Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l'embryon de poulet

L’objectif global de cette procédure est d’étiqueter des sous-ensembles spécifiques de neurones dans le cerveau postérieur du poussin et de tracer leurs trajectoires axonales et leurs cibles. Ceci est accompli en ouvrant d’abord une petite fenêtre ovale au centre d’une journée embryonnaire.2.75. Les plasmides d’ADN de l’œuf sont injectés dans la lumière du cerveau postérieur.

Ensuite, le cerveau postérieur est électroporé unilatéralement pour permettre l’expression des constructions dans le groupe neuronal souhaité et les ovules incubés. Enfin, le tronc cérébral est disséqué de l’embryon entier pour une préparation à plat ou une section tissulaire. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des projections axonales et des cibles synaptiques dans le postérieur, le cerveau et le cervelet à divers stades de développement grâce à la coloration immunofluorescente et à l’analyse microscopique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement, telles que la façon dont des cellules neuronales spécifiques projettent leurs axones et forment des connexions synaptiques au cours du développement embryonnaire. Pour se préparer à l’électroporation, incubez-les à 37 à 38 degrés Celsius et demi pendant 65 à 70 heures jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade 16 à 17. Pendant que les œufs couvent, des capillaires en verre soutirent des électrodes dorées en forme de L pliées avec un support adaptateur au narrateur d’impulsions.

Réglez les paramètres d’électroporation sur 25 volts, cinq nombres d’impulsions, une durée d’impulsion de 45 millisecondes et 300 intervalles d’impulsions. Préparez une pipette buccale, une seringue de 10 millilitres, une aiguille Paraform, des bandelettes, une brosse douce, des ciseaux de dissection tranchants et 25 millilitres de PBS stérile. Préparez un mélange adéquat de plasmides d’ADN et ajoutez un colorant vert rapide pour visualiser l’ADN injecté.

Lorsque les œufs ont atteint le stade de développement approprié, retirez-les de l’incubateur et maintenez-les en position horizontale. Utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les coquilles d’œufs. Manipulez un œuf à la fois pour minimiser l’exposition embryonnaire.

Il est temps d’aérer avec la pointe des ciseaux. Faites un trou au niveau du pôle de l’œuf et avec la seringue, retirez trois à quatre millilitres d’albumine. À l’aide des ciseaux de dissection, ouvrez une petite fenêtre ovale au pôle horizontal supérieur de la coquille de l’œuf.

Pendant tout le processus, versez quelques gouttes de PBS sur l’embryon pour éviter la sécheresse. À l’aide d’une pipette buccale, chargez une petite quantité du mélange d’ADN dans le capillaire en verre. Ensuite, placez l’embryon avec son extrémité postérieure vue indirecte.

Ensuite, en tenant le capillaire à environ 45 degrés, pénétrez le cerveau postérieur du dorlot. N’enlevez aucune membrane autour de l’embryon sans former de bulles d’air. Expirez avec précaution pour injecter la solution d’ADN dans la lumière du cerveau postérieur.

La solution se répandra vers l’avant immédiatement après l’injection d’ADN. Placez les électrodes parallèles aux positions précises du cerveau postérieur AP et DV ciblés. Sans toucher le cœur, poussez légèrement les électrodes ventralement et pulsez l’électro.

Les électrodes doivent être recouvertes de bulles pour indiquer la conductivité électrique, retirer soigneusement les électrodes et verser quelques gouttes de PBS pour refroidir l’embryon et éliminer les bulles. Utilisez une bande de perfil pour sceller correctement l’ouverture de l’œuf afin d’éviter le dessèchement pendant l’incubation avec une brosse douce et un lavage PBS des électrodes, placez l’œuf dans l’incubateur pendant la durée souhaitée. La survie des embryons est d’environ 90 % deux à trois jours après l’électroporation et diminue jusqu’à 50 % 12 jours après l’électroporation.

Pour faire des préparations plates du cerveau postérieur, disséquez soigneusement l’embryon, en le séparant des membranes et des vaisseaux sanguins environnants. Placez l’embryon dans une petite boîte de Pétri recouverte de silicone contenant du PBS, l’embryon étant orienté vers le dos. Utilisez des broches en tungstène pour le fixer au plat.

