Name: Découpe au cryostat Communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez la cryodécoupe de communautés de levure pour observer la distribution spatiale des populations cellulaires fluorescentes. Cette méthode par fixation au méthanol préserve l'arrangement spatial pour l'imagerie en microscopie à fluorescence.

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Nous tenons à remercier Jonathan Cooper Lab au Fred Hutchinson Cancer Research Center for la permission d&#39;utiliser leur cryostat. Ce travail a été soutenu par le NIH et la WM Keck Foundation. BM est un garçon Gordon et Betty Moore Foundation de la recherche Sciences de la Vie. Nous sommes reconnaissants à Daniel Gottschling pour avoir partagé son protocole de fixation avec nous.

1. Fixation Communautés de levure <ol><li> Cultiver les communautés de levure sur une membrane (par exemple, filtre à membrane Millipore MF; figure 2A) de filtre. Ce protocole correspond à une communauté typique de moins de 2x10 8 cellules sur un filtre à membrane 6 mm de diamètre. </li><li> Utilisez un morceau de papier filtre Whatman 541 pour couvrir le fond d&#39;un 1 cm de diamètre ainsi (figure 2B). Ce papier Whatman sera utilisé comme support pour transférer de la communauté dans les étapes ultérieures. Ajouter 1 ml de méthanol à 100% pour le bien, et laisser le puits dans -20 ° C pour la température de s&#39;équilibrer. </li><li> Mettre N 2 liquide dans un vase de Dewar. Geler la communauté dans l&#39;azote liquide par immersion de la communauté pendant au moins 15 secondes dans de l&#39;azote liquide 2 en utilisant une pince à épiler (figure 2C). </li><li> Transfert communauté congelé pour le bien de -20 ° C méthanol (figure 2D). Assurez-vous que la communauté est maintenu à l&#39;horizontale lorsque l&#39;immerger dans le méthanol.Attendre 20 min. Le MF filtre à membrane commence à se désintégrer dans le méthanol. </li><li> Transfert communauté en utilisant le support papier filtre Whatman 541 du méthanol et d&#39;un plat froid de Pétri conservées à -20 ° C pour l&#39;évaporation du méthanol (figure 2E). Lors du transfert, de tenir la communauté au-dessus du porte-filtre Whatman et attirent des gouttes supplémentaires de méthanol en utilisant un autre morceau de papier Whatman épaisse avant de mettre dans le plat froid de Petri. Cela permettra d&#39;assurer que les temps d&#39;évaporation est constante d&#39;un échantillon à l&#39;. </li><li> Attendez 4-6 heures pour l&#39;évaporation jusqu&#39;à ce que le porte-filtre Whatman paraît sèche. Évaporation insuffisante laisse méthanol résiduel qui interfère avec la coupe. Au cours de séchage des fissures et des déformations des causes dans les communautés. </li><li> Prélever l&#39;échantillon de -20 ° C congélateur. Coupez Whatman 541 papier filtre ne sont pas couverts par la communauté. </li><li> Faire un cube rectangulaire contenant une feuille d&#39;aluminium qui est suffisamment grande de telle sorte que l&#39;échantillon comporte au moins marge ~ 2 mm à partir dechaque côté (figure 2F). Placez la communauté sur la surface inférieure de la feuille d&#39;aluminium contenant; couvrir immédiatement l&#39;échantillon avec OCT pour 3 ~ 4 mm plus haut que communauté. Si importante, l&#39;orientation de l&#39;échantillon peut être ajustée dans cette étape par rapport aux côtés du récipient. Attendre 10 min. </li><li> Placer l&#39;échantillon OCT-embarqué sur une plaque métallique sur la glace sèche à geler. Stocker les communautés congelés à -20 ° C ou -80 ° C congélateur. </li></ol> 2. Sectionnement Communautés surgelés pour imagerie par fluorescence <ol><li> Régler la température de la chambre cryosection à -25 ° C et laisser les échantillons dans la chambre jusqu&#39;à ce que sa température atteigne la température de la chambre. </li><li> Monter l&#39;échantillon sur un cryo-fixation après application d&#39;une baisse de l&#39;OCT sur la montagne. Étaler uniformément octobre sur le côté de l&#39;échantillon avec exposés papier filtre Whatman (fond du récipient) de sorte que l&#39;épaisseur OCT est de 2-3 mm. Laissez-gel octobre intérieur de la chambre du cryostat avant soictioning. Assurer une marge PTOM de 2-3 mm sur tous les côtés de l&#39;échantillon permet de préserver l&#39;intégrité des sections. </li><li> Les côtés du bloc échantillon OCT peut être utilisée pour aligner l&#39;échantillon. Si l&#39;échantillon n&#39;est pas alignée par rapport à la lame, la coupe commence à partir d&#39;un coin ou un côté de l&#39;échantillon. Régler le montage de sorte que la lame coupe une parfaitement vertical (ou horizontal) de la surface du bloc à échantillons. </li><li> Sections typiques pour les communautés de levure sont ~ 14 um d&#39;épaisseur. Après avoir coupé une section, utilisez une lame de microscope conservé à température ambiante pour collecter le texte, par approchant lentement le curseur vers la section de coupe. La section va fondre et transférer à la lame de microscope. Jusqu&#39;à 18 articles peuvent être transférés sur une glissière. </li><li> Stocker les diapositives à des températures froides, de préférence à -20 ° C, avant d&#39;imagerie. Perte de signal est minime lorsqu&#39;il est conservé pendant une semaine à 4 ° C. Pour le signal de fluorescence maximale, l&#39;imagerie est de préférence effectuée immédiatement après la coupe. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La procédure présentée ici offre un moyen d&#39;inspecter la structure interne des communautés de levure. L&#39;étape de fixation méthanol rend la colonie de levure rigide 8 et préserve l&#39;intégrité de la colonie, mais il provoque aussi le point 8 de retrait qui doit être pris en compte dans l&#39;interprétation des résultats. Nous observons habituellement autour de 30% de rétrécissement dans la hauteur de colonies de levures, par rapport aux colonies directement intégrés dans un PTOM, sans fixe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Le méthanol 100% </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek composé OCT </td><td> Andwin scientifique </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman grade n ° 541 Papier filtre quantitatif </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF filtre à membrane </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

