In Vivo Imagerie biphotonique d'expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

Les changements moléculaires dépendants ressentis dans les neurones sont essentiels à la capacité du cerveau à s’adapter en réponse aux défis comportementaux. Une méthode d’imagerie in vivo à deux photons est décrite ici qui permet de suivre de tels changements moléculaires dans des neurones corticaux individuels à travers des rapporteurs génétiquement codés. L’un des gènes dépendants expérimentés bien établis est la protéine associée au cytosquelette régulée par l’activité ou arc.

La transcription de l’ARC est rapidement et fortement induite par l’intensification de l’activité neuronale Pour permettre l’examen de l’expression de l’arc dans les neurones vivants par deux photomicroscopies, nous utilisons une lignée de souris knockin dans laquelle un rapporteur GFP est placé sous le contrôle du promoteur de l’arc endogène. Ce protocole décrit les préparations chirurgicales et les procédures d’imagerie pour suivre les modèles d’expression de la GFP à arc dépendant dans les ensembles neuronaux de l’animal vivant. Tout d’abord, nous décrirons la préparation des animaux nécessaire à cette technique.

Un animal de GFP à arc subira une chirurgie de la fenêtre crânienne et se rétablira de la chirurgie pendant environ deux semaines. La qualité de la fenêtre crânienne est ensuite vérifiée et si les neurones peuvent être imagés à travers elle, l’animal est placé dans un environnement similaire jusqu’au début des expériences d’imagerie comportementale et à deux photons. Ces animaux sont ensuite imagés à plusieurs reprises par deux photomicroscopies.

Une fois que les paradigmes comportementaux souhaités ont été établis sur une période de plusieurs jours, nettoyez tous les outils dans un stérilisateur à billes chaudes. Avant la chirurgie aseptique, nettoyez le site de la chirurgie avec de l’éthanol à 70 % et posez des toiles de protection propres. Anesthésier l’animal avec une solution d’Everton à 1,2 % administrée à raison de 0,02 millilitres par gramme par voie intrapéritonéale.

Vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide de pincements de la queue ou des orteils pour assurer une sédation complète. Couvrez les yeux de l’animal avec une pommade ophtalmique stérile et injectez de la dexaméthasone 0,2 milligramme par kilogramme et du carprofène 5 milligrammes par kilogramme par voie sous-cutanée. Rasez les poils sur le crâne entre les oreilles et stérilisez la peau avec un gommage à la bétadine et trois écouvillons alternés d’éthanol à 70 %, montez l’animal dans une étape de chirurgie stéréotaxique avec des barres d’oreille avec un coussin chauffant de circulation d’eau sous l’animal réglé à 37 degrés.

Vérifiez régulièrement les niveaux d’anesthésie de l’animal et complétez la dose d’anesthésique initiale si nécessaire. Injectez 200 microlitres de marcaïne à 0,5 % sous la peau du cuir chevelu pour engourdir la zone, inciser la peau et retirer le lambeau cutané sur le crâne. Retirez le périoste et séchez la zone avec des cotons-tiges propres.

Utilisez une perceuse dentaire à grande vitesse avec une fraise de 0,5 millimètre pour tracer doucement un cercle de trois à cinq millimètres de diamètre sur la région du cerveau d’intérêt en fonction de vos besoins. Mouillez périodiquement le site de forage avec une solution saline stérile à 0,9 % et enlevez la poussière d’os avec des cotons-tiges propres. Si l’os saigne, utilisez de la mousse de gel pré-imbibée de solution saline stérile pour éponger le saignement et attendez qu’il s’arrête.

Lorsque la dernière couche osseuse est atteinte, soulevez et retirez l’îlot d’os à l’aide d’une pince à pointe fine. Vous pouvez rencontrer des attaches durales à l’étagère inférieure de l’os. Si votre fenêtre croise des points de suture osseuse, ceux-ci doivent être retirés doucement.

Lorsque le lambeau osseux est soulevé, roulez doucement de la mousse humide et gélifiée sur la dure-mère exposée pour nettoyer sa surface et attendez que tout saignement de dural cesse. Si votre région d’intérêt se trouve sous un endroit où la dure-mère est particulièrement épaisse, il peut être nécessaire d’enlever la dure-mère au-dessus. Si c’est le cas, séparez délicatement la dure-mère de la PIA ci-dessous à l’aide d’une pince très fine.

Faites une petite incision dans la dure-mère soulevée avec une autre paire de pinces fines. Saisissez ensuite les bords coupés et fendez doucement la dure-mère. La dure-mère est fine mais forte, alors faites attention à ne pas trancher le cerveau avec les bords intacts de la dure-mère.

Au fur et à mesure que vous travaillez en arrière et en vous éloignant de votre région d’intérêt, rincez généreusement la zone avec du LCR A stérile ou une solution saline stérile. Si le crâne environnant se courbe considérablement autour de la dure-mère ou de la pie-mère exposée, utilisez un adhésif à cellules rapides pour remplir les espaces qui n’entreraient pas en contact étroit avec la lamelle de la fenêtre dans les régions qui ne seront pas imagées. Posez ensuite un couvercle en verre stérile glissez doucement sur la dure-mère ou la pie.

Utilisez du gel acrylique Sano pour couvrir l’adhésif élastomère et les bords du verre. Couvre-slip. Couvrez tout le crâne exposé avec du gel cyanoacrylate Sano ou un mélange de colle et de ciment dentaire.

