Méthodes d'enregistrement multi-unités pour caractériser l'activité neuronale dans le Criquet ( Schistocerca americana Circuits olfactifs)

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer l’activité neuronale multi-unités révoquée par l’odeur des trois premiers centres de traitement du signal de la voie olfactive de l’insecte. Pour ce faire, il suffit d’abord de retenir un criquet dans une chambre conçue sur mesure et de stabiliser l’une de ses antennes pour les enregistrements électrophysiologiques. La deuxième étape consiste à fabriquer une micro-électrode en verre et à l’insérer à la base d’un soleil pour surveiller les réponses évoquées par les odeurs.

Ensuite, pour enregistrer l’activité neuronale du cerveau de sauterelle. Une procédure de dissection en plusieurs étapes est suivie pour exposer le tissu neural, qui traite l’entrée des neurones sensoriels olfactifs. La dernière étape consiste à placer correctement les réseaux de multi-électrodes pour enregistrer l’activité neuronale de l’ensemble du lobe du criquet et de l’antenne et du corps du champignon.

En fin de compte, les méthodes d’enregistrement extracellulaire démontrées ici sont utilisées pour caractériser les réponses évoquées par les odeurs dans les trois premiers centres de traitement le long de la voie olfactive des insectes. Bien que cette méthode ait été utilisée pour caractériser la réponse neurologique évoquée par l’odeur dans un système olfactif invertébré relativement simple, elle peut également être adaptée pour examiner l’activité d’ensemble dans d’autres systèmes neuronaux. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certains aspects clés de cette procédure, tels que le placement des électrodes et certaines étapes de dissection, sont très difficiles à apprendre.

De plus, les méthodes sont principalement qualitatives et différents laboratoires l’ont perfectionnée différemment au fil du temps. Pour commencer cette procédure, choisissez un jeune criquet adulte de l’un ou l’autre sexe avec des ailes complètement développées, mais avant le stade de l’accouplement, dans une colonie surpeuplée. Ensuite, retenez le criquet en amputant ses pattes.

Scellez les sites d’amputation avec un adhésif tissulaire. Ensuite, fixez le criquet dans la chambre conçue sur mesure avec un petit morceau de ruban électrique drapé autour de son thorax. Sous un microscope de dissection, faites une rainure peu profonde dans la plate-forme de cire pour le placement de l’antenne.

Placez l’antenne dans la rainure et stabilisez-la à l’aide de cire de bati aux deux extrémités de l’antenne. Après cela, insérez une électrode de terre dans le thorax. Utilisez de la cire Batik pour sceller le site d’incision et pour maintenir le fil de terre en place.

Ensuite, placez l’antenne stabilisée du criquet sous un stéréomicroscope sur une table d’isolation des vibrations. Connectez les conduites de sortie des bouteilles d’odeur au tube de diffusion d’odeur. Positionnez le tube de diffusion des odeurs à quelques centimètres de l’antenne Les vapeurs odorantes délivrées sont évacuées par un entonnoir à vide, placé à environ 10 centimètres derrière l’antenne criquet.

Ensuite, fabriquez des électrodes en verre à l’aide d’une fraise capillaire en verre silicique avec une micro-pipette polaire, remplissez l’électrode en verre avec une solution saline de criquet. Ensuite, placez l’électrode en verre dans un porte-micro-pipette fixé à un micromanipulateur motorisé. Assurez-vous que la base de la synthèse d’enregistrement est clairement visible au microscope.

Insérez doucement l’électrode dans la base d’un syn. Par la suite, amplifiez le signal 10 000 fois. À l’aide d’un amplificateur AC.

Filtrez le signal entre 0,3 et 10,0 kilohertz et acquérez-le à une fréquence d’échantillonnage de 15 kilohertz. À l’aide d’un système d’acquisition de données, lorsque l’électrode est positionnée de manière appropriée, une activité neuronale spontanée peut être détectée. Les réponses évoquées par stimulus peuvent être surveillées en délivrant une impulsion d’odeur à travers le tube de diffusion d’odeur.

Positionné près de l’antenne et suivant le changement de l’activité extracellulaire, les procédures de contention décrites précédemment ont été suivies. Placez le criquet dans une chambre conçue sur mesure. Commencez le processus de dissection en construisant une tasse de cire autour de la tête de sauterelle.

Construisez deux tours de cire de chaque côté de la tête de criquet, atteignant jusqu’à la hauteur des antennes. Ensuite, insérez chaque antenne dans un petit morceau de tube en polyéthylène bien ajusté dans un joint en caoutchouc. Fixez ensuite les joints aux tours de cire de sorte que le tube en plastique puisse glisser librement vers ou loin de la base des antennes tout en empêchant les antennes de bouger.

Ensuite, au microscope, commencez à construire une tasse de cire autour de la tête de criquet pour permettre la perfusion saline pendant et après la procédure de dissection. La tasse de cire doit commencer juste au-dessus des pièces buccales, englober les deux tours de cire et s’étendre au-delà des yeux composés. Une fois que la tasse de cire est entièrement construite, fixez la base d’une antenne à l’extrémité inférieure du tube en plastique à l’aide de résine époxy.

