Name: In Vivo Imagerie biphotonique dexpérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Découvrez l'imagerie biphotonique in vivo pour suivre les changements moléculaires dépendants de l'expérience dans les neurones corticaux individuels. Cette méthode utilise des souris knockin avec un rapporteur GFP sous le promoteur arc.

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Les auteurs tiennent à remercier L. Belluscio de matériel de tournage chirurgie, D. Kwon pour le tournage d&#39;assistance, K. Liu pour le montage vidéo assistance, et K. MacLeod pour toute la musique de fond. KW reconnaît le soutien généreux de la Division des programmes de recherche NIMH intra-muros et les gènes, Cognition et Psychosis Program. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros NIMH (VC, YY, SMKW) et la Division NIAAA du programme de recherche intra-muros clinique et biologique (VC, RMC, DML).

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par l&#39;Institut national de la santé mentale et des animaux comité sur l&#39;utilisation et sont conformes aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparation pré-opératoire <ol><li> Nettoyer tous les outils dans un stérilisateur à billes à chaud avant la chirurgie aseptique, nettoyer le site de la chirurgie avec de l&#39;éthanol à 70%, et posa toiles propres. Porter des gants stériles. Anesthésier l&#39;animal avec une solution fraîchement préparée avertin 1,2%, donnée à 0,02 ml / g, intrapéritonéale. En variante, l&#39;isoflurane avec du gaz anesthésier à travers un cône de nez, 5% pour l&#39;induction, 1,5% pour la maintenance, avec un circuit accepteur passive. Vérifier le niveau d&#39;anesthésie utilisant pincées de queue ou de l&#39;orteil pour assurer une sédation complète. </li><li> Couvrir les yeux de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique stérile et injecter la dexaméthasone fraîchement préparée (0,2 mg / kg) et le carprofène (5 mg / kg) subcutaneously pour prévenir l&#39;enflure et l&#39;inflammation du cerveau 11. Se raser les cheveux sur le crâne entre les oreilles, et stériliser la peau avec gommage bétadine et trois tampons en alternance de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Montez l&#39;animal à un stade chirurgie stéréotaxique avec earbars, avec un coussin chauffant à circulation d&#39;eau ci-dessous l&#39;ensemble des animaux à 37 ° C. Vérifiez régulièrement les niveaux d&#39;anesthésie de l&#39;animal, et compléter la dose initiale anesthésie si nécessaire. </li><li> Injecter 200 pi de Marcaïne 0,5% sous la peau du cuir chevelu pour engourdir la région. Inciser la peau et retirer le lambeau de peau sur le crâne. Retirez le périoste et sécher la zone avec des cotons-tiges propres. </li></ol> 2. Chronique chirurgie crânienne fenêtre <ol><li> Utiliser une perceuse à grande vitesse dentaire avec une fraise de 0,5 mm à décrire un cercle délicatement 3-5 mm de diamètre sur la région du cerveau d&#39;intérêt. Périodiquement, mouiller avec le site de forage stérile poussière d&#39;os saline à 0,9% et claire loin avec des cotons-tiges propres. Si les saignements osseux, utilisez gelfoam préalablement trempés avec une solution saline stérile pour effacer la purge et attendre que ça s&#39;arrête. </li><li> Lorsque la couche d&#39;os dernière est atteinte, soulever et retirer l&#39;île os avec pointe fine pince. Dura pièces jointes à l&#39;étagère inférieure de l&#39;os peut se produire si la fenêtre traverse une suture osseuse. Ceux-ci devraient être éliminées en douceur comme le volet osseux est levée. </li><li> Rouleau mousse de gel humide doucement sur ​​la dure-mère exposée à nettoyer sa surface et attendre que le saignement dure-mère d&#39;arrêter étape critique:. Ne commencera pas avant que tout saignement s&#39;est arrêté dural. Sang qui se retrouve piégé à l&#39;intérieur de la fenêtre crânienne conduit généralement à une fenêtre opaque. </li><li> Si la région d&#39;intérêt est sous un emplacement où la durée est particulièrement épais, enlever la dure-mère ci-dessus, il peut être nécessaire. Si c&#39;est le cas, séparez doucement la durée de la pie-dessous avec des pinces très fines, faire une petite incision dans la levée dure-mère avec une autre paire de pinces fines, puis saisissez les bords coupés et doucementdiviser la dure-mère. La dure-mère est mince mais solide, donc soyez prudent de ne pas trancher le cerveau avec les bords intacts de la dure-mère. </li><li> Rincer la zone avec ACSF stérile ou une solution saline stérile. </li><li> Posez une lamelle de verre stérile (3-5 mm) au