Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Cette expérience surveille la rupture de l’AV provoquée par des agents pathogènes intracellulaires dans des cellules individuelles. Chargez d’abord les cellules avec le colorant CCF 4:00 AM, qui est clivé par des estérases cellulaires. Ensuite, préparez et appliquez les neurobactéries FL sur le CCF, quatre cellules chargées incubent les cellules à 37 degrés Celsius pour l’invasion bactérienne des cellules hôtes.

Déterminez ensuite le rapport des intensités émises dans les canaux de 450 nanomètres et de 535 nanomètres. Les résultats montrent la présence d’agents pathogènes dans le cytosol en raison de son adaptabilité à des lys à haut débit. Cette technique facilite l’identification de nouveaux antibiotiques en s’attaquant à un problème clé de localisation subcellulaire des bactéries lors des interactions avec les agents pathogènes de l’hôte.

Avec mon collègue Tran Vanu, nous nous sommes intéressés à développer des approches pour examiner les agents pathogènes intracellulaires avec une résolution temporelle élevée. Cela a conduit à la mise en place du test de rupture oculaire régulière CCF quatre bétalactamase. Aujourd’hui, cette approche sera présentée expérimentalement par deux étudiantes diplômées du laboratoire, Nora MellU et Charlotte Keller Inoculer les souches bactériennes de type sauvage et mutantes dans huit millilitres de TCSB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, placez les cultures dans un agitateur à 37 degrés Celsius, puis ensemencez cinq fois 10 à la troisième cellule hela par puits.

Dans 100 microlitres de DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal 1 % de culture de streptomycine de pénicilline, les cellules dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone le lendemain sous-cultivent les bactéries à une dilution d’un 100e dans TCSB complétée par 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline se développent dans un agitateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures et demie. Maintenant, pour charger les cellules ela, préparez le colorant CCF 4:00 AM dans un tampon em, lavez les cellules une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 25 microlitres de mélange de chargement CCF 4:00 AM par puits à température ambiante dans l’obscurité pendant deux heures et 30 minutes pour préparer les bactéries pour l’infection granule un millilitre de culture par centrifugation après un lavage avec 500 microlitres de PBS Resus, suspendez les bactéries dans 500 microlitres de PBS complétés par 10 microgrammes par millilitre de polyol lysine et 40 microgrammes par millilitre de bêta-lactamase.

Incuber pendant 10 sur une roue rotative à température ambiante, puis laver une fois avec 500 microlitres de PBS et remettre en suspension chaque pastille bactérienne dans 500 microlitres d’un probénécide millimolaire dans un tampon EM laver les cellules une fois avec 150 microlitres d’un prob millimolaire dans un tampon em. Ensuite, diluez 10 microlitres de bactéries dans 100 microlitres d’une solution sondée millimolaire et distribuez-la dans chaque puits de cellules héla. Après 15 minutes d’incubation dans l’obscurité à température ambiante, transférez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Lavez une fois avec 150 microlitres d’une solution probit millimolaire. Ensuite, fixez les échantillons avec 50 microlitres d’aldéhyde paraforme à 4 % dans une solution Pro millimolaire pendant 10 minutes dans l’obscurité Après un lavage avec la solution de probénécide, ajoutez 30 microlitres de colorant nucléaire 10 micromolaires drac cinq pour une segmentation cellulaire optimale. Incuber les cellules pendant 30 minutes, les laver une fois et ajouter 100 microlitres d’une solution millimolaire pour acquérir des images à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversée.

Utilisez une longueur d’onde d’excitation à 405 nanomètres. Détectez les émissions à l’aide de filtres de 450 nanomètres et de 535 nanomètres en utilisant des temps d’exposition de cinq millisecondes pour la lumière transmise. 1000 millisecondes pour 535 nanomètres et 500 millisecondes pour 450 nanomètres.

L’utilisation d’un dispositif d’étalonnage de focale couplé à la microscopie automatisée permet l’acquisition simultanée de dizaines de positions différentes dans plusieurs puits. Si vous utilisez un microscope confocal, utilisez des temps d’exposition de 240 millisecondes à 450 nanomètres, 360 millisecondes à 535 nanomètres pour le laser de 405 nanomètres et 640 millisecondes pour le laser de 640 nanomètres. Analysez les données à l’aide d’un algorithme informatique qui permet de noter automatiquement le signal fluorescent pour chaque cellule individuelle.