Cela garantira que les antennes sont maintenues en place même après l’élimination de la cuticule environnante. Gardez le gobelet de cire rempli de solution saline à partir de ce moment. Maintenant, retirez la région rectangulaire centrale entre les deux.

Une antenne. Par la suite, retirez la cuticule dans les régions voisines sans déranger les yeux composés ou la cuticule à la base des antennes. À l’aide de pinces fines, retirez délicatement les sacs d’air et les corps adipeux entourant le cerveau.

La cervelle de criquet devrait maintenant être clairement visible. Les régions cérébrales qui traitent l’information olfactive sont situées entre les deux. Une antenne tire doucement le ventre et le coupe à l’aide de ciseaux fins.

Retirez ensuite les ailes et faites une petite incision dans l’abdomen juste au-dessus du rectum. Retirez l’intestin en tirant sur l’intestin postérieur à l’aide d’une pince grossière. Cette étape permet de s’assurer que le mouvement de l’intestin ne déstabilise pas la préparation.

Pour éviter les fuites salines. Attachez l’abdomen juste en avant du site d’incision avec des fils de suture. Ensuite, utilisez une petite plate-forme faite d’une fine boucle de fil recouverte d’une fine couche de cire pour élever le cerveau et le stabiliser pour l’électrophysiologie.

Le cerveau est protégé par une gaine semi-transparente, qui doit être retirée avant les enregistrements. Pour affaiblir la gaine, égouttez partiellement la tasse de cire et étalez soigneusement une petite quantité de protéase sur la surface du cerveau. Après environ cinq à 10 secondes d’application d’enzymes, rincez abondamment le cerveau avec une solution saline.

Ensuite, pincez très doucement et tirez la gaine vers le haut avec une pince super fine pour l’ouvrir et exposer les sites d’enregistrement. Dans cette procédure, placez la préparation acridienne sous un microscope stéréoscopique sur une table d’isolation des vibrations. Maintenez un taux de perfusion saline constant d’environ 40 millilitres par heure.

Tout au long de l’expérience, utilisez un fil d’argent chloré immergé dans le gobelet de cire rempli de sérum physiologique comme électrode de terre. Préparez la configuration de distribution des odeurs de la même manière que pour l’expérience d’enregistrement d’un seul capteur. Avant l’expérience, galvanisez les électrodes avec de l’or pour atteindre des impédances de l’ordre de 200 à 300 kilos.

Utilisez une sonde en silicium à 16 canaux pour l’enregistrement des neurones principaux. Sous le microscope. Positionnez l’électrode près de la surface d’un lobe d’antenne et insérée doucement dans le tissu à l’aide d’un manipulateur manuel microm dans un site d’enregistrement idéal, les signaux extracellulaires seront captés par plusieurs canaux d’enregistrement et auront un rapport signal/bruit élevé.

Pour les enregistrements de cellules Kenyon, un fil torsadé sur mesure est utilisé pour galvanoplastie selon les procédures de galvanoplastie. La sonde en silicium place ensuite le tero à la surface du corps du champignon. Étant donné que les Samara des cellules kenyanes sont limitées à la couche superficielle de cette région, les enregistrements des neurones principaux et des cellules kenyanes peuvent être effectués simultanément à partir de la même préparation de criquet.

Après avoir identifié l’emplacement d’enregistrement, attendez au moins 15 minutes pour permettre la stabilisation des électrodes. Acquérez ensuite le signal extracellulaire à 15 kilohertz. Filtrez-le entre 0,3 et six kilohertz et amplifiez-le à l’aide d’un amplificateur AC 16 canaux, à la fois spontané et stimulus évoqué.

Une activité neuronale multi-unités des neurones de projection dans le lobe de l’antenne peut être observée. Traces de tension extracellulaire brutes montrant les réponses d’un neurone récepteur olfactif à deux odeurs différentes. Deux éthanols octals et un éthanol H sont présentés ici.

Une trace extracellulaire représentative de l’enregistrement d’un lobe d’antenne à plusieurs unités est présentée ici. Les potentiels d’action ou les pics d’amplitudes variables provenant de différents neurones principaux peuvent être observés dans cette piste de tension. Notez qu’une impulsion d’odeur de quatre secondes a été appliquée pendant la période indiquée par la boîte grise.

Un exemple d’enregistrement extracellulaire du corps d’un champignon est présenté ici. Contrairement aux neurones récepteurs olfactifs et aux neurones principaux, les cellules de Kenyon dans le corps du champignon insecte ont une activité de base plus faible et réagissent aux odeurs de manière clairsemée et sélective. Pour isoler les réponses unitaires de ces enregistrements multi-unités, nous effectuons une procédure de tri des pointes à l’aide d’un logiciel publié et hors ligne.

Des exemples de tri des neurones principaux et des pointes de cellules kenyanes sont présentés ici Après avoir regardé cette vidéo. Devrait avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des enregistrements multiunités extracellulaires pour caractériser l’activité neuronale d’ensemble dans les trois premiers centres olfactifs le long de la voie olfactive insérée.