Découpe au cryostat Communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des coupes transversales de communautés de levures afin d’examiner la distribution spatiale de différentes populations de cellules fluorescentes au sein d’une communauté. Ceci est réalisé en congelant d’abord la communauté, puis en la fixant à l’aide de méthanol pour préserver la distribution spatiale des cellules dans la communauté. Dans un deuxième temps, le méthanol est évaporé pour permettre la pénétration du composé OCT d’enrobage.

La communauté embarquée est ensuite congelée en vue de la cryosection. Ensuite, une cryo ome sections. La communauté et les coupes efficaces peuvent être imagées au microscope à fluorescence. On obtient des résultats qui montrent la distribution spatiale des populations de cellules fluorescentes au sein d’une communauté.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le sectionnement optique, est qu’elle révèle la distribution spatiale des populations au plus profond de ces communautés. Pour commencer cette procédure, faites croître les communautés de levures sur un filtre à membrane. Ce protocole correspond à une communauté typique de moins de deux fois 10 à huit cellules sur un filtre à membrane de six millimètres de diamètre puis dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Pour préserver un plus grand degré de fluorescence, utilisez un morceau de papier filtre watman 5 4 1 pour couvrir le bas d’un centimètre de diamètre. Eh bien, ce papier filtre est utilisé comme support pour transférer la communauté Dans les étapes ultérieures, ajoutez un millilitre de moins 20 degrés Celsius, 100 % méthanol dans le puits et laissez le puits à moins 20 degrés Celsius pour que la température s’équilibre. Maintenant, congelez la communauté de levures à l’aide d’une pince à épiler pour tremper le filtre à membrane avec la communauté dans de l’azote liquide pendant au moins 15 secondes.

Ensuite, transférez la communauté congelée dans le puits à moins 20 degrés Celsius. Le méthanol dans le congélateur garantit que la communauté est maintenue horizontale. Lorsque vous l’immergez dans le méthanol, attendez 20 minutes, le filtre à membrane commencera à se désintégrer dans le méthanol.

Après 20 minutes, transférez la communauté à l’aide du papier filtre Watman du puits de méthanol dans une boîte de Pétri froide maintenue à moins 20 degrés Celsius. Lors du transfert, gardez la communauté au-dessus du filtre Watman du porteur. Prélevez les gouttes supplémentaires de méthanol à l’aide d’un autre morceau de papier watman épais avant de le mettre dans la boîte de Pétri froide.

Cela garantira que le temps d’évaporation du méthanol est cohérent d’un échantillon à l’autre. Attendez quatre à six heures pour que le méthanol s’évapore. Mettre fin à l’évaporation au bon moment est crucial pour le succès de cette procédure.

Pour éviter de trop sécher l’échantillon, vérifiez périodiquement l’état de la communauté de levures pendant l’évaporation, pendant que le méthanol s’évapore. Fabriquez un récipient rectangulaire en papier d’aluminium cubique suffisamment grand pour que l’échantillon ait au moins deux marges d’environ deux millimètres de chaque côté. Ajoutez une goutte d’OCT au fond de ce récipient pour vous assurer que l’échantillon est entouré d’OCT de tous les côtés.

Une fois l’évaporation terminée, sortez l’échantillon du congélateur à moins 20 degrés Celsius. Coupez les parties du papier filtre non couvertes par la communauté des levures. Il est important d’effectuer cette étape rapidement.

Pour éviter de trop sécher l’échantillon. Placez la communauté sur la surface inférieure du récipient en papier d’aluminium et recouvrez immédiatement l’échantillon d’OCT à trois ou quatre millimètres au-dessus de la hauteur de la communauté. Attendez 10 minutes.

Enfin, placez l’échantillon incrusté dans l’OCT sur une plaque métallique sur de la glace sèche pour congeler et stockez les communautés congelées à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius. En préparation de la section des communautés congelées, réglez la température de la chambre de cryosection à moins 25 degrés Celsius. Laissez les échantillons dans la chambre jusqu’à ce que leur température atteigne la température de la chambre.

Retirez ensuite la feuille de l’échantillon et coupez l’excédent d’OCT. Appliquez une goutte d’OCT sur une monture cryogénique et montez l’échantillon sur la monture cryogénique. Étalez l’OCT uniformément sur le côté de l’échantillon avec du papier filtre watman exposé de sorte que l’épaisseur de l’OCT soit de deux à trois millimètres.

Le fait d’assurer une marge OCT de deux à trois millimètres sur tous les côtés de l’échantillon permet de préserver l’intégrité des sections. Laissez l’OCT geler à l’intérieur de la chambre du cryostat avant de le sectionner. Utilisez les côtés du bloc d’échantillon OCT pour aligner l’échantillon par rapport à la lame.

Si l’échantillon n’est pas aligné par rapport à la lame, la section commencera à partir d’un coin ou d’un côté de l’échantillon. Ajustez le support pour vous assurer que la lame coupe une face parfaitement verticale du bloc d’échantillon. Les sections typiques des communautés de levures ont une épaisseur d’environ 14 micromètres.

Après avoir coupé une section, utilisez une lame de microscope conservée à température ambiante pour recueillir la section. En déplaçant lentement la lame vers la section coupée, la section fondra et sera transférée au microscope. Glissez jusqu’à 18 sections peuvent être transférées sur une seule diapositive.

Stockez les lames à des températures froides, de préférence moins 20 degrés Celsius avant l’imagerie. La perte de signal est minime lorsqu’elle est maintenue pendant une semaine à quatre degrés Celsius pour un signal fluorescent maximal. L’imagerie doit être effectuée immédiatement après la section.

Des images représentatives de fluorescence de coupes efficaces verticales de communautés de levures cultivées dans des conditions identiques sont présentées ici. La communauté se compose de deux souches phototropes de visier marquées avec les protéines fluorescentes. La ceriserie M visualisée en rouge et Y-E-G-F-P visualisée en vert la concurrence pour les ressources partagées, y compris l’espace, conduit à des modèles colonnaires tels qu’ils sont affichés dans leurs sections efficaces verticales.

Les résolutions jusqu’à une seule cellule peuvent être résolues en coupes transversales. Cette figure compare les sections transversales obtenues avec la fixation au méthanol indiquée dans le panneau inférieur et sans fixation au méthanol représentée dans le panneau supérieur. Le signal fluorescent est préservé dans les sections de la communauté sans fixation, mais l’intégrité de la communauté est compromise.

En conséquence, certaines cellules flottent autour du bord de la section et le rendement global est inférieur à celui des communautés fixes. La fixation du méthanol maintient les cellules communautaires ensemble, mais provoque un rétrécissement observé dans la diminution de la hauteur de la communauté. Cette figure montre des coupes efficaces verticales représentatives en fond clair et en fluorescence d’une communauté de levures composée de deux souches protopiques de visier teed avec des protéines fluorescentes DS RED et YFP.

Les cellules situées au-dessus de la communauté forment une couronne qui semble distincte des cellules mères, caractérisée par une diffusion plus forte en fond clair et une fluorescence plus brillante. Ces modèles sont cohérents avec les modèles de différenciation rapportés dans les colonies de levures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la cryosection pour examiner les motifs spatiaux de fluorescence au sein des communautés de levures.