Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l'évaluation du résultat comportemental

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer les effets neurologiques et cognitifs de la surexpression des micro-ARN chez la souris. Ceci est réalisé en préparant un micro-ARN exprimant le lentivirus dans un deuxième temps. Le lentivirus est injecté dans une région spécifique du cerveau, ce qui permet au micro-ARN de surexprimer et d’effectuer une régulation sur ses cibles.

On obtient des résultats qui montrent les effets cognitifs de la surexpression des micro-ARN due à l’administration anatomiquement ciblée du lentivirus dans le cerveau de la souris. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le génie génétique, est que le génie génétique est une technique beaucoup plus laborieuse et chronophage que l’injection directe de lentivirus. De plus, l’injection de lentivirus permet un contrôle spatial et temporel complet et un suivi de la molécule en surexpression.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du miroir neuronologique, telles que quel serait l’effet d’une sur-expression ou d’une sous-expression d’un miroir spécifique sur l’apprentissage et la mémoire tels qu’évalués par des tests comportementaux, Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies neurodégénératives car les microARN se prêtent à des interventions thérapeutiques. Incuber les cellules d’emballage en plaques jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence, puis transfectez-les en premier, changez leur milieu pour qu’il n’y ait plus de sérum. DMEM complété par un millimolaire de glutamine et 50 milligrammes par millilitre.

La pénicilline, la streptomycine puis le transfect de coté des cellules avec le plasmide du vecteur pur A-P-L-K-O 0.1 codant pour les fractions delta, R, 8.2 et VSVG et le plasmide avec le micro-ARN d’intérêt. Utiliser 10 microlitres d’un milligramme par mil, polyétaline comme support à 24 heures et 48 heures. Après la transfection, collectez les lentivirus emballés et filtrez-les à travers un filtre de 0,45 micromètre.

Concentrez le filtrat avec des lentivirus dans une ultracentrifugation à 15 degrés Celsius et 70 000 G pendant deux heures. Jetez le surnageant et nous suspendons le lentivirus dans juste assez d’eau distillée désionisée nécessaire pour dissoudre complètement la pastille afin qu’il n’y ait pas d’amas visibles. Faites ensuite des aliquotes du concentré à conserver à moins 70 degrés Celsius.

Ensuite, mesurez le virus plus étroitement infecter les cellules d’emballage avec du virus dilué en série. Dans une plaque de 12 puits d’un millilitre de vecteur à un millionième de millilitre de vecteur par puits. Le titre résultant doit être d’au moins 1 milliard de particules infectieuses par millilitre.

Pesez l’animal et anesthésiez-le avec une injection IP d’un mélange de kétamine. Utilisez le volume proportionnel au poids de l’animal, tel qu’il est spécifié pour chaque médicament. Attendez que l’animal soit complètement anesthésié.

Vérifiez ensuite s’il n’y a pas de réflexe de retrait dans le membre postérieur lorsqu’il n’y a pas de réflexe. Injectez à l’animal par voie sous-cutanée l’analgésique IL comme indiqué sur la boîte. Placez l’animal sous une lampe chauffante ou sur un coussin chauffant et humidifiez ses yeux avec de la pommade.

Enfin, rasez la zone entre les deux oreilles avec une machine à tailler et désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70 %. Placez l’animal à l’intérieur de la stéréo T et ajustez les tiges dans les crevasses, juste à l’intérieur des oreilles de l’animal. Ensuite, utilisez un scalpel pour faire une incision antérieure postérieure d’environ 1,5 centimètre entre les oreilles et maintenez l’incision ouverte avec des pinces chirurgicales.

Ensuite, nettoyez la surface du crâne avec un coton-tige jusqu’à ce que l’intersection entre la suture coronale et les sutures sagittales soit visible. Cela inclut le bgma et l’intersection entre les sutures coronaire et lambdoïde ou le lambda. Positionnez maintenant l’extrémité de la seringue tenue dans le stéréotype sur le point bgma sur les trois axes vers le bas des coordonnées.