cours de la dure-mère ou pia étape critique:. Si les courbes du crâne entourant de manière significative, utilisez Kwiksil colle 12 pour remplir des espaces où la mère ou pia serait pas en contact étroit avec la lamelle dans les régions qui ne sera pas mis en image. </li><li> Utiliser un gel cyanoacrylate à couvrir l&#39;adhésif élastomère et les bords de la lamelle couvre-objet en verre. Couvrir l&#39;ensemble du crâne exposé au gel cyanoacrylate, ou un mélange de ciment et de soins dentaires krazyglue étape critique:. Ne laissez pas n&#39;importe quel gel cyanoacrylate de toucher la surface du cerveau. </li><li> Intégrer un bar sur mesure en métal tête de fixation à l&#39;extrémité opposée du crâne. </li><li> Le réexpédier vers une chambre de récupération à chaud, après une injection intrapéritonéale de kétoprofène, 5 mg / kg, fogestion de la douleur r. Continuer l&#39;analgésique deux jours de plus après l&#39;opération. </li><li> Après deux semaines de récupération post-opératoire, anesthésie de l&#39;animal à l&#39;isoflurane (5% pour l&#39;induction, 1,5% pour la maintenance), le monter dans une platine de microscope sur mesure avec un châssis de tête de fixation et vérifiez la fenêtre crânienne pour plus de clarté optique sous illumination avec une lumière bleue. Surface des vaisseaux sanguins du cerveau clarté est très révélateur de la qualité de fenêtre crânienne. Si les bords des vaisseaux sanguins sont nettement définies, la fenêtre est susceptible d&#39;être utilisables. Le temps de deux semaines de récupération post-opératoire est recommandé de laisser suffisamment de temps pour que l&#39;animal récupérer de la chirurgie. Fenêtres crâniens généralement nettoyer et améliorer pendant ce temps, et restent optiquement transparent pendant des semaines à des mois supplémentaires avant que le regain du crâne ou un épaississement de la dure-mère dégrade la qualité de la fenêtre. </li></ol> 3. Protocole de comportement et à balayage laser microscopie à deux photons <ol><li> Les animaux atteints clair cranial fenêtres seront exposés à un stimulus environnemental ou soumis à une session de formation comportementale, puis imagée après au moment du maximum Arc-GFP expression. Avant de commencer un protocole de comportement, l&#39;animal doit être gardé dans un environnement cage cohérente afin de minimiser au jour le jour la variation des niveaux de référence d&#39;expression Arc-GFP. </li><li> Commencer la formation comportementale ou paradigmes de stimulation de l&#39;environnement, en fonction de la région cérébrale d&#39;intérêt. Par exemple, les animaux peuvent être exposés à différents environnements visuels sur des jours consécutifs, et imager chaque jour après la stimulation visuelle pour identifier les stimulus-réponse spécifique dans le cortex visuel 10. </li><li> Arc-fluorescence de la GFP dans les neurones atteint généralement son niveau maximum deux heures après la stimulation. Le calendrier expérimental peut être optimisée afin de faciliter la détection d&#39;Arc-GFP expression dans les neurones à leurs niveaux de fluorescence de pointe. </li><li> Après une session de formation comportementale ou environnementastimulation l est terminée, anesthésier l&#39;animal avec de l&#39;isoflurane (5% pour l&#39;induction, 1,5% pour la maintenance) et monter l&#39;animal dans la platine du microscope sur mesure avec tête de fixation cadre, sous le microscope à deux photons. </li><li> Position de la tête de l&#39;animal est fixé sur le cadre de tête de fixation qui se connecte directement à l&#39;étape, à l&#39;aide de la barre métallique implanté sur la boîte crânienne. L&#39;isoflurane et l&#39;oxygène sont fournis en continu à la souris par un cône de nez. La température du corps est maintenue à l&#39;aide d&#39;un coussin chauffant. </li><li> Assurez-vous que les détecteurs de microscope sont protégés de la lumière ambiante en effectuant balayage laser à deux photons dans une pièce sombre. Utilisez un objectif 20x ou 25x eau (1,05 ouverture numérique) d&#39;immersion pour l&#39;imagerie. Tout d&#39;abord, sous l&#39;épifluorescence illumination, acquérir une image de motifs de surface du vaisseau sanguin dans le cerveau de la région d&#39;intérêt avec une caméra CCD pour l&#39;alignement d&#39;image future. </li><li> Commencer à deux photons laser à balayage pour acquérir une pile d&#39;images 3-D. Un FV1000 OlympusMPE multi-photon microscope est utilisé dans notre configuration. La longueur d&#39;onde d&#39;excitation du laser à deux photons est réglé à 920 nm, et la puissance du laser