découpe au cryostat communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Les microbes vivent généralement dans les communautés. L&#39;organisation spatiale des cellules à l&#39;intérieur d&#39;une communauté est censé avoir un impact sur ​​la survie et la fonction de la communauté 1. Techniques optiques de sectionnement, y compris la microscopie confocale et biphotonique, se sont avérées utiles pour observer l&#39;organisation spatiale des communautés bactériennes et Archaea 2,3. Une combinaison de la microscopie confocale et sectionnement physique de colonies de levures a révélé organisation interne des cellules 4. Cependant, directe sectionnement optique en utilisant la microscopie confocale ou à deux photons a été seulement en mesure d&#39;atteindre quelques couches cellulaires profondes dans les colonies de levures. Cette limitation est probablement en raison de forte diffusion de la lumière à partir de 4 cellules de levure. Ici, nous présentons une méthode basée sur la fixation et découpe au cryostat à obtenir la distribution spatiale des cellules fluorescentes au sein des communautés de Saccharomyces cerevisiae. Nous utilisons le méthanol comme agent fixateurà préserver la répartition spatiale des cellules. Communautés fixes sont infiltrés par composé OCT, congelés et cryosectioned dans un cryostat. L&#39;imagerie par fluorescence des sections révèle l&#39;organisation interne des cellules fluorescentes sein de la communauté. Des exemples de communautés de levures consistant en souches exprimant rouges et verts protéines fluorescentes en évidence les potentialités du procédé découpe au cryostat pour révéler la distribution spatiale des cellules fluorescentes ainsi que celui de l&#39;expression des gènes dans les colonies de levure 2,3. Même si notre accent a été mis sur les communautés de Saccharomyces cerevisiae, la même méthode peut potentiellement être utilisée pour examiner les autres communautés microbiennes.

Images de fluorescence des coupes verticales des communautés de levure contenant rouges et verts marqués populations compétitifs 6 sont représentés à la figure 3. Ces communautés sont constituées de deux souches de levure prototrophes et leur concurrence pour les ressources partagées, y compris l&#39;espace, conduit à colonnes modèles 7, tel qu&#39;il apparaît dans les coupes verticales. Résolutions allant jusqu&#39;à une seule cellule peut être résolu en sections. Figure 3...

Nous présentons un protocole de congélation et de découpe au cryostat communautés de levure pour observer les modèles internes de cellules fluorescentes. La méthode repose sur la fixation et le méthanol octobre-enrobage à préserver la répartition spatiale des cellules sans inactivation des protéines fluorescentes dans une communauté.

Découpe au cryostat Communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des coupes transversales de communautés de levures afin d’examiner la distribution spatiale de différentes populations de cellules fluorescentes au sein d’une communauté. Ceci est réalisé en congelant d’abord la communauté, puis en la fixant à l’aide de méthanol pour préserver la distribution spatiale des cellules dans la communauté. Dans un deuxième temps, le méthanol est évaporé pour permettre la pénétration du composé OCT d’enrobage.La communauté embarquée est ensuite congelée en vue de la cryosection. Ensuite, une cryo ome sections. La communauté et les coupes efficaces peuvent être imagées au microscope à fluorescence. On obtient des résultats qui montrent la distribution spatiale des populations de cellules fluorescentes au sein d’une communauté.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le sectionnement optique, est qu’elle révèle la distribution spatiale des populations au plus profond de ces communautés. Pour commencer cette procédure, faites croître les communautés de levures sur un filtre à membrane. Ce protocole correspond à une communauté typique de moins de deux fois 10

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