Génération de rats transgéniques par voie topique In utero L'électroporation et In vivo Bioluminescence dépistage

L’objectif global de cette procédure est de sélectionner avec succès des enveloppes électroporées in utero pour une analyse plus approfondie. Ceci est accompli en injectant d’abord l’ADN cible, puis en effectuant une électroporation in utero pour la zone sélectionnée dans le cerveau. Les embryons électroporés se développent dans l’utérus de la mère et naissent normalement vivants.

L’imagerie 2D est utilisée pour identifier avec succès les animaux électroporés à des moments postnatals définis. Enfin, la zone ciblée est caractérisée plus en détail par imagerie 3D. En fin de compte, ces rats transgéniques topiques peuvent être utilisés dans des tests comportementaux pour montrer les conséquences d’un développement neurologique perturbé sur le comportement adulte.

Bien que l’électroporation soit une technique établie, elle n’a pas été largement utilisée pour la génération d’animaux adultes transgéniques topiques. Cela est dû en partie aux compétences techniques requises, mais aussi à notre incapacité actuelle à sélectionner uniquement les nouveau-nés électroporés réussis. Nous présentons une solution à ce problème en utilisant l’imagerie de bioluminescence in vivo en direct pour permettre une imagerie réussie de l’essence de bios in vivo d’un rat électrique neutre.

Les rayons de Lucifer ont rapporté que le gène est co-électroporé. La détection de luminescence peut être activée par injection luciférienne pour surveiller la position approximative des cellules nominales. Cela permet ensuite de sélectionner avec succès des pops rouges électroporés.

Pour commencer, rassemblez le matériel stérile nécessaire à l’électroporation in utero. Ensuite, préparez la solution d’ADN qui contient le vecteur cible D-N-A-G-F-P, le vecteur luciférase et le colorant vert rapide. Sous anesthésie au fluor ISO, exposez l’utérus pour visualiser l’embryon à injecter.

À l’aide d’une fine aiguille de verre, injectez la solution d’ADN dans l’un des ventricules latéraux de l’embryon. Pour atteindre une population cellulaire de couches corticales supérieures, placez une électrode de sept millimètres autour de la tête de l’embryon et placez l’électrode positive au-dessus du ventricule avec une légère tendance latérale dorsale. Effectuez l’électroporation avec une électroporation à ondes carrées en appuyant sur la pédale pour cibler les cellules de l’hippocampe.

Placez l’électrode positive du côté opposé du ventricule injecté. Avant l’électroporation, diluez d’abord le sel de sodium Lucifer dans du PBS à une concentration de 10 milligrammes par millilitre et stérilisez par filtration stérile. Après avoir pesé, tenez un chiot avec l’abdomen vers le haut et légèrement étiré avant d’injecter le Lucifer pour commencer la procédure d’imagerie.

Les chiots injectés par Lucifer sont anesthésiés et placés en position couchée dans le dispositif du spectre Ivis. Les premières images de bioluminescence 2D sont nécessaires pour déterminer quels petits ont été électroporés avec succès en travaillant dans le panneau de contrôle d’acquisition Ivis, sélectionnez le mode d’imagerie bioluminescente pour prendre des photos aériennes au début de la mesure. Vérifiez le réglage de la photo et réglez le binning sur moyen et le F-stop sur huit, sélectionnez Utiliser la hauteur du sujet sous le réglage de la mise au point.

Ensuite, réglez le filtre d’excitation pour bloquer, le filtre d’émission à ouvrir et le binning à moyen. Le F-stop doit être réglé sur un et le niveau de la scène ou le champ de vision est réglé sur une image 2D. Avec un temps d’exposition à la luminescence de 180 secondes, les zones électroporées des petits positifs sont ensuite étudiées plus en détail en prenant des images 3D suivant les paramètres de luciférase des lucioles.

Tout d’abord, vérifiez que l’option Photographie est sélectionnée pour acquérir une photo aérienne au début de l’imagerie. Pour scanner la surface de l’animal avant la mesure de la bioluminescence, sélectionnez l’option de structure pour les petits jusqu’à l’âge de deux semaines. Les filtres d’émission et les temps d’exposition suivants sont sélectionnés en raison de la diminution de l’intensité du signal chez les animaux plus âgés, le temps d’exposition est augmenté pour les trois meilleurs filtres d’émission chez les rats âgés de plus de P 20.

Ensuite, réglez le niveau de la platine sur le benning à medium et le F stop sur un et acquérez l’image 3D. Après l’imagerie, marquez les rats avec des trous d’oreille distincts pour les différencier les uns des autres et les faire correspondre aux images d’imagerie en direct d’Ivis. Enfin, retirez l’animal sur une surface chauffée jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.

Les images 3D sont générées à l’aide du logiciel d’image vivante préinstallé sur le système Ivis spectrum. La première étape consiste à reconstituer la topographie de surface. Pour ce faire, recadrez une région d’intérêt et fixez le seuil entre 20 et 30 %Lancez la reconstruction 3D DLIT pour le tissu cérébral avec un seuil d’image de 10 % pour chaque réglage de longueur d’onde.

Pour créer des films 3D, sélectionnez le bouton Animer Dans la barre d’outils 3D, manipulez l’orientation et le zoom de l’image 3D comme vous le souhaitez. Ensuite, appuyez sur le bouton d’enregistrement pour suivre le passage d’une position ou d’une orientation à une autre. Dans ces exemples, P sept rats imagés après une injection luciférienne n’ont montré aucun signal de luminescence, un signal faible ou un signal de luminescence fort en fonction du succès de l’électroporation.

Ces images montrent une chronologie de mesures consécutives de bioluminescence chez le même rat, démontrant une longue fenêtre de détection. Ici, les images 2D montrent une électroporation réussie dans le cortex ou l’hippocampe. Les zones ciblées sont visualisées à l’aide de l’imagerie 3D chez les animaux électroporés corticalement et hippocampique.

Cette vidéo montre la zone électroporée réussie sous plusieurs angles. Dans cet exemple, les emplacements ciblés identifiés à partir de l’imagerie 2D et 3D chez l’animal vivant sont validés par bioluminescence et détection de la fluorescence épi GFP dans le cerveau disséqué. Cette image, prise à partir du même cerveau de rat électroporé avec succès, montre une vue détaillée des cellules exprimant la GFP à P 14 lorsqu’elle est effectuée correctement.

Cette méthode permet d’étudier les conséquences comportementales et neuropathologiques des défauts neurodéveloppementaux. Ne sélectionner que les rats électro-évalués avec succès réduit considérablement les coûts et les efforts. Le succès de cette technique nécessite de la pratique et a des taux de motilité et d’efficacité variables.

L’immunohistologie de l’électro GFP centrale est importante pour documenter la zone exacte de transfection à des résolutions anatomiques pour la correction post-hoc des résultats comportementaux.