émise à partir de l&#39;objectif est fixé à environ 50 mW. Fluorescence émise est simultanément détectée dans les canaux vert et rouge (miroir dichroïque à 570 nm, des filtres barrières à 495-540 nm et 570-625 nm), en utilisant un canal externe de deux systèmes de détection photomutiplier placé à proximité du spécimen. Arc-fluorescence de la GFP apparaît uniquement dans le canal vert, tandis que le tissu auto-fluorescence apparaît dans les deux canaux 13, 14. </li><li> Piles d&#39;images typiques ont des dimensions d&#39;environ 320x320x100 um (largeur x longueur x profondeur), une résolution horizontale de 0,5 um / pixel, et une résolution verticale de 3 um / pixel. </li><li> Après l&#39;acquisition de la pile d&#39;images, le retour de l&#39;animal à sa cage. Ne pas déranger l&#39;animal jusqu&#39;à la prochaine session de comportement et d&#39;imagerie. Répétez le comportement et la procédure d&#39;imagerie au fil des jours comme souhaitableed. Utilisez la surface préalablement acquis des vaisseaux sanguins du cerveau l&#39;image d&#39;orienter vers l&#39;emplacement d&#39;imagerie même. </li></ol>

<ol><li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li>
<li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li>
<li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li>
<li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li>
<li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+growth+factor+and+activity-regulated+gene%2C+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li>
<li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li>
<li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+Arc%2C+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Mice.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li>
<li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li>
<li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;imagerie in vivo méthode décrite ici permet l&#39;examen répété des changements d&#39;expression des gènes dans l&#39;arc les mêmes ensembles de neurones sur plusieurs jours chez l&#39;animal vivant. Il s&#39;agit d&#39;une méthode efficace et polyvalent pour obtenir des informations sur la plasticité neuronales liées à la dynamique moléculaire dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales. Standard des méthodes histochimiques comme l&#39;hybridation in situ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-photons microscope à balayage laser </td><td> Olympe </td><td> FV1000MPE </td><td> Imagerie </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Stade de la chirurgie stéréotaxique pour la souris </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> 20X 25X ou objectif immersion dans l&#39;eau </td><td> Olympe </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imagerie </td></tr><tr><td> La platine du microscope avec tête de fixation cadre </td><td> Sur mesure </td><td> N / A </td><td> Imagerie </td></tr><tr><td> Pinces fines </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11251-20 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Foret fraise dentaire </td><td> Outils Fine Science </td><td> 19007-05 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Imagerie </td></tr></tbody></table>

in vivo imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

La capacité du cerveau de changer en réponse à l&#39;expérience est essentielle pour le fonctionnement sain du cerveau et des anomalies dans ce processus contribue à une variété de troubles neurologiques 1,2. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les circuits du cerveau réagissent à l&#39;expérience d&#39;un animal nécessite la capacité de surveiller les changements vécus par dépendantes moléculaires dans un ensemble donné de neurones, sur une période de temps prolongée, chez l&#39;animal vivant. Bien que l&#39;expérience et l&#39;activité neuronale associée est connu pour déclencher des changements d&#39;expression des gènes dans les neurones 1,2, la plupart des méthodes pour détecter ces changements ne permettent pas l&#39;observation répétée des mêmes neurones sur plusieurs jours ou qui n&#39;ont pas une résolution suffisante pour observer les neurones individuels 3 , 4. Nous décrivons ici une méthode qui combine in vivo microscopie à deux photons avec un journaliste codées génétiquement fluorescent pour suivre l&#39;expérience dépendant de changements d&#39;expression génétique dans les différents neurones corticaux au cours de la<html> cours de la journée-à-jour l&#39;expérience. L&#39;une des expériences bien établies qui dépendent gènes est régulée