope </td><td></td><td></td><td> Spinning disque confocale, XYZ Piezo stade, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Insert platine du microscope </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td></td><td> Fabriqué sur mesure, avec deux ports d&#39;imagerie circulaires </td></tr><tr><td> MouseOx oxymètre, des logiciels et des capteurs </td><td> STARR Sciences de la Vie </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene savoir Versi-Dry soakers laboratoire </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Coupez-les en quarts de queue plate-forme chirurgicale </td></tr><tr><td> Nébuliseur </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Utilisé pour humidifier les gaz; prévient les irritations des tissus pulmonaires </td></tr><tr><td> Slip-embout de la seringue jetable tuberculine (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo ensemble de perfusion à ailes </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra fine aiguille, 12&quot; de diamètre </td></tr><tr><td> Betadine pulvérisation </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Le micro-environnement tumoral joue un rôle essentiel dans l&#39;initiation de la tumeur, la progression des métastases, et la réponse aux thérapies anti-cancéreuses. En trois dimensions des systèmes de co-culture sont souvent utilisés pour expliquer la tumeur du stroma interactions, y compris leur rôle dans la réponse aux médicaments. Cependant, la plupart des interactions qui se produisent in vivo dans le microenvironnement intacte ne peut pas être complètement repris dans ceux-ci dans les paramètres in vitro. Ainsi, la visualisation directe de ces processus en temps réel est devenu un outil important dans la compréhension des réponses tumorales aux traitements et à identifier les interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma qui peuvent influencer ces réponses. Ici, nous fournissons une méthode pour utiliser la microscopie confocale à disque rotatif en direct, des souris anesthésiées d&#39;observer directement distribution de médicaments, les réponses des cellules cancéreuses et les changements dans les tumeurs du stroma-interactions après l&#39;administration d&#39;une thérapie systémique dans des modèles de cancer du sein. Nous décrivons les procédures de labeling composants tumoraux différents, le traitement des animaux pour l&#39;observation de réponses thérapeutiques et la procédure chirurgicale pour exposer les tissus tumoraux pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à 40 heures. Les résultats obtenus par ce protocole sont time-lapse films, dans lequel les processus tels que l&#39;infiltration de drogue, la mort des cellules cancéreuses et la migration des cellules stromales peuvent être évaluées en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image.

Nous décrivons une méthode d&#39;imagerie de la réponse à un traitement anticancéreux<em&gt; In vivo</em&gt; Et à la résolution de la cellule unique.