Intégrez une barre de fixation de tête en métal sur mesure à l’extrémité opposée du crâne. Retournez l’animal dans une chambre de récupération chaude après une injection intrapéritonéale de kétoprofène cinq milligrammes par kilogramme pour la gestion de la douleur. Continuez l’analgésique pendant deux jours après l’opération.

Après deux semaines de récupération postopératoire, anesthésier l’animal avec du fluor ISO. 5 % pour l’induction, 1,5 % pour l’entretien. Montez-le dans une platine de microscope sur mesure avec un cadre de fixation de la tête et vérifiez la clarté optique de la fenêtre crânienne.

Sous éclairage avec une lumière bleue, la clarté des vaisseaux sanguins de la surface du cerveau est très indicative de la qualité de la fenêtre crânienne. Si leurs bords sont bien définis, la fenêtre est susceptible d’être utilisable. Avant de commencer un protocole comportemental, l’animal doit être gardé dans un environnement de cage domestique cohérent afin de minimiser les variations quotidiennes.

Dans l’arc de base, les niveaux d’expression de la GFP commencent l’entraînement comportemental ou les paradigmes de stimulation environnementale en fonction de la région cérébrale d’intérêt. Par exemple, les animaux peuvent être exposés à différents environnements visuels pendant des jours consécutifs pour imager des populations distinctes de neurones dans l’arc du cortex visuel, la fluorescence de la GFP dans les neurones atteint généralement son niveau maximal deux heures après la stimulation. La chronologie expérimentale peut être optimisée pour faciliter la détection de l’expression de l’ARC GFP dans les neurones à leurs niveaux de fluorescence maximaux.

Une fois une séance d’entraînement comportemental ou une stimulation environnementale terminée, anesthésez l’animal avec du fluor ISO 5 % pour l’induction, 1,5 % pour l’entretien. Montez l’animal dans la platine de microscope sur mesure avec cadre de fixation de la tête. Sous le microscope à deux photons, la position de la tête de l’animal est fixée au cadre de fixation de la tête qui se connecte directement à la platine à l’aide de la barre métallique implantée sur le crâne.

Le fluor ISO et l’oxygène sont fournis en permanence à la souris par un cône nasal. La température corporelle est maintenue à l’aide d’un coussin chauffant. Assurez-vous que les détecteurs de microscope sont protégés de la lumière ambiante.

En effectuant un balayage laser à deux photons dans une pièce sombre, utilisez une lentille d’immersion dans l’eau à ouverture numérique 20 x ou 25 x 1,05 pour l’imagerie. Tout d’abord, sous un éclairage par épifluorescence, acquérez une image des motifs des vaisseaux sanguins de surface sur la région cérébrale d’intérêt avec une caméra CCD. Pour l’alignement futur de l’image, démarrez le balayage laser à deux photons pour acquérir une pile d’images 3D.

La longueur d’onde d’excitation du laser à deux photons est fixée à 920 nanomètres et la puissance est fixée à environ 50. La fluorescence émise en milliwatts est détectée simultanément dans un arc de canal vert et un arc de canal rouge. La fluorescence GFP n’apparaît que dans le canal vert, tandis que l’autofluorescence tissulaire apparaît dans les deux canaux.

Les piles d’images typiques ont des dimensions d’environ 320 par 300, 20 par 100 micromètres, une résolution horizontale de 0,5 micromètre par pixel et une résolution verticale de trois micromètres par pixel. Après avoir acquis la pile d’images, retournez l’animal dans sa cage d’origine. Ne dérangez pas l’animal jusqu’à la prochaine séance de comportement et d’imagerie.

Répétez la procédure de comportement et d’imagerie pendant plusieurs jours comme vous le souhaitez. Utilisez l’image précédemment acquise de la surface du cerveau pour vous orienter vers le même emplacement d’imagerie. La force de cette technique est qu’elle permet d’examiner les changements d’expression génique dans le même ensemble de neurones sur plusieurs jours.

Dans l’animal vivant. Les méthodes histochimiques standard permettent d’obtenir une résolution unicellulaire, mais ne peuvent pas suivre les changements d’expression génique dans les mêmes neurones sur plusieurs jours. D’autres techniques d’imagerie, telles que la résonance magnétique ou les méthodes d’imagerie nucléaire, n’ont pas la résolution nécessaire pour imager des neurones individuels.

En tant que tel, aucune autre méthode existante pour mesurer les changements d’expression génique ne peut égaler à la fois la résolution spatiale et la couverture temporelle de la méthode d’imagerie décrite ici. Une étape critique de cette procédure est la chirurgie de la fenêtre crânienne. Il doit être effectué avec un soin particulier pour éviter de traumatiser le cerveau ou de laisser du sang sous la lamelle de verre.

La dure-mère peut être retirée si nécessaire. Gardez à l’esprit que la profondeur d’imagerie maximale dans le cerveau à l’aide de cette procédure dépendra de la clarté de la fenêtre crânienne, de la configuration du microscope et de la luminosité des rapporteurs fluorescents. Ce protocole d’imagerie in vivo est une méthode efficace et polyvalente pour obtenir des informations sur la dynamique moléculaire liée à la neuroplasticité dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales, et est susceptible d’être généralement applicable aux souris transgéniques portant des rapporteurs fluorescents pour d’autres gènes régulés expérimentés.