l&#39;activité protéine du cytosquelette associée (Arc) 5,6. La transcription d&#39;Arc est rapidement et fortement induite par l&#39;intensification de l&#39;activité neuronale 3, et son produit protéique régule l&#39;endocytose des récepteurs au glutamate et à long terme de plasticité synaptique 7. L&#39;expression d&#39;Arc a été largement utilisé comme un marqueur moléculaire pour cartographier les circuits neuronaux impliqués dans les comportements spécifiques 3. Dans la plupart de ces études, l&#39;expression Arc a été détecté par hybridation in situ ou immunohistochimie dans des coupes de cerveau fixes. Bien que ces méthodes ont révélé que l&#39;expression d&#39;Arc a été localisé à un sous-ensemble de neurones excitateurs après l&#39;expérience du comportement, la façon dont les modèles cellulaires d&#39;expression Arc pourrait changer avec de multiples épisodes d&#39;expériences répétées sur plusieurs jours ou distinctif n&#39;a pas été étudiée. ntent &quot;&gt; In vivo microscopie à deux photons offre un moyen puissant d&#39;examiner l&#39;expérience qui dépendent des changements cellulaires dans le cerveau 8,9 vivre. Afin de permettre l&#39;examen de l&#39;expression Arc de neurones vivants par microscopie à deux photons, nous avons déjà généré un knock- en ligne de la souris dans lequel un rapporteur GFP est placé sous le contrôle du promoteur endogène d&#39;arc 10. Ce protocole décrit la préparation et procédures chirurgicales pour le suivi de l&#39;expérience d&#39;imagerie dépendant de profils d&#39;expression Arc-GFP dans des ensembles de neurones chez l&#39;animal vivant. Dans ce procédé , chroniques fenêtres crâniennes ont d&#39;abord été implanté à Arc-GFP souris sur les régions corticales d&#39;intérêt. Ces animaux ont ensuite été reprises imagée par microscopie à deux photons après souhaités paradigmes comportementaux au cours de plusieurs jours. Cette méthode peut être applicable aux animaux porteurs d&#39;autres reporters fluorescents d&#39;expérience dépendant de changements moléculaires 4.

<html> Ce protocole décrit une méthode pour suivre l&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les différents neurones corticaux dans les animaux vivants. Une fenêtre crânienne chronique est d&#39;abord créé sur une région corticale d&#39;intérêt dans une souris portant un rapporteur fluorescent de l&#39;expression génique. Microscopie à deux photons peut ensuite être couplé avec divers paradigmes comportementaux pour observer comportemental induit des changements moléculaires dans les neurones indiv...

Expérience dépendant des changements moléculaires dans les neurones sont essentiels pour la capacité du cerveau à s&#39;adapter en réponse à des problèmes de comportement. Un<em&gt; In vivo</emMéthode d&#39;imagerie&gt; à deux photons est décrit ici, qui permet le suivi de ces changements moléculaires dans les différents neurones corticaux par les journalistes génétiquement codés.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Les changements moléculaires dépendants ressentis dans les neurones sont essentiels à la capacité du cerveau à s’adapter en réponse aux défis comportementaux. Une méthode d’imagerie in vivo à deux photons est décrite ici qui permet de suivre de tels changements moléculaires dans des neurones corticaux individuels à travers des rapporteurs génétiquement codés. L’un des gènes dépendants expérimentés bien établis est la protéine associée au cytosquelette régulée par l’activité ou arc.La transcription de l’ARC est rapidement et fortement induite par l’intensification de l’activité neuronale Pour permettre l’examen de l’expression de l’arc dans les neurones vivants par deux photomicroscopies, nous utilisons une lignée de souris knockin dans laquelle un rapporteur GFP est placé sous le contrôle du promoteur de l’arc endogène. Ce protocole décrit les préparations chirurgicales et les procédures d’imagerie pour suivre les modèles d’expression de la GFP à arc dépendant dans les ensembles neuronaux de l’animal vivant. Tout d’abord, nous décrirons la préparation des animaux nécessaire à cette technique.Un animal de GFP à arc subira une chirurgie de la fenêtre crânienne et se rétablira de la chirurgie pendant environ deux semaines. La qualité de la fenêtre crânienne est ensuite vérifiée et si les neurones peuvent être imagés à travers elle, l’animal est placé dans un environnement similaire jusqu’au début des expériences d’imagerie comportementale et à deux photons. Ces animaux sont ensuite imagés à plusieurs reprises par deux photomicroscopies.Une fois que les