Puis à l’aide d’un capillaire en verre tranchant. Faites une fente dorsale dans la plaque de toit du cerveau postérieur avec une pince à épiler pointue et des micro-ciseaux. Tenez la partie supérieure de la tête et tirez très soigneusement le tissu cérébral postérieur du rostral au pied.

Après la séparation du cerveau postérieur, retirez les tissus ventraux restants. Incuber le cerveau postérieur dans une solution d’aldéhyde paraforme à 4 % ou de PFA pendant une à deux heures à température ambiante. Ensuite, lavez-le avec du PBT pour éliminer le PFA.

Après avoir suivi la préparation d’immunofluorescence décrite dans le protocole textuel, placez le cerveau postérieur face à l’arrière vers le dos sur une lame de verre. Ajoutez un produit de montage fluorescent sur le cerveau postérieur et utilisez des capillaires en verre ou des aiguilles en tungstène pour aplatir le cerveau postérieur sur la lame. Ajoutez une petite quantité de graisse à chaque coin pour éviter que le mouchoir ne soit comprimé par la lamelle.

Placez soigneusement une lamelle sur le dessus du cerveau postérieur en évitant les bulles d’air pour l’adhérence. Ajoutez du vernis à ongles sur les bords du verre de couverture. Des sections cryogéniques du tronc cérébral peuvent être effectuées à n’importe quel stade de développement, mais après E 6,5.

Ils devraient être la méthode préférée en raison de la difficulté à visualiser les axones dans l’embryon monté à plat, qui devient très épais. De plus, la mise en évidence de la synapse nécessite une section du tissu et une vue à fort grossissement au microscope. Pour préparer un échantillon pour la cryosection, disséquez l’embryon et retirez tous les tissus entourant le cerveau.

Rincer au PBS. Ensuite, utilisez des micro-ciseaux et une pince à épiler pointue pour couper l’embryon dans la région du dorlotement de la moelle. Faites une large incision entre le cervelet et le mésencéphale et retirez tout le tronc cérébral.

Le tissu doit contenir le pylône rachidien et le cervelet. Dans l’exemple suivant, un élément amplificateur qui est exprimé dans le sous-groupe DA un d’interneurones dans le cerveau postérieur témoin a été cloné en amont de la recombinase Cree et co-électroporé avec un plasmide rapporteur de GFP cytoplasmique dépendant de Cree. Une préparation de montage plat au stade E 4.5 révèle deux modèles de projection axonale ascendante controlatérale pour cartographier les projections axonales de DA un interneurone aux stades ultérieurs du développement.

Une cassette de reporter GFP inconditionnel pré-con a été clonée entre deux bras superposés, ainsi que le vecteur d’amplification et de transposition A TOH one. En utilisant cette stratégie, la MG FP électroporée C précon conditionnelle est intégrée dans les chromosomes du poulet et, par conséquent, la cassette stop n’est retirée que dans les neurones D, ce qui permet une expression prolongée de la GFP. Dans DA une cellule.

La forme mésylée de la GFP l’attache à la membrane de sorte qu’elle est localisée le long de la membrane axonale plutôt que d’être diluée dans le cytoplasme. Dans les tiges cérébrales collectées à E 13,5 et analysées en coupes sagittales. On a constaté que les axones DA one s’accumulent dans le cervelet et s’étendent vers la couche granulaire externe ou EGL, qui est marquée par des cellules positives ZI.

Les cibles synaptiques des axones D one dans le cervelet ont également été analysées. Les embryons E 2.75 ont été électroporés avec le plasmide rapporteur de la protéine de la vésicule synaptique, ainsi qu’un amplificateur de cri H one et les transposes superposées. Cette méthode permet l’expression du rapporteur GFP dans la terminaison axonale présynaptique DA

Le cervelet a été sectionné à E 13,5 et coloré avec le marqueur présynaptique général synaptique taman, ainsi qu’avec de la calbindine qui marque la couche du bikini. Une vue à fort grossissement de la coupe montre que SV a deux vésicules synaptiques GFP positives dans plusieurs régions cérébelleuses, y compris la couche bikini. Ce résultat révèle les connexions synaptiques de DA un cerveau postérieur dans les interneurones du cervelet.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’électro-opérer l’ADN dans le Hein aviaire au deuxième jour embryonnaire point 75 afin de marquer spécifiquement un sous-ensemble de cellules neuronales. Cette procédure permet de suivre les projections axonales et les connexions synaptiques des cellules neuronales marquées à plusieurs stades de développement.