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

L’objectif global de cette procédure est de suivre en temps réel la pénétration d’un médicament et la réponse thérapeutique à l’administration d’un médicament thérapeutique. Ceci est accompli en traitant d’abord l’animal avec le médicament. Ensuite, la glande mammaire inguinale contenant la tumeur est exposée en créant un lambeau de peau.Ensuite, la souris est transférée au stade microscopique et la saturation en oxygène du sang et le pouls sont mesurés et une ligne à demeure pour l’administration de liquide et de médicament ou de colorant est insérée. Enfin, des images en accéléré sont acquises pour des analyses ultérieures. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des changements dans la mort cellulaire ou les interactions du stroma tumoral en réponse à un médicament grâce à la microscopie confocale à disque rotatif en direct de tumeurs mammaires de souris.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que la façon dont les différents composants du stroma d’une tumeur influencent la réponse au traitement. Avant de commencer, consultez le protocole écrit pour les calendriers typiques d’administration des médicaments et d’imagerie. Allumez un stérilisateur à billes chaudes et laissez-le atteindre au moins 200 degrés Celsius.Après avoir lavé les outils chirurgicaux à l’eau et au savon, y compris une paire de pinces à dents, une paire de pinces dentelées et deux paires de ciseaux, utilisez le stérilisateur à billes chaudes pour les stériliser pendant au moins 30 secondes. Ensuite, laissez-les. Refroidir. Placez un trempage de laboratoire sur le couvercle en polystyrène qui servira de plate-forme chirurgicale.Utilisez du ruban de laboratoire pour fixer un cône de nez avec une ligne au système d’anesthésie au trempage de laboratoire et une aiguille de calibre 18 sur un pouce et demi à travers le ruban dans le couvercle en polystyrène de chaque côté du cône de nez pour maintenir le cône de nez bien en place. Réservez la gaze stérile de bétadine. Deux lingettes isopropanol à 70 %, une lame de microscope, de la super colle et quatre morceaux de ruban de laboratoire d’un demi-pouce de large.Après avoir anesthésié l’animal dans une chambre d’induction, lorsqu’il respire profondément et lentement, transférez la souris sur la plate-forme chirurgicale, face ventrale vers le haut. Pour éviter une pression élevée, ouvrez la ligne d’anesthésie à la plate-forme chirurgicale, puis fermez la ligne d’anesthésie à la chambre d’induction. Réduire la concentration d’isoflurane de 4 % à 2,5 %Vérifiez que la profondeur de l’anesthésie est suffisante pour la chirurgie en effectuant un pincement des coussinets plantaires.Si l’animal ne réagit pas, utilisez quatre morceaux de ruban adhésif de laboratoire pour fixer ses membres à la plate-forme chirurgicale et utilisez un rasoir électrique pour retirer les poils de la surface ventrale. Utilisez des lingettes isopropanol à 70 %, suivies de bétadine appliquée sur de la gaze stérile pour désinfecter la surface ventrale de l’animal à l’aide de ciseaux et de pinces à dents. Faites une incision sous-cutanée de la ligne médiane ventrale à partir d’environ trois millimètres au-dessus de l’urètre jusqu’à l’apophyse xiphoïde.Prenez soin d’éviter de perforer ou de couper le péritoine avec les ciseaux et la pince dentée. Détaché doucement la peau de la cavité péritonéale avec la glande mammaire inguinale contenant la tumeur à imager Toujours attachée. Positionnez une lame de microscope en verre contre le rabat cutané de sorte que la majeure partie de la tumeur repose à plat une fois que la souris est placée sur la scène, et qu’elle ne soit pas obstruée par les membres postérieurs.Une fois que la lame de microscope a été correctement positionnée, utilisez de la super colle pour fixer la lame à la surface externe de la peau. Retirez le ruban de laboratoire qui fixe les membres de l’animal. Ouvrez la ligne d’anesthésie à la platine du microscope, puis fermez la ligne d’anesthésie à la plate-forme chirurgicale.Une fois que l’animal a été transféré, positionnez et fixez la ligne d’anesthésie et le cône nasal pour vous assurer que la souris reste anesthésiée et est dans une position confortable. Réduisez la concentration d’isoflurane à 1,5 %Exposez la tumeur de manière à ce qu’elle soit positionnée sur le dessus et au centre de l’un des ports d’imagerie recouverts de verre sur la platine du microscope. Insérez la ligne intrapéritonéale à demeure avec le dispositif de perfusion ailé attaché à la seringue d’un millilitre contenant une solution saline PBS stérile ou une solution saline avec de l’iodure de propidium.Lorsque la ligne intrapéritonéale est insérée, injectez à l’animal 100 microlitres de solution saline avec de l’iodure de propidium et continuez à injecter 50 microlitres de solution saline avec de l’iodure de propidium toutes les heures jusqu’à ce que la séance d’imagerie soit terminée. À l’aide des oculaires, vérifiez que la tumeur est correctement positionnée et doucement collée sur la lame de microscope et la ligne intrapéritonéale. La lame doit être fixée suffisamment lâchement pour que le flux sanguin vers les tissus ne soit pas obstrué.Le ruban adhésif de la lame de microscope permet de minimiser les artefacts d’imagerie introduits par la respiration de l’animal pour acquérir des images en accéléré. Utilisez le logiciel open source micromanager, compilez et analysez les données brutes à l’aide d’IRIS ou d’un autre logiciel d’analyse d’images. Les brins DExT conjugués par fluorescence peuvent être utilisés comme marqueur de substitution pour l’administration de médicaments dans les tissus.On voit ici l’arrivée de deux mégadaltons de dextran IV conjugués à une souris exprimant une protéine fluorescente bleue dans des cellules cancéreuses du sein. Après l’arrivée du médicament dans la tumeur, l’extravasation et la diffusion peuvent être imagées pour déterminer la demi-vie intravasculaire et la distribution du médicament. Ici, l’extravasation et la distribution de 10 kilodaltons de dextran IV conjugués à LOR injectés dans une souris exprimant une protéine fluorescente bleue dans les cellules cancéreuses du sein et une protéine fluorescente verte dans les cellules myéloïdes sont montrées.L’imagerie peut fournir des informations sur le type de mort cellulaire subie par les cellules cancéreuses. Ici, des changements nucléaires structurels indiquant une nécrose ou une apoptose sont observés chez une souris exprimant une protéine fluorescente verte conjuguée à son deux b. Après un traitement à la doxorubicine, la mort des cellules cancéreuses induite par la chimiothérapie entraîne souvent un recrutement réactif des cellules immunitaires dans les tumeurs.Voici un exemple de cette réponse stromale à un traitement aigu par la doxorubicine chez une souris exprimant des protéines fluorescentes bleues et vertes dans le cancer du sein et les cellules myéloïdes respectivement. En plus de visualiser la réponse stromale globale à la chimiothérapie, des réponses stromales spécialisées peuvent également être visualisées ici. La phagocytose du matériel cellulaire nécrotique par une cellule voisine est mise en évidence une fois maîtrisée.Cette technique peut être réalisée en 30 à 60 minutes et les animaux peuvent être imagés pendant 12 à 40 heures si elle est exécutée correctement.

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