paradigmes comportementaux souhaités ont été établis sur une période de plusieurs jours, nettoyez tous les outils dans un stérilisateur à billes chaudes. Avant la chirurgie aseptique, nettoyez le site de la chirurgie avec de l’éthanol à 70 % et posez des toiles de protection propres. Anesthésier l’animal avec une solution d’Everton à 1,2 % administrée à raison de 0,02 millilitres par gramme par voie intrapéritonéale.Vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide de pincements de la queue ou des orteils pour assurer une sédation complète. Couvrez les yeux de l’animal avec une pommade ophtalmique stérile et injectez de la dexaméthasone 0,2 milligramme par kilogramme et du carprofène 5 milligrammes par kilogramme par voie sous-cutanée. Rasez les poils sur le crâne entre les oreilles et stérilisez la peau avec un gommage à la bétadine et trois écouvillons alternés d’éthanol à 70 %, montez l’animal dans une étape de chirurgie stéréotaxique avec des barres d’oreille avec un coussin chauffant de circulation d’eau sous l’animal réglé à 37 degrés.Vérifiez régulièrement les niveaux d’anesthésie de l’animal et complétez la dose d’anesthésique initiale si nécessaire. Injectez 200 microlitres de marcaïne à 0,5 % sous la peau du cuir chevelu pour engourdir la zone, inciser la peau et retirer le lambeau cutané sur le crâne. Retirez le périoste et séchez la zone avec des cotons-tiges propres.Utilisez une perceuse dentaire à grande vitesse avec une fraise de 0,5 millimètre pour tracer doucement un cercle de trois à cinq millimètres de diamètre sur la région du cerveau d’intérêt en fonction de vos besoins. Mouillez périodiquement le site de forage avec une solution saline stérile à 0,9 % et enlevez la poussière d’os avec des cotons-tiges propres. Si l’os saigne, utilisez de la mousse de gel pré-imbibée de solution saline stérile pour éponger le saignement et attendez qu’il s’arrête.Lorsque la dernière couche osseuse est atteinte, soulevez et retirez l’îlot d’os à l’aide d’une pince à pointe fine. Vous pouvez rencontrer des attaches durales à l’étagère inférieure de l’os. Si votre fenêtre croise des points de suture osseuse, ceux-ci doivent être retirés doucement.Lorsque le lambeau osseux est soulevé, roulez doucement de la mousse humide et gélifiée sur la dure-mère exposée pour nettoyer sa surface et attendez que tout saignement de dural cesse. Si votre région d’intérêt se trouve sous un endroit où la dure-mère est particulièrement épaisse, il peut être nécessaire d’enlever la dure-mère au-dessus. Si c’est le cas, séparez délicatement la dure-mère de la PIA ci-dessous à l’aide d’une pince très fine.Faites une petite incision dans la dure-mère soulevée avec une autre paire de pinces fines. Saisissez ensuite les bords coupés et fendez doucement la dure-mère. La dure-mère est fine mais forte, alors faites attention à ne pas trancher le cerveau avec les bords intacts de la dure-mère.Au fur et à mesure que vous travaillez en arrière et en vous éloignant de votre région d’intérêt, rincez généreusement la zone avec du LCR A stérile ou une solution saline stérile. Si le crâne environnant se courbe considérablement autour de la dure-mère ou de la pie-mère exposée, utilisez un adhésif à cellules rapides pour remplir les espaces qui n’entreraient pas en contact étroit avec la lamelle de la fenêtre dans les régions qui ne seront pas imagées. Posez ensuite un couvercle en verre stérile glissez doucement sur la dure-mère ou la pie.Utilisez du gel acrylique Sano pour couvrir l’adhésif élastomère et les bords du verre. Couvre-slip. Couvrez tout le crâne exposé avec du gel cyanoacrylate Sano ou un mélange de colle et de ciment dentaire.Intégrez une barre de fixation de tête en métal sur mesure à l’extrémité opposée du crâne. Retournez l’animal dans une chambre de récupération chaude après une injection intrapéritonéale de kétoprofène cinq milligrammes par kilogramme pour la gestion de la douleur. Continuez l’analgésique pendant deux jours après l’opération.Après deux semaines de récupération postopératoire, anesthésier l’animal avec du fluor ISO. 5 % pour l’induction, 1,5 % pour l’entretien. Montez-le dans une platine de microscope sur mesure avec un cadre de fixation de la tête et vérifiez la clarté optique de la fenêtre crânienne.Sous éclairage avec une lumière bleue, la clarté des vaisseaux sanguins de la surface du cerveau est très indicative de la qualité de la fenêtre crânienne. Si leurs bords sont bien définis, la fenêtre est susceptible d’être utilisable. Avant de commencer un protocole comportemental, l’animal