Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

L’objectif général de cette procédure est d’isoler et d’immunocolorer les lymphocytes et les cellules dendritiques des patchs de payeurs de neurones, en utilisant deux approches expérimentales parallèles. Tout d’abord, exciser les timbres frais payeurs de la souris, de l’intestin grêle. Ensuite, dissociez physiquement les patchs du payeur, récoltez le tissu et passez-le à travers un filtre à mailles pour générer une suspension de cellule unique pour l’analyse par cytométrie en flux.

Récoltez les cellules par centrifugation et distribuez les aliquotes dans une plaque inférieure ronde de 96 puits. Ensuite, marquez les cellules avec des anticorps contre des marqueurs de surface spécifiques au type de cellule. Procéder immédiatement à l’analyse cytométrique en flux pour énumérer les types de cellules spécifiques En parallèle, isolez les patchs du payeur et congelez instantanément les échantillons de tissus.

Dans les blocs OCT, la cryosection, les échantillons sont marqués avec des anticorps contre des marqueurs de surface spécifiques au type de cellule, puis visualisés par microscopie laser à balayage confocal pris ensemble. Ces méthodes quantifieront les lymphocytes B, les lymphocytes T et les cellules dendritiques dans des compartiments spécifiques des tissus du patch du payeur. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les tissus du patch de PI sont extrêmement fragiles et peuvent être facilement endommagés.

Pendant la manipulation. Posez l’intestin grêle fraîchement isolé sur un lit d’essuie-tout humide ou de lingettes Kim. Ensuite, mouillez doucement l’intestin grêle avec une solution saline pour éviter la déshydratation des tissus.

Maintenant, identifiez visuellement les patchs individuels des payeurs situés du côté anti-mésentérique de l’intestin. En règle générale, une seule souris a cinq à 10 patchs payeurs visibles qui sont uniformément répartis du duodénum à l’iléon. L’utilisation de ciseaux chirurgicaux incurvés excise généralement les patchs du payeur individuel.

Placez-les dans la solution de tri équilibré de Hank froid, en maintenant le tissu à quatre degrés Celsius pour préserver la viabilité cellulaire. Ensuite, transférez les patchs du payeur dans cinq millilitres de milieu de dissociation de la rate et secouez à 250 tr/min pendant 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, pour générer une suspension unicellulaire, placez l’échantillon sur une passoire cellulaire stérile en nylon de 70 microns et broyez de force le tissu dans le maillage à l’aide de la base d’un piston d’une seringue d’un cc pour éliminer les agrégats cellulaires restants.

Décantez la suspension cellulaire à travers une deuxième cellule de 70 microns, passoire et collectez les cellules dans un tube conique de 15 ou 50 millilitres. Distribuez 10 à cinq cellules par puits dans des cellules de granulés à plaque à fond rond de 96 puits par centrifugation pendant cinq minutes à 1000 fois. G.Décanter ensuite le surnageant en inversant doucement la plaque.

Maintenant, mettez les cellules en suspension dans le tampon de bloc FC et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez des anticorps conjugués au fluor directement dans les suspensions cellulaires à la dilution souhaitée et incubez sur des cellules de lavage à glace avec 100 microlitres de tampon d’écoulement. Puis remettre les cellules en suspension dans 400 microlitres de tampon de fixation pour analyser les cellules par cytométrie en flux afin d’isoler les patchs payeurs pour la cryosection.

Coupez des segments transversaux de 0,5 centimètre de l’intestin grêle contenant un seul patch de payeur. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBS. Placez ensuite les segments de tissu intestinal verticalement à l’intérieur de moules de base contenant de l’OCT.

Immergez les moules dans de l’azote liquide et laissez les tissus geler complètement. Retirez les moules de base congelés de l’azote liquide à l’aide d’une pince. Laissez le moule se réchauffer à température ambiante juste assez longtemps pour que les bords du bloc OCT se ramollissent.

Retirez ensuite le bloc congelé d’OCT du moule. Retournez le moule et appuyez doucement sur l’arrière pour éjecter le bloc sur un morceau de papier d’aluminium propre de quatre centimètres sur quatre. Enveloppez immédiatement le tissu dans la feuille et placez-le dans un sac d’échantillon étiqueté stocké dans de l’azote liquide ou sur de la glace sèche, en cryo-sectionnant le tissu à l’aide d’un cryo-microtome LI a CM 3 0 5 0 s ou équivalent.

Réglez la température de la chambre sur le cryostat à moins 21 degrés Celsius. Idéalement couper des sections de 12 à 14 microns d’épaisseur. Collectez les coupes sur des lames de microscope en verre Supercross plus.

Inspectez visuellement les échantillons à l’aide d’un microscope à lumière standard de faible puissance. Plongez les lames dans de l’acétone pendant deux minutes. N’oubliez pas qu’une incubation prolongée peut provoquer le détachement des tissus de la lame.

Lavez les échantillons trois fois avec PBST. Encerclez ensuite les sections avec un stylo hydrophobe d’image. Maintenant, incubez les échantillons dans un tampon de bloc, superposez les sections de tissu avec une solution d’anticorps primaire.

Séchez la zone autour des sections à l’aide de lingettes Kim ou d’un autre mouchoir absorbant sans toucher les sections de tissu réelles. À l’aide d’une pipette ou d’un compte-gouttes, placez délicatement une goutte de support de montage en or prolongé directement sur la section. Appliquez une lamelle en verre, en évitant les bulles d’air et en atténuant tout excès de montage.

L’analyse par télécopieur moyen des suspensions monodispersées de cellules de patch pour les payeurs totaux révèle une distinction claire entre les bonnes et les mauvaises préparations cellulaires dans les bonnes préparations cellulaires. Avec une viabilité de plus de 80 %, la grande majorité des cellules présentent une diffusion vers l’avant élevée, ce qui indique un volume de cellule élevé et une faible diffusion latérale compatible avec une faible granularité des cellules. Dans cette expérience, une mauvaise préparation cellulaire a été délibérément préparée pour démontrer que dans une mauvaise population, la majorité des cellules présentent une FSC faible, une SSC élevée et sont en dehors de la marche R indiquée.

Ces cellules subissent probablement une apoptose et/ou une nécrose. Voici un cocktail de jusqu’à quatre Fluor différents. Quatre anticorps monoclonaux conjugués pour distinguer une variété de types de cellules.

Chez les payeurs, des suspensions de cellules uniques ont été utilisées avec un étiquetage avec un groupe de marqueurs de différenciation. Les CD 19 et B 20 révèlent que les lymphocytes B constituent environ 60 % des payeurs à clapet. Les sous-ensembles de lymphocytes T spécifiques à la population de cellules de patch peuvent être facilement dénombrés par double marquage avec des anticorps contre le CD trois et le CD quatre, ou le CD trois et le CD huit, le CD quatre positif et le CD huit positif Les lymphocytes T représentent respectivement environ 23 % et 9 % du total des cellules du patch payeur.

Les sous-ensembles de DC, ils seraient CD 11 C positif et CD 1 0 3 positif, peuvent également être énumérés par cette méthode. Les CD 11 C positifs contribuent à environ 8 % de la population totale fermée, ce qui équivaut à peu près à 10 000 dcs par patch payeur. Parmi la population de cellules C 11 C positives, environ 4,7 % étaient doublement positives pour B 22 positifs.

Des résultats similaires sont obtenus lorsque des cellules patchées par les payeurs sont collectées sur des souris C 57 black six. Une mauvaise préparation cellulaire peut conduire à des résultats très trompeurs, en grande partie parce que les cellules mortes ou mourantes ont tendance à se lier aux anticorps de manière non spécifique. Typiquement, ceux-ci conduisent à une surreprésentation de cellules B 2 2 0 positives et CD trois cellules positives doubles positives ainsi que de cellules B 20 positives B et de cellules T doubles positives C 20 positives.

Les sections cryogéniques de patchs de souris payeurs se prêtent à l’analyse histopathologique ainsi qu’au marquage immunitaire. Alors que la puissance des sections internes offre une plus grande résolution au niveau cellulaire lorsqu’elles sont colorées par h et e, les zones claires et sombres des centres germinaux des patchs des payeurs sont plus facilement délimitées dans les sections cryogéniques. Dans cette section cryogénique typique du patch des payeurs, trois anticorps anti-CD, marquent les lymphocytes T anti-anticorps CD 11 C.

Mettez en évidence les cellules dendritiques et les anticorps anti B deux 20. Mettez en évidence les lymphocytes B après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs sur le terrain de comprendre comment des types de cellules spécifiques, comme les cellules dendritiques dans les tissus lymphoïdes associés à l’intestin, réagissent aux antigènes intestinaux et aux agents pathogènes microbiens.

Cette information a influencé la conception et la mise au point d’un vaccin contre les muqueuses.