Par exemple, utilisez des logiciels tels que metamorph et acapella pour créer un script permettant de mesurer le rapport entre les signaux d’émission de 450 nanomètres et de 535 nanomètres. Pour ce test, commencez une culture HELOC avec deux fois 10 à la cinquième cellules dans un volume final de deux millilitres. Préparez les bactéries pour l’infection et chargez les cellules hela avec CCF 4:00 AM Disposez un microscope convo avec un objectif à air N plan à l’intérieur d’une chambre de chauffage à 37 degrés Celsius.

Réglez le laser 405 nanomètres et l’émission via des filtres 450 nanomètres et 535 nanomètres. Entrez également des temps d’exposition de cinq millisecondes pour la lumière transmise. 200 millisecondes pour 535 nanomètres et 100 millisecondes pour 450 nanomètres.

Réglez l’acquisition des données toutes les 90 secondes sur 60 minutes. Maintenant, lavez les cellules une fois avec deux millilitres d’une solution millimolaire de probénécide. Ajoutez deux millilitres d’un millimolaire prob dans un tampon em.

Montez ensuite la parabole sur la platine du microscope et commencez l’acquisition au bout de six minutes. Mettez l’acquisition en attente. Ajoutez 250 microlitres de bactéries en suspension sur les cellules et redémarrez l’acquisition pour l’analyse post-acquisition.

Visualisez des films à l’aide de Velocity metamorph ou d’image J.Obtenez des rapports d’intensité de 450 à 535 nanomètres pour chaque cellule individuelle. L’approche de la bêta-lactamase CCF 4:00 AM est une méthode robuste et sensible pour suivre la rupture ularique d’agents pathogènes intracellulaires tels que le gel flexneri lors d’une infection par cellules HELOC. Avec la sonde non invasive BS 176 AFA une souche pendant une heure, la sonde CCF à quatre frettes reste intacte et émet un signal vert.

En revanche, la souche virulente M 90 TFA I bascule le signal vers le bleu compatible avec le clivage de la sonde dans le cytosol pour la détermination du rapport signal métrique. Nous avons développé un script pour les logiciels metamorph et acapella afin d’automatiser la détection des cellules et les mesures dans les canaux de 535 et 450 nanomètres. Les noyaux et le cytosol des cellules sont segmentés à l’aide du canal DR cinq.

Ensuite, l’algorithme est capable de détecter et de quantifier les populations de cellules positives de 450 nanomètres et de 535 nanomètres. Les rapports moyens calculés sont faibles pour la souche mutante et élevés pour la souche virulente. Les expériences peuvent être réalisées sur différents types de cellules humaines comme les cellules épithéliales de Gila et les cellules de type macrophage THP.

Les deux types de cellules réagissent à la souche virulente M 90 T AFA one cha en faisant passer le signal émis du vert au bleu sous l’infection. Avec la souche non invasive, le signal vert persiste à quantifier à l’aide d’un script développé sur un logiciel métamorphe et une macro développée dans Excel présente des histogrammes de rupture oculaire en fonction de la distribution cellulaire. La méthode peut être adaptée avec succès pour comprendre l’infectiosité de différentes bactéries.

Par exemple, cet ensemble de données montre mycobacterium Bovis. Le BCG réside dans le phagosome pendant toute la durée de l’expérience, comme le montre le signal vert persistant. En revanche, mycobacterium tuberculosis provoque une rupture de la membrane vaga-omique dans les macrophages THP un après sept jours d’infection, comme le met en évidence l’apparition d’un signal de 450 nanomètres après sept jours d’infection en utilisant le même algorithme.

En ce qui concerne l’étude de la rupture valaire par Ella, nous avons constaté que les cellules infectées par mycobacterium tuberculosis présentent des rapports nanométriques plus élevés de 450 à 535 que le BCG de mycobacterium bovis après sept jours d’infection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la rupture ulaire par des agents pathogènes avec le dosage de la bétalactamase CCL Une fois maîtrisé, ce protocole peut être effectué en quatre heures, mais n’oubliez pas que vous devez ajouter du processus dans chaque tampon tout au long du protocole. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie électronique ou le fractionnement membranaire, est qu’elle peut être réalisée en temps réel sans aucun traitement biochimique.

D’autres analyses, telles que le marquage de l’actine ou le test de protection contre la gentamicine, peuvent être effectuées afin d’évaluer l’absorption et la prolifération des bactéries dans les cellules hôtes.