doit être gardé dans un environnement de cage domestique cohérent afin de minimiser les variations quotidiennes.Dans l’arc de base, les niveaux d’expression de la GFP commencent l’entraînement comportemental ou les paradigmes de stimulation environnementale en fonction de la région cérébrale d’intérêt. Par exemple, les animaux peuvent être exposés à différents environnements visuels pendant des jours consécutifs pour imager des populations distinctes de neurones dans l’arc du cortex visuel, la fluorescence de la GFP dans les neurones atteint généralement son niveau maximal deux heures après la stimulation. La chronologie expérimentale peut être optimisée pour faciliter la détection de l’expression de l’ARC GFP dans les neurones à leurs niveaux de fluorescence maximaux.Une fois une séance d’entraînement comportemental ou une stimulation environnementale terminée, anesthésez l’animal avec du fluor ISO 5 % pour l’induction, 1,5 % pour l’entretien. Montez l’animal dans la platine de microscope sur mesure avec cadre de fixation de la tête. Sous le microscope à deux photons, la position de la tête de l’animal est fixée au cadre de fixation de la tête qui se connecte directement à la platine à l’aide de la barre métallique implantée sur le crâne.Le fluor ISO et l’oxygène sont fournis en permanence à la souris par un cône nasal. La température corporelle est maintenue à l’aide d’un coussin chauffant. Assurez-vous que les détecteurs de microscope sont protégés de la lumière ambiante.En effectuant un balayage laser à deux photons dans une pièce sombre, utilisez une lentille d’immersion dans l’eau à ouverture numérique 20 x ou 25 x 1,05 pour l’imagerie. Tout d’abord, sous un éclairage par épifluorescence, acquérez une image des motifs des vaisseaux sanguins de surface sur la région cérébrale d’intérêt avec une caméra CCD. Pour l’alignement futur de l’image, démarrez le balayage laser à deux photons pour acquérir une pile d’images 3D.La longueur d’onde d’excitation du laser à deux photons est fixée à 920 nanomètres et la puissance est fixée à environ 50. La fluorescence émise en milliwatts est détectée simultanément dans un arc de canal vert et un arc de canal rouge. La fluorescence GFP n’apparaît que dans le canal vert, tandis que l’autofluorescence tissulaire apparaît dans les deux canaux.Les piles d’images typiques ont des dimensions d’environ 320 par 300, 20 par 100 micromètres, une résolution horizontale de 0,5 micromètre par pixel et une résolution verticale de trois micromètres par pixel. Après avoir acquis la pile d’images, retournez l’animal dans sa cage d’origine. Ne dérangez pas l’animal jusqu’à la prochaine séance de comportement et d’imagerie.Répétez la procédure de comportement et d’imagerie pendant plusieurs jours comme vous le souhaitez. Utilisez l’image précédemment acquise de la surface du cerveau pour vous orienter vers le même emplacement d’imagerie. La force de cette technique est qu’elle permet d’examiner les changements d’expression génique dans le même ensemble de neurones sur plusieurs jours.Dans l’animal vivant. Les méthodes histochimiques standard permettent d’obtenir une résolution unicellulaire, mais ne peuvent pas suivre les changements d’expression génique dans les mêmes neurones sur plusieurs jours. D’autres techniques d’imagerie, telles que la résonance magnétique ou les méthodes d’imagerie nucléaire, n’ont pas la résolution nécessaire pour imager des neurones individuels.En tant que tel, aucune autre méthode existante pour mesurer les changements d’expression génique ne peut égaler à la fois la résolution spatiale et la couverture temporelle de la méthode d’imagerie décrite ici. Une étape critique de cette procédure est la chirurgie de la fenêtre crânienne. Il doit être effectué avec un soin particulier pour éviter de traumatiser le cerveau ou de laisser du sang sous la lamelle de verre.La dure-mère peut être retirée si nécessaire. Gardez à l’esprit que la profondeur d’imagerie maximale dans le cerveau à l’aide de cette procédure dépendra de la clarté de la fenêtre crânienne, de la configuration du microscope et de la luminosité des rapporteurs fluorescents. Ce protocole d’imagerie in vivo est une méthode efficace et polyvalente pour obtenir des informations sur la dynamique moléculaire liée à la neuroplasticité dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales, et est susceptible d’être généralement applicable aux souris transgéniques portant des rapporteurs fluorescents pour d’autres gènes régulés expérimentés.

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