Ce sont les points zéro. Soulevez ensuite la seringue dans l’axe vertical afin qu’un mouvement de rabotage ne raye pas le crâne de la bgma. Déplacez la seringue à l’endroit requis par rapport à l’hippocampe, par exemple, vers le bas de deux millimètres dans l’axe AP, vers le haut et vers le bas de 1,8 millimètre dans l’axe LM et vers le bas de 1,5 millimètre dans l’axe DV.

Ensuite, abaissez l’extrémité de la seringue jusqu’à ce qu’elle touche le crâne. Marquez l’endroit, puis reculez la seringue pour faire de la place pour la perceuse à l’endroit. À l’aide d’une perceuse fine, faites un trou peu profond dans l’os du crâne.

Maintenez la perceuse stable et ne percez pas dans les tissus mous. Le forage en impulsions courtes peut aider pendant le forage. Assurez-vous d’étudier une main avec l’autre afin que le forage à travers l’os ne s’étende pas plus profondément dans les tissus mous.

Retrait d’un demi-millilitre de la solution concentrée de lentivirus dans la seringue. Placez la seringue au-dessus du trou et abaissez-la lentement verticalement jusqu’à ce qu’elle atteigne la surface du crâne. Continuez à abaisser la seringue dans le cerveau très lentement.

Réglez la pompe numérique sur 0,02 millilitre par minute pour injecter lentement le volume en 25 minutes. Cela permettra d’éviter le refoulement et d’assurer une propagation réussie. Commencez l’infusion dans certains types de seringues.

Envisagez d’insérer la seringue d’un demi-millimètre supplémentaire avant de revenir aux coordonnées d’origine et de commencer la perfusion pendant que la substance est perfusée. Mouillez la zone exposée avec du PBS pour éviter la déshydratation des tissus. Une fois terminé, attendez cinq minutes avant de retirer la seringue.

Cela permet au matériau de se propager dans le cerveau au lieu de se retirer dans le chemin de la seringue. Retirez ensuite la seringue très lentement et surveillez les reflux. Si un refoulement est observé, une fraction du matériau injecté a probablement été perdue.

Scellez la plaie avec histo acron en faisant attention de ne pas laisser histo acron s’infiltrer dans les yeux de l’animal. Ensuite, pour éviter que l’animal ne se déshydrate, injectez un millilitre de solution saline intrapéritonéale réchauffée. Placez l’animal dans une cage de récupération qui se trouve sur un coussin chauffant.

Observez l’animal pendant qu’il récupère pendant une heure après quatre à six semaines, évaluez la mémoire de navigation de l’animal comme dans le labyrinthe aquatique de Morris. Le lentivirus aura infecté la plupart des cellules ciblées. À ce moment-là, une injection de 0,5 microlitre de lentivirus dans le ca.

Une région de l’hippocampe d’une souris a été réalisée comme décrit dans le protocole. L’animal a ensuite été sacrifié et des tranches de 40 microns d’épaisseur de son cerveau ont été analysées. Pour l’expression de la GFP, la coloration DAPI est visible en rouge.

En résumé, cela a donné une sphère infectée d’environ un millimètre dans l’axe du dorlotement rostral et d’environ 0,5 millimètre dans les EA latéraux médiaux et antérieurs postérieurs. Des souris injectées avec un micro-ARN codant pour un vecteur lent ont été comparées à des témoins dans le labyrinthe aquatique de Morris. Après trois jours de formation, le chemin d’une souris témoin représentative vers la plate-forme immergée indiquée en vert était beaucoup plus court que celui d’un animal de laboratoire en rouge.

Dans l’ensemble, les animaux de laboratoire ont eu plus de difficulté à apprendre la tâche et les contrôles une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée en 40 minutes environ par souris. Le débit étant le seul facteur limitant suivant cette procédure.

D’autres méthodes, comme l’injection systématique d’oligonucléotides, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions telles que dans quelle mesure cette procédure modifie la communication entre le cerveau et le corps. N’oubliez pas que travailler avec des lentivirus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des blouses de laboratoire jetables et des gants neutres doivent être utilisées. De plus, la verrerie et la vaisselle en plastique contenant des déchets liquides doivent être décontaminées avant d’être éliminées dans un